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1、(10)授权公告号 CN 101914630 B (45)授权公告日 2012.10.10 CN 101914630 B *CN101914630B* (21)申请号 201010275831.1 (22)申请日 2010.09.08 C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) G01N 21/33(2006.01) (73)专利权人 上海市农业科学院 地址 201106 上海市闵行区南华街 25 号 (72)发明人 曹晖 余昌霞 陈明杰 汪虹 (74)专利代理机构 上海泰能知识产权代理事务 所 31233 代理人 黄志达 谢文凯 路秀玲等 . 固态发酵中生物量。
2、的测定 方法 .天津轻工业学院学报 .2000,( 第 4 期 ),57-62. P. Morgan 等 .automated image analysis method to determine fungal biomass in soils and on solid matrices.soil biol. biochem .1999, 第 23 卷 ( 第 7 期 ),609-616. (54) 发明名称 通过检测 DNA 浓度测定基质中食用菌菌丝生 物量的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种通过检测 DNA 浓度测定基 质中食用菌菌丝生物量的方法， 包括 ： (1) 培养食 用菌纯菌丝 。
3、； (2) 过滤菌丝， 冲洗， 冷冻并充分干 燥 ； (3) 梯度称取菌丝， 提取 DNA， 构建关联标准曲 线 ； (4) 取相应基质， 提取 DNA， 确定基质 DNA 本底 水平 ； (5) 取菌丝与基质混合， 提取 DNA， 确定 DNA 量， 与步骤 (3) 和 (4) 的结果比较， 确定该种基质 对 DNA 提取的影响 ； (6) 取待测样品， 提取 DNA， 确 定 DNA 量， 对照标准曲线、 基质本底和基质影响， 确定含有基质的样品中食用菌菌丝的生物量。本 发明的方法简单， 耗时短， 高效、 准确， 一经检测系 统确定可对相应培养模式或生长环境中的食用菌 菌丝生物量进行长期、。
4、 稳定的监测。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 罗洋 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种通过检测 DNA 浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的方法， 包括下列步骤 ： （1） 培养标准菌丝 取待测食用菌斜面培养物， 活化后打碎， 接入新鲜的标准液体培养基中， 摇床培养至菌 丝稳定期 ； 所述的标准液体培养基为 PDB 培养基 ； （2） 菌丝处理 过滤上述菌丝， 无菌水冲洗， 冷冻并充分干燥 ； （3） 构建标准曲线 将步骤 。
5、（2）处理后的菌丝迅速研磨， 梯度称取后置于容器中， 用 CTAB 法提取 DNA， NANODROP 1000紫外分光光度计确定DNA量， 构建提取DNA量和提取用菌丝量的关联标准曲 线 ； （4） 相应基质 DNA 水平确定 取相应基质， 用 CTAB 法提取 DNA， NANODROP 1000 紫外分光光度计确定基质 DNA 本底水 平 ； （5） 培养菌丝与基质混合， 确定相应基质对 DNA 提取的影响 称取步骤 （2） 处理后的菌丝与上述基质混合， 用 CTAB 法提取 DNA， NANODROP 1000 紫外 分光光度计确定 DNA 量， 与步骤 （3） 和 （4） 的结果比较。
6、， 确定该种基质对 DNA 提取的影响 ； （6） 待测样品中食用菌菌丝生物量的确定 取待测样品， 充分干燥， 研磨， 定量秤取后用CTAB法提取DNA， NANODROP 1000紫外分光 光度计确定 DNA 量， 对照标准曲线、 基质本底和基质影响， 确定含有基质的样品中食用菌菌 丝的生物量。 2.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （1） 中的菌丝为香菇 135 菌丝。 3.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中的处理后的菌丝含水量接。
