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1、(10)申请公布号 CN 103951738 A (43)申请公布日 2014.07.30 CN 103951738 A (21)申请号 201410163413.1 (22)申请日 2014.04.18 C07K 14/405(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (71)申请人 哈尔滨工业大学 地址 150080 黑龙江省哈尔滨市南岗区西大 直街 92 号 (72)发明人 赵丽 蔡伟民 彭一良 (54) 发明名称 一种高效萃取藻红蛋白的双水相法 (57) 摘要 本发明公开了一种高效萃取藻红蛋白的双水 相法， 1)双水相相图的绘制。 2)选择双相点， 预实 验。3) 比较不。
2、同盐体系的提取纯度， 选择合适的 PEG/盐体系。 4)双水相体系不同参数对纯度的影 响 ： 比较 PEG 不同分子质量、 不同系线长、 不同的 体积比、 不同 pH 值等。5) 多次双水相实验， 选择 最优次数。该方法简化蛋白质提纯过程， 大规模、 易操作、 成本低、 得率高， 高效环保。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103951738 A CN 103951738 A 1/1 页 2 1. 一种高效萃取藻红蛋白的双水相法，。
3、 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1) 双水相相图的绘制 ； 2) 选择双相点， 预实验 ； 3) 比较不同盐体系的提取纯度， 选择合适的 PEG/ 盐体系 ； 4) 比较 PEG 不同分子质量对提取纯度的影响 ； 5) 比较不同系线长对提取纯度的影响 ； 6) 比较不同的体积比对提取纯度的影响 ； 7) 比较不同 pH 值对提取纯度的影响 ； 8) 多次双水相实验， 选择最优次数。 2. 根据权利要求 1 所述的高效萃取藻红蛋白的双水相法， 其特征在于， 所述 PEG/ 盐体 系为 PEG/ 酒石酸钾钠系统， 多次双水相实验中， 一次双水相参数 ： PEG1500、 系线长 22.5， 体积。
4、比 0.33， pH 值 8.0， 藻红蛋白的粗提液纯度 0.43， 一次双水相后纯度提高到 1.03， 纯化 因子 2.4， 二次双水相纯度 1.31， 纯化因子 3.05。 权 利 要 求 书 CN 103951738 A 2 1/2 页 3 一种高效萃取藻红蛋白的双水相法 技术领域 0001 本发明属于蛋白质提取纯化技术领域， 涉及一种高效萃取藻红蛋白的双水相法。 背景技术 0002 藻红蛋白的获得主要是通过从藻类中提取， 包括藻种选育和大规模选育、 培养、 收 集藻体， 破碎藻体细胞和蛋白质的生物分离等工艺。 而且， 蛋白纯化工艺的复杂、 成本高、 收 率低， 因而导致天然藻胆蛋白极高。
5、的市场价格， 每毫克藻胆蛋白高达50150美元。 目前应 用基因工程技术生产藻胆蛋白， 一般要经过藻胆蛋白的粗提， 然后进行多级色谱柱层析， 基 于不同分离原理的柱层析方法， 主要有吸附层析法、 离子交换层析法、 分子排阻层析法等。 各种方法常常结合使用优化组合才能获取纯度高的藻胆蛋白。虽然色谱层析纯度高， 但操 作步骤繁多、 产量少， 不适于实现大规模生产。探索一种大规模、 易操作、 成本低、 得率高的 藻胆蛋白提取工艺尤为重要。 0003 双水相体系以其分离条件温和， 质量传输快， 成本低， 易操作， 可调节等特点， 已经 在生物化学、 细胞生物学、 生物化工等物质分离提纯方面得到了广泛的。