7、近零， 且 DNA 在冷冻的条件下 不易降解。 4.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 使用冷冻干燥机充分干燥。 5.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （3） 中用 CTAB 法提取 DNA， 每处理 5 个重复。 6.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （4） 中相应基质包括主料和辅料， 其中主料为木屑、 稻草、 棉籽 壳、 甘蔗渣、 玉米芯或麦秸， 辅料为麸皮、。
8、 米糠或豆饼。 7.根据权利要求1或6所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物 量的方法， 其特征在于 ： 所述的相应基质取木屑先浸泡 12-24h， 再与麸皮混合， 调整含水量 至 50%-60%， 灭菌， 然后冷冻至固态， 再充分干燥。 8.根据权利要求1所述的一种通过检测DNA浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的 方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （5） 中的菌丝与相应基质的质量比为 1 ： 4 或 3 ： 7。 权 利 要 求 书 CN 101914630 B 2 1/13 页 3 通过检测 DNA 浓度测定基质中食用菌菌丝生物量的方法 技术领域 0001 本发明属测定。
9、食用菌菌丝生物量的方法领域， 特别是涉及一种通过检测 DNA 浓度 测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的方法。 背景技术 0002 生物量是所有微生物生长状况的一项基本参数， 生物量的测定是确定微生物培养 过程的生长动力学和深入研究微生物代谢调控的基础。 由于多数微生物与其生长基质的混 合特性， 很难直接测定其生物量， 尤其在人工栽培的食用菌中菌丝深入培养基质内部， 无法 进行分离测定。 0003 现有的微生物生物量测定方法有四大类 ： (1) 直接从培养基中分离计数， 如浊度 法、 直接计数法等 ； (2) 通过检测代谢活动推断生物量， 如氧气和二氧化碳的代谢、 胞外漆 酶法等 ； (3) 测出。
10、生物体中某些特殊物质的含量推知其生物量， 如几丁质分析法、 麦角固醇 法、 嘌呤分析法、 氮和蛋白质等 ； (4) 利用与菌体生长有关的某些现象估测生物量。这些测 定方法都有各自的局限性， 如 (1) 要求纯培养状态， 其余的方法是对一定系统中的微生物 活动或特殊成分进行的估测， 不能排除系统中其它干扰基质对结果的影响， 因而不能准确 定量也无法得知估测的误差范围。本方法目的明确， 在构建待测种类真菌的 DNA 量和提取 用菌丝量的标准曲线和相应基质对提取过程中 DNA 影响的基础上， 采用直接测定含基质样 品的 DNA 量， 从而快速简便地得到单位质量待测样品中的食用菌菌丝生物量参数。 发明。
11、内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供一种通过检测 DNA 浓度测定栽培基质中食用 菌菌丝生物量的方法， 该方法简单， 耗时少， 能够快速， 准确的检测培养基质中食用菌菌丝 的生物量。 0005 本发明的一种通过检测 DNA 浓度测定栽培基质中食用菌菌丝生物量的方法， 包 括 ： 0006 (1) 培养标准菌丝 0007 取待测食用菌斜面培养物， 活化后打碎， 接入新鲜的标准液体培养基中， 摇床培养 至菌丝稳定期 ； 0008 (2) 菌丝处理 0009 过滤菌丝， 无菌水冲洗， 冷冻至固态， 充分干燥 ； 0010 (3) 构建标准曲线 0011 将步骤 (2) 处理后的菌丝迅速研磨。
12、， 梯度称取后置于容器中， 用 CTAB 法提取 DNA， NANODROP 1000紫外分光光度计确定DNA量， 构建提取DNA量和提取用菌丝量的关联标准曲 线 ； 0012 (4) 相应基质 DNA 水平确定 0013 取相应基质， 用 CTAB 法提取 DNA， NANODROP 1000 紫外分光光度计确定 DNA 量， 确 说 明 书 CN 101914630 B 3 2/13 页 4 定基质 DNA 本底水平 ； 0014 (5) 培养菌丝与基质混合， 确定相应基质对 DNA 提取的影响 0015 称取步骤 (2) 处理后的菌丝与上述基质混合， 用 CTAB 法提取 DNA， NA。
13、NODROP1000 紫外分光光度计确定 DNA 量， 与 (3) 和 (4) 的结果比较， 确定该种基质对 DNA 提取的影响 ； 0016 (6) 待测样品中食用菌菌丝生物量的确定 0017 取样品 ( 该食用菌在基质中的培养物 ) 冷冻干燥， 研磨， 定量秤取于容器中， 用 CTAB 法提取 DNA， NANODROP 1000 紫外分光光度计确定 DNA 量， 对照标准曲线、 基质本底和 基质影响率， 确定培养基质中的食用菌菌丝的生物量。 0018 所述步骤 (1) 中的菌丝为香菇 135 菌丝。 0019 所述步骤 (1) 中， 待测食用菌标准菌丝的获得， 取人工栽培的食用菌斜面菌种。
14、， 活 化后转接在新鲜的标准液体培养基中 ( 根据情况选用商业化生产的 PDB 培养基， 高氏培养 基， 查氏培养基等成分稳定， 重复性好的标准液体培养基 )， 摇床培养至菌丝稳定期。 0020 所述步骤 (1) 中的标准液体培养基为 PDB 培养基。 0021 所述步骤(2)中的处理后的菌丝含水量接近零， 且DNA在冷冻的条件下不易降解。 0022 所述步骤 (2) 使用冷冻干燥机充分干燥。 0023 所述步骤 (3) 中用 CTAB 法提取 DNA， 每处理 5 个重复。 0024 所述步骤 (3) 中构建标准曲线是样品测定的基准， 在 CTAB 法提取 DNA 和 NANODROP100。
15、0 紫外分光光度计确定 DNA 量的步骤中要设置重复和不同批次培养的菌丝间 的对照， 用以确定整个检测体系的误差范围。 0025 所述步骤 (4) 中， 人工栽培的食用菌都可以以不同的农作物废弃物按不同的配方 进行人工培养， 这些培养基质主要成分为主料 ( 木屑、 稻草、 棉籽壳、 甘蔗渣、 玉米芯、 麦秸 等 ) 和辅料 ( 麸皮、 米糠、 豆饼等 )， 有时还根据需要增加糖和无机盐等添加成分， 不同的原 料和配方可能导致培养基质的 DNA 本底差异， 这里需要在步骤 (4) 中确定与待测样品相同 配方的培养基质的 DNA 水平， 消除实际测量中由基质本底带来的影响。 0026 所述步骤 (。
16、4) 中的相应基质取木屑先浸泡 12-24h， 再与麸皮混合， 调整含水量至 50 -60， 灭菌， 然后冷冻至固态， 再充分干燥。 0027 所述步骤 (5) 中， 经过预实验确定标准培养菌丝与基质混合比例 ( 尽量接近待测 样品的数据 )， 确定基质对 DNA 提取的影响。 0028 所述步骤 (5) 中的菌丝与相应基质的质量比为 1 4 或 3 7。 0029 通过检测 DNA 浓度确定真菌菌丝生物量的方法可实现对不同基质中真菌菌丝生 物量的准确定量， 该方法所用时间短， 线性度高， 快速判断基质中真菌菌丝生物量的多少。 对特定种类真菌菌丝量和提取 DNA 量的标准曲线一经建立可重复使用。
17、， 而确定不同基质对 提取 DNA 的影响则使测定不同基质中特定种类真菌的菌丝生物量成为可能。 0030 本发明通过检测 DNA 浓度测定基质中真菌菌丝生物量的方法， 解决了生物量测定 不准确、 误差范围难以评估等问题， 该方法可以快速判断基质中真菌生物量的多少， 且用质 量单位 (mg) 准确表示。检测系统一经确定可对相应培养模式或生长环境中的真菌生物量 进行长期、 稳定的监测。 0031 有益效果 0032 (1) 本发明的方法简单， 在构建待测种类真菌的 DNA 量和提取用菌丝量的标准曲 说 明 书 CN 101914630 B 4 3/13 页 5 线和相应基质对提取过程中DNA影响的。
18、基础上， 采用直接测定含基质样品的DNA量， 从而快 速简便地得到单位质量待测样品的真菌生物量参数 ； 0033 (2) 本发明解决了生物量测定不准确、 误差范围难以评估等问题。 附图说明 0034 图 1 第一批次标准培养菌丝量与 DNA 量的关联曲线 ； 0035 图 2 第二批次标准培养菌丝量与 DNA 量的关联曲线 ； 0036 图 3 第三批次培养纯菌丝量与 DNA 量的关联曲线 ； 0037 图 4 不同批次纯培养菌丝与 DNA 含量关系。 具体实施方式 0038 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解。