6、应用， 而且技术已相 当成熟。 但由于双水相的原料聚乙二醇和葡萄糖成本太高， 目前真正工业化的例子还很少， 所以开发廉价的双水相体系则成了双水相萃取分离技术发展的方向。在近 20 年来， 双水相 萃取技术已应用于藻胆蛋白的分离。 然而， 在分离纯化的整个过程中， 双水相只是作为其中 的一部分， 还要通过与柱层析优化组合才能获取纯度高的藻胆蛋白。虽然在一定程度上简 化了纯化步骤， 但没有从根本上达到大规模、 易操作、 成本低、 得率高的要求。 0004 能形成双水相体系的物质有高聚物、 无机盐、 高分子电解质、 低分子化合物。大体 可以分为四大类。最常用的双水相体系是聚乙二醇 (PEG)/ 葡聚。
7、糖 (DEX)/ 水和 PEG/ 盐 / 水系统。前者一般用于小规模地分离生物大分子、 细胞、 膜等， 后者则主要用来大规模地提 纯酶。 聚乙二醇， 几乎无毒， 对皮肤无刺激诊性， 具有与各种溶剂广泛的相溶性、 良好的润滑 性、 热稳定性、 低毒性、 难挥发性、 和良好的色泽， 因而在工业上有着广泛的应用。PEG/ 盐 / 水体系的性能稳定， 主要成分成本较低， 无毒无害， 专一性高， 是最为常见的双水相体系。 0005 选用 PEG/ 盐 / 水体系， 多次萃取藻红蛋白， 并达到各级标准， 未见报道。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服上述技术存在的缺陷， 提供一种高效萃取藻红蛋白的双。
8、水 相法， 该方法简化蛋白质提纯过程， 大规模、 易操作、 成本低、 得率高， 高效环保。 0007 其具体技术方案为 ： 0008 一种高效萃取藻红蛋白的双水相法， 包括以下步骤 ： 0009 1) 双水相相图的绘制 ； 0010 2) 选择双相点， 预实验 ； 0011 3) 比较不同盐体系的提取纯度， 选择合适的 PEG/ 盐体系 ； 0012 4) 双水相体系不同参数对纯度的影响 ： 比较 PEG 不同分子质量、 不同系线长、 不同 说 明 书 CN 103951738 A 3 2/2 页 4 的体积比、 不同 pH 值等。 0013 5) 多次双水相实验， 选择最优次数。 0014 。
9、所述体系参数为 ： PEG/ 盐体系为 PEG/ 酒石酸钾钠系统， 一次双水相参数 ： 系线长 22.5， 体积比 0.33， pH 值 8.0， 纯度由 0.43 提高到 1.03， 纯化因子 2.4， 二次双水相纯度 1.31， 纯化因子 3.05。 0015 与现有技术相比， 本发明的有益效果为 ： 本发明双水相体系具有分离条件温和， 质 量传输快， 成本低， 易操作， 可调节等特点， 使其使其可能成为今后蛋白质分离的一种常用 手段。 附图说明 0016 图 1 是不同 PEG 和盐体系对藻红蛋白的纯度的影响 ； 0017 图 2 是不同 PEG 分子质量和不同系线长对纯度的影响 ； 0。
10、018 图 3 是不同体积比和不同系线长对纯度的影响。 具体实施方式 0019 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。 0020 图 1 中比较四种不同的盐 ： 磷酸钠、 磷酸钾、 酒石酸钾钠、 硫酸铵。在不同 PEG 分子 质量的比较中， 酒石酸钾钠的纯度都最高。 0021 图2中比较四种不同PEG分子质量 ： 1000、 1500、 2000、 4000。 PEG2000的纯度最高。 0022 图 3 中比较四种不同系线长和不同的体积比 ： 系线长 22.5， 体积比 0.33 的纯度 最高。 0023 获得最优参数， 建立高效的双水相体系。提取藻红蛋白。操作简单， 提取时间短， 无选择性， 不造成二次污染的特点， 使其可能成为今后蛋白质分离的一种常用手段。 说 明 书 CN 103951738 A 4 1/2 页 5 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103951738 A 5 2/2 页 6 图 3 说 明 书 附 图 CN 103951738 A 6 。