19、， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0039 实施例 1 0040 本发明以确定木屑常规基质的香菇 135 菌丝培养物中香菇菌丝生物量为实施例 阐述具体步骤 ： 0041 (1) 用标准 PDB 液体培养基培养香菇 135 的标准菌丝 0042 将固体 PDA 培养基上的香菇 135 菌丝活化后， 用均质仪高低档间隔打碎 30S， 接入 含90mL新鲜标准液体PDB(美国BD公司生产)培养基的250mL三角瓶中， 转速120rpm， 25 下， 培养 14d 至菌丝稳定期。每隔一天培养一个。
20、批次菌丝， 每个批次培养 5 瓶， 共培养 3 个 批次， 以供构建标准曲线。 0043 (2) 菌丝处理 0044 用无纺布过滤菌丝， 无菌水冲洗后再用无菌吸水纸吸干多余水分， 于 -20冰箱冷 冻至固态， 转入冷冻干燥机 (Heto Power Dry PL3000) 中充分干燥。 0045 (3) 构建标准曲线 0046 冻干的菌丝在常温下迅速研磨， 梯度精确称取菌丝 (2mg、 3mg、 4mg、 5mg、 6mg、 7mg)， 并分装在 2mL 离心管中， CTAB 法提取 DNA， 每处理 5 个重复。 0047 取 65预热的 CTAB 800L， 加入离心管中， 65水浴 1h。
21、， 间或摇匀混合液 ； 12000rpm， 4离心 20min ； 取上清转入另一 2mL 的离心管中， 加入预冷 (4 ) 的等体积的 酚氯仿 (1 1)， 充分混匀， 12000rpm， 4离心 10min ； 取上清转入另一 2mL 的离心管中， 用预冷 (4 ) 的等体积的氯仿异戊醇 (24 1) 提取两次， 充分混匀， 12000rpm， 4离心 10min ； 取上清转入1.5mL的离心管中， 加入60L的NaAc(3mol/L， pH52)， 并加入500L预 冷 (-20 ) 的异丙醇， 于 -20静置 20min 使 DNA 沉淀， 12000rpm， 4离心 10min， 。
22、弃上清， 再加入1mL预冷(4)的70乙醇， 轻轻上下颠倒， 12000rpm， 4离心10min， 弃去乙醇， 真 空干燥机干燥 10min( 不可加热 )。加 50L 的双蒸水 ( 含有 1L RNase)， 轻轻敲打使沉 淀溶解， 37水浴 1h， 去除 RNA。 0048 用 NANODROP 1000 紫外分光光度计确定 DNA 的量， 构建提取 DNA 量和提取用菌丝 说 明 书 CN 101914630 B 5 4/13 页 6 量的关联标准曲线。 0049 1) 第一批次标准香菇 135 菌丝情况 ： 0050 表 1 第一批次标准培养菌丝提取的 DNA 浓度 0051 样品号。
23、 1 2 3 4 5 菌丝重 (g) 0.0019 0.0019 0.0020 0.0020 0.0019 DNA 浓度 (ng/L) 236.2 210.6 241.9 247.1 225.4 样品号 6 7 8 9 10 菌丝重 (g) 0.0029 0.0030 0.0030 0.0030 0.0029 DNA 浓度 (ng/L) 342.4 372.5 363.6 358.8 332.3 样品号 11 12 13 14 15 菌丝重 (g) 0.0041 0.0040 0.0039 0.0039 0.0039 DNA 浓度 (ng/L) 523.3 481.5 441.1 457.8 。
24、450.0 样品号 16 17 18 19 20 菌丝重 (g) 0.0050 0.0050 0.0049 0.0049 0.0051 DNA 浓度 (ng/L) 636.8 639.6 582.5 565.4 672.5 样品号 21 22 23 24 25 菌丝重 (g) 0.0059 0.0061 0.0059 0.0060 0.0060 DNA 浓度 (ng/L) 683.4 776.5 695.4 755.0 744.5 样品号 26 27 28 29 30 菌丝重 (g) 0.0070 0.0069 0.0070 0.0069 0.0070 DNA 浓度 (ng/L) 856.8 。
25、831.1 828.4 824.6 825.5 0052 表 2 第一批次标准培养菌丝 DNA 含量 0053 样品号 1 2 3 4 5 平均值 2mg 菌丝 DNA 量 (g) 12.43 11.08 12.10 12.36 11.86 11.97 说 明 书 CN 101914630 B 6 5/13 页 7 误差 ( ) 3.89 7.37 1.08 3.25 0.86 样品号 6 7 8 9 10 平均值 3mg 菌丝 DNA 量 (g) 17.71 18.63 18.18 17.94 17.19 17.93 误差 ( ) 1.22 3.88 1.40 0.06 4.13 样品号 1。
26、1 12 13 14 15 平均值 4mg 菌丝 DNA 量 (g) 25.53 24.08 22.62 23.48 23.08 23.76 误差 ( ) 7.46 1.35 4.78 1.17 2.86 样品号 16 17 18 19 20 平均值 5mg 菌丝 DNA 量 (g) 31.84 31.98 29.72 28.85 32.97 31.07 误差 ( ) 2.48 2.93 4.35 7.16 6.10 样品号 21 22 23 24 25 平均值 6mg 菌丝 DNA 量 (g) 34.75 38.19 35.36 37.75 37.23 36.65 误差 ( ) 5.20 4。
27、.19 3.53 2.99 1.56 样品号 26 27 28 29 30 平均值 7mg 菌丝 DNA 量 (g) 42.84 42.16 41.42 41.83 41.28 41.90 误差 ( ) 2.23 0.60 1.15 0.18 1.50 0054 由表 2 知 ： 第一批次的误差范围在 0.06 -7.46之间。 0055 2) 第二批次标准香菇 135 菌丝情况 ： 0056 表 3 第二批次标准培养菌丝提取的 DNA 浓度 0057 样品号 1 2 3 4 5 菌丝重 (g) 0.0021 0.0021 0.0020 0.0021 0.0021 DNA 浓度 (ng/L) 。
28、287.3 262.4 244.6 285.9 282.4 样品号 6 7 8 9 10 菌丝重 (g) 0.0030 0.0031 0.0031 0.0030 0.0029 说 明 书 CN 101914630 B 7 6/13 页 8 DNA 浓度 (ng/L) 370.1 413.1 431.0 375.3 327.0 样品号 11 12 13 14 15 菌丝重 (g) 0.0041 0.0040 0.0040 0.0041 0.0040 DNA 浓度 (ng/L) 552.8 528.0 534.7 548.6 531.0 样品号 16 17 18 19 20 菌丝重 (g) 0.0。
29、049 0.0050 0.0050 0.0051 0.0049 DNA 浓度 (ng/L) 603.0 598.8 631.5 673.5 590.4 样品号 21 22 23 24 25 菌丝重 (g) 0.0059 0.0060 0.0060 0.0059 0.0060 DNA 浓度 (ng/L) 724.7 767.7 712.8 690.0 763.9 样品号 26 27 28 29 30 菌丝重 (g) 0.0069 0.0071 0.0071 0.0070 0.0069 DNA 浓度 (ng/L) 789.6 848.6 883.3 827.5 827.8 0058 表 4 第二批。
30、次标准培养菌丝 DNA 含量 0059 样品号 1 2 3 4 5 平均值 2mg 菌丝 DNA 量 (g) 13.68 12.50 12.23 13.61 13.45 13.09 误差 ( ) 4.49 4.57 6.60 3.98 2.70 样品号 6 7 8 9 10 平均值 3mg 菌丝 DNA 量 (g) 18.51 19.99 20.85 18.77 16.91 19.01 误差 ( ) 2.63 5.17 9.73 1.27 11.01 样品号 11 12 13 14 15 平均值 4mg 菌丝 DNA 量 (g) 26.97 26.40 26.74 26.76 26.55 26。
31、.68 误差 ( ) 1.06 1.06 0.20 0.29 0.50 说 明 书 CN 101914630 B 8 7/13 页 9 样品号 16 17 18 19 20 平均值 5mg 菌丝 DNA 量 (g) 30.77 29.94 31.58 33.01 30.12 31.08 误差 ( ) 1.02 3.68 1.58 6.21 3.09 样品号 21 22 23 24 25 平均值 6mg 菌丝 DNA 量 (g) 36.85 38.39 35.64 35.08 38.20 36.83 误差 ( ) 0.05 4.22 3.23 4.74 3.70 样品号 26 27 28 29 。
32、30 平均值 7mg 菌丝 DNA 量 (g) 40.05 41.83 43.54 41.38 41.99 41.76 误差 ( ) 4.09 0.18 4.27 0.92 0.55 0060 由表 4 知 ： 第二批次的误差范围在 0.05 -11.01之间。 0061 3) 第三批次标准 PDB 液体培养的香菇 135 菌丝情况 ： 0062 表 5 第三批次标准培养菌丝提取的 DNA 浓度 0063 样品号 1 2 3 4 5 菌丝重 (g) 0.0021 0.0019 0.0019 0.0021 0.0020 DNA 浓度 (ng/L) 248.1 238.2 245.9 284.0 。
33、255.0 样品号 6 7 8 9 10 菌丝重 (g) 0.0031 0.0030 0.0031 0.0030 0.0029 DNA 浓度 (ng/L) 394.6 348.3 391.3 344.9 310.5 样品号 11 12 13 14 15 菌丝重 (g) 0.0041 0.0040 0.0041 0.0040 0.0040 DNA 浓度 (ng/L) 483.2 472.6 498.7 438.8 477.7 样品号 16 17 18 19 20 菌丝重 (g) 0.0051 0.0050 0.0049 0.0049 0.0049 DNA 浓度 (ng/L) 628.2 591.。
34、8 564.4 537.9 564.0 说 明 书 CN 101914630 B 9 8/13 页 10 样品号 21 22 23 24 25 菌丝重 (g) 0.0061 0.0061 0.0059 0.0059 0.0060 DNA 浓度 (ng/L) 767.2 759.4 691.7 702.9 741.4 样品号 26 27 28 29 30 菌丝重 (g) 0.0069 0.0071 0.0069 0.0069 0.0071 DNA 浓度 (ng/L) 806.8 856.8 805.5 793.3 836.3 0064 表 6 第三批次标准培养菌丝 DNA 含量 0065 样品号。
35、 1 2 3 4 5 平均值 2mg 菌丝 DNA 量 (g) 11.81 12.55 12.94 13.52 12.75 12.72 误差 ( ) 7.10 1.29 1.77 6.35 0.26 样品号 6 7 8 9 10 平均值 3mg 菌丝 DNA 量 (g) 19.09 17.42 18.93 17.25 16.06 17.75 误差 ( ) 7.57 1.88 6.67 2.84 9.52 样品号 11 12 13 14 15 平均值 4mg 菌丝 DNA 量 (g) 23.57 23.63 24.33 21.94 23.89 23.47 误差 ( ) 0.43 0.68 3.6。
36、5 6.52 1.77 样品号 16 17 18 19 20 平均值 5mg 菌丝 DNA 量 (g) 30.79 29.59 28.80 27.44 28.78 29.08 误差 ( ) 5.89 1.75 0.98 5.63 1.05 样品号 21 22 23 24 25 平均值 6mg 菌丝 DNA 量 (g) 37.73 37.35 35.17 35.74 37.07 36.61 误差 ( ) 3.06 2.01 3.94 2.38 1.25 样品号 26 27 28 29 30 平均值 7mg 菌丝 DNA 量 (g) 40.92 42.24 40.86 40.24 41.23 41。
37、.10 误差 ( ) 0.42 2.77 0.58 2.09 0.31 0066 由表 6 知 ： 第三批次的误差范围在 0.26 -9.52之间。 0067 将三个批次培养的标准菌丝的 DNA 含量归纳如表 7。 说 明 书 CN 101914630 B 10 9/13 页 11 0068 表 7 不同批次标准培养菌丝的 DNA 含量 0069 菌丝量 (mg) 2 3 4 5 6 7 第一批次 DNA 量 (g) 11.97 17.93 23.76 31.07 36.65 41.90 第二批次 DNA 量 (g) 13.09 19.01 26.68 31.08 36.83 41.76 第三。
38、批次 DNA 量 (g) 12.72 17.75 23.47 29.08 36.61 41.10 0070 将三个批次的标准曲线归纳如图 4 ： 0071 分析 ： 从图4及表7可以看出， 测量范围内每个批次标准培养菌丝量与其DNA含量 之间存在良好线性关系， 相关系数均大于 0.99 ； 3 个不同培养批次菌丝的标准曲线重合率 高， 表明本发明内容受不同批次菌丝及操作的影响较小 ； 统计构建标准曲线的 90 个数据可 知， 其误差范围在 0.05 -13.74， 小于 14； 香菇 135 标准培养菌丝中每 mg 菌丝提取的 DNA 量在 6.11g 左右。因此， 此标准曲线可以成为通过检测。
39、 DNA 含量来确定香菇 135 菌丝 生物量的基准。 0072 (4) 香菇 135 木屑常规培养基质 DNA 本底含量测定 0073 按香菇 135 木屑常规培养料配方取 85g 木屑 (0.2-0.30.5cm) 浸泡过夜， 再与 15g 麸皮混合， 调整含水量至 60， 高压灭菌 (121， 1.5h)， 冷却后于 -20冰箱冷冻至固 态， 转入冷冻干燥机(Heto Power Dry PL3000)充分干燥， 取适量培养料充分研磨后按步骤 (3) 方法提取 DNA， 提取结果见表 8 和表 9。 0074 表 8 纯培养料的 DNA 浓度 0075 样品号 1 2 3 4 5 培养料。
40、重 (g) 0.0099 0.0099 0.0101 0.0101 0.0101 DNA 浓度 (ng/L) 126.9 120.7 134.4 145.4 161.5 样品号 6 7 8 9 10 培养料重 (g) 0.0201 0.0201 0.0200 0.0200 0.0199 DNA 浓度 (ng/L) 330.0 303.4 249.4 266.5 235.6 0076 表 9 纯培养料的 DNA 含量 0077 说 明 书 CN 101914630 B 11 10/13 页 12 样品号 1 2 3 4 5 平均值 10mg 纯培养料 DNA 量 (g) 6.41 6.10 6.。
41、65 7.20 7.00 6.87 误差 ( ) 6.71 11.27 3.16 4.77 16.37 样品号 6 7 8 9 10 平均值 20mg 纯培养料 DNA 量 (g) 16.42 15.09 12.47 13.33 11.84 13.83 误差 ( ) 18.72 9.15 9.83 3.65 14.40 0078 由表 9 知 ： 每 mg 纯培养料的平均 DNA 含量为 0.689g。 0079 (5) 菌丝与培养料的混合， 确定基质对 DNA 提取的影响 0080 将冻干的标准培养香菇 135 菌丝与冻干的香菇 135 木屑常规培养料 同 (4) 按 两种比例 (40mg 。
42、菌丝 +160mg 培养料和 60mg 菌丝 +140mg 培养料 ) 混合， 充分研磨， 分别精 确称取 10mg、 20mg 混合物， 按 (3) 方法提取 DNA， 每个处理 5 个重复， 实验结果如表 10 和表 11。 0081 表 1040mg 标准培养菌丝与 160mg 培养料混合的 DNA 浓度 0082 样品号 1 2 3 4 5 混合料重 (g) 0.0099 0.0100 0.0099 0.0101 0.0100 DNA 浓度 (ng/L) 389.3 378.4 349.2 352.2 358.1 样品号 6 7 8 9 10 混合料重 (g) 0.0200 0.020。
43、1 0.0201 0.0200 0.0199 DNA 浓度 (ng/L) 745.3 744.5 796.9 718.2 779.0 0083 表 1140mg 标准培养菌丝与 160mg 培养料混合的 DNA 含量 0084 样品号 1 2 3 4 5 平均值 10mg 混合料 DNA 量 (g) 19.66 18.92 17.64 17.44 17.91 18.31 误差 ( ) 7.37 3.32 3.69 4.78 2.22 样品号 6 7 8 9 10 平均值 20mg 混合料 DNA 量 (g) 37.27 37.04 39.65 35.91 39.15 37.80 误差 ( ) 。
44、1.42 2.01 4.88 5.00 3.56 说 明 书 CN 101914630 B 12 11/13 页 13 0085 由表 11 知 ： 40mg 标准培养菌丝与 160mg 培养料混合的 DNA 含量的误差范围在 1.42 -7.37之间。 0086 表 1260mg 标准培养菌丝与 140mg 培养料混合的 DNA 浓度 0087 样品号 1 2 3 4 5 混合料重 (g) 0.0100 0.0099 0.0101 0.0101 0.0100 DNA 浓度 (ng/L) 479.6 462.4 457.0 458.7 435.4 样品号 6 7 8 9 10 混合料重 (g)。
45、 0.0200 0.0200 0.0199 0.0201 0.0200 DNA 浓度 (ng/L) 955.9 945.0 974.5 972.2 932.9 0088 表 1340mg 标准培养菌丝与 160mg 培养料混合的 DNA 含量关系 0089 样品号 1 2 3 4 5 平均值 10mg 混合料 DNA 量 (g) 23.98 23.35 22.62 22.71 21.77 22.89 误差 ( ) 4.78 2.04 1.15 0.78 4.88 样品号 6 7 8 9 10 平均值 20mg 混合料 DNA 量 (g) 47.80 47.25 48.97 48.37 46.6。
46、5 47.81 误差 ( ) 0.02 1.16 2.44 1.18 2.43 0090 由表 13 知 ： 60mg 标准培养菌丝与 140mg 培养料混合的 DNA 含量的误差范围在 0.02 -4.88之间。 0091 归纳两种混合比例结果如表 14。 0092 表 14 香菇 135 菌棒培养基质与标准菌丝混合的 DNA 含量关系 0093 混合菌丝量 (mg) 2 3 4 6 DNA 含量 (g) 18.31 22.89 37.80 47.81 0094 将 (4) 和 (5) 的结果比较， 确定该种基质对 DNA 提取的影响。 0095 即 ： 基质对 DNA 提取的影响率 ( 理。
47、论值 - 测定值 )/ 理论值 0096 理论值标准培养香菇纯菌丝 DNA 含量 纯菌丝与相应基质混合百分比 + 相应 基质 DNA 含量 (1- 纯菌丝与相应基质混合百分比 ) 0097 测定值菌丝与相应基质混合物的实测值。 说 明 书 CN 101914630 B 13 12/13 页 14 0098 两种混合比例分别取样 10mg、 20mg 混合物所对应的基质影响见表 15。 0099 表 15 基质对 DNA 含量的影响 0100 混合菌丝量 (mg) 2 3 4 6 影响率 0.03 -0.01 0.06 0.03 0101 由表 15 可知 ： 香菇 135 菌丝培养物对香菇 1。
48、35 菌丝 DNA 提取的平均影响率为 0.03。(6) 待测样品中香菇 135 菌丝生物量的确定 0102 香菇 135 三角瓶培养物中香菇 135 菌丝生物量的确定 0103 按香菇 135 木屑常规培养料配方 同 (4) 方法 ， 制作三角瓶 (250mL， 装料量为 120-130g)培养料5瓶， 接入新鲜的香菇135菌丝， 于25恒温箱中培养， 待菌丝长满料(培 养 18 天 ) 后， 取香菇 135 三角瓶中的培养物混匀， 称取 15g， 于 -20冰箱冷冻至固态， 转入 冷冻干燥机(Heto Power Dry PL3000)充分干燥， 充分研磨后， 准确称取10mg、 20mg。
49、冻干物， 按步骤 (3) 的方法提取 DNA， 每个处理 5 个重复， 实验结果如表 16 和表 17。 0104 表 16 香菇 135 三角瓶培养物的 DNA 浓度 0105 样品号 1 2 3 4 5 冻干物重 (g) 0.0099 0.0100 0.0101 0.0100 0.0100 DNA 浓度 (ng/L) 154.1 145.0 143.9 147.9 151.7 样品号 6 7 8 9 10 冻干物重 (g) 0.0200 0.0199 0.0200 0.0199 0.0200 DNA 浓度 (ng/L) 277.8 281.6 290.7 278.9 290.1 0106 表 17 香菇 135 三角瓶培养物的 DNA 含量 0107 样品号 1 2 。