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1、(10)授权公告号 CN 101921336 B (45)授权公告日 2013.02.27 CN 101921336 B *CN101921336B* (21)申请号 200910086353.7 (22)申请日 2009.06.11 CGMCC 2868 2009.01.14 C07K 16/18(2006.01) G01N 33/577(2006.01) C12N 15/06(2006.01) C12P 21/08(2006.01) C12N 5/20(2006.01) (73)专利权人 北京华大蛋白质研发中心有限公 司 地址 101318 北京市顺义区空港工业园 B-8 (72)发明人 。
2、任艳 韦汉福 潘秦 刘玲 徐宁志 刘国振 吴琳 刘斯奇 US 6613746 B1,2003.09.02, 全文 . CN 1732184 A,2006.02.08, 全文 . JP 2005069846 A,2005.03.17, 全文 . CN 1958611 A,2007.05.09, 全文 . US 4894442 A,1990.01.16, 全文 . (54) 发明名称 一种抗人 1 酸性糖蛋白的单克隆抗体及其 制备方法 (57) 摘要 本发明旨在制备针对 1 酸性糖蛋白 (AGP， Serum 1-acidglycoprotein) 的特异性单克隆 抗体， 并建立与之相应的实验方法。
3、。具体地说， 该 单克隆抗体可以选择性地识别糖基化修饰的天然 AGP蛋白， 但与原核表达的非糖基化修饰的AGP蛋 白的亲和性很低。该单克隆抗体的亚型为 IgG1， 亲和常数为 9108。本发明提供了分泌该单克 隆抗体的杂交瘤细胞系 BPI-AGP， 保藏号为 CGMCC 2868 ； 它能够稳定分泌高效价的抗 AGP 天然蛋白 的单克隆抗体。BPI-AGP 可用于对血液中 AGP 蛋 白质的检验。 同时， 本发明还提供了一套制备针对 糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 钟辉 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图。
4、 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 4 页 1/1 页 2 1.一种单克隆抗体， 其特征在于所述单克隆抗体是由保藏日为2009年1月14日、 保藏 号为 CGMCC 2868 的小鼠杂交瘤细胞系 BPI-AGP 产生的。 2. 含有权利要求 1 所述的单克隆抗体的免疫组化试剂， 其用于检测人肝癌组织和正常 组织中糖基化修饰的 AGP 的表达差异。 3. 含有权利要求 1 所述的单克隆抗体的免疫印迹试剂， 其用于检测人血液中糖基化修 饰的 AGP 的表达。 4. 含有权利要求 1 所述的单克隆抗体的酶联免疫吸附试剂， 其用于。
5、检测人血液总糖基 化修饰的 AGP 的表达。 5. 权利要求 1 所述单克隆抗体的用途， 其用于制备检测人肝癌组织和正常组织中糖基 化修饰的 AGP 的表达差异的免疫组化试剂的用途。 6. 权利要求 1 所述单克隆抗体的用途， 其用于制备检测人血液中糖基化修饰的 AGP 的 表达的免疫印迹试剂的用途。 7. 权利要求 1 所述单克隆抗体的用途， 其用于制备检测人血液中糖基化修饰的 AGP 的 表达的酶联免疫吸附试剂的用途。 8. 一种小鼠杂交瘤细胞系 BPI-AGP， 保藏号为 CGMCC 2868， 其特征在于所述小鼠杂交 瘤细胞株稳定地分泌权利要求 1 所述的单克隆抗体。 权 利 要 求 。
6、书 CN 101921336 B 2 1/9 页 3 一种抗人 1 酸性糖蛋白的单克隆抗体及其制备方法 技术领域 0001 本发明属于免疫化学、 蛋白质化学和细胞生物学领域。 具体而言， 本发明涉及一种 可以产生特异针对人1酸性糖蛋白(AGP， Serum1-acidglycoprotein)的单克隆抗体的 杂交瘤细胞系及其制备方法。 该杂交瘤制备的单克隆抗体可以应用于疾病的诊断或者相关 领域。 技术背景 0002 蛋白质的翻译后修饰状态与蛋白质功能密切相关， 其中糖蛋白发挥了多种重要的 生物功用， 如细胞膜上的糖蛋白参与胚胎发育、 细胞移动、 免疫反应以及细胞分裂等过程。 另外， 大部分血浆。
7、蛋白都具有不同程度的糖基化修饰。 值得注意的是， 现在已知的作为各种 疾病检测标记物的蛋白质都是糖蛋白， 如 PSA， AFP， CA125， CA153 和 HER-2 等。多年来， 关于 对血浆中的生物标记物的检测的研究取得了一定的进展。 其中最重要的方法就是生产针对 这些蛋白的抗体， 通过 ELISA 的方法实现对这些蛋白的检测和定量。该方法的关键即是获 得特异性好、 灵敏度高的抗体。 目前， 传统的生产抗体的方法已经相当成熟且在大多数情况 下非常有效， 但是对于血浆中的这些糖蛋白抗体的生产， 传统的方法往往存在一定的不足， 这是由于具有天然糖基化修饰的蛋白难以获得， 而且糖蛋白的抗原性。
8、往往不强。原核表达 的蛋白， 由于不具有糖基化修饰， 籍此产生的抗体往往不能很好地识别人血液中的糖蛋白。 糖蛋白抗体的生产通常可以通过富集和纯化生物体内的天然糖蛋白作为抗原， 采用传统的 抗体生产方法进行抗体制备。但是这种方法对于那些在生物体内含量较低， 或者难于纯化 的糖蛋白并不合适。 而且更重要的是， 在一系列体外操作过程中， 对糖蛋白的各种性质是否 造成不同程度的影响， 也是不得而知的。 因此为了克服以上困难， 一些科学家已经研发出新 的抗体制备方法以获得特异针对糖蛋白的抗体。McKenzie 采用小鼠腹腔注射在其细胞膜 上稳定表达外源糖蛋白 Neu 的肿瘤细胞作为免疫抗原的方法， 刺激。
9、机体产生并筛选出针对 该蛋白的单克隆抗体。在该方法中， 将 Neu 基因导入到 NIH3T3 细胞中， 使其在细胞膜上稳 定表达。细胞通过腹腔注射入小鼠后， 该蛋白的细胞外部分即可作为抗原刺激机体产生抗 体。 该方法克服了膜上糖蛋白难于富集纯化的困难， 而且实验结果也表明， 这种方法生产的 抗体比依靠合成 Neu 蛋白上的肽段作为抗原生产出的抗体具有更好的特异性， 可以区分与 其相似性极高的蛋白。 Atabai也通过类似的方法将稳定表达MFGE8蛋白的人的肿瘤细胞注 射到兔子体内， 通过筛选获得特异性单克隆抗体。Suzuki 等将 heparin 的糖链连接到载体 蛋白 KLH 上作为抗原， 。
10、采用传统方法注射到小鼠体内， 筛选出可特异识别该糖链的单克隆 抗体。但是上述研究并没有能够提供一种应用性广泛的方法， 而且实验操作比较复杂。 0003 本发明人以人 AGP 为例， 试图建立一套可生产特异识别糖基化蛋白的抗体的方 案， 由此生产的单克隆抗体可基本上克服糖蛋白抗原性低下和糖蛋白抗体特异性差的缺 陷。将外源的糖蛋白基因通过逆转录病毒载体导入到小鼠黑色素瘤细胞 B16 中， 经过筛选 获得稳定表达株。该表达株可以持续地将外源糖蛋白分泌到细胞外。将稳定细胞株和佐剂 混合后经皮下注射到 C57BL/6J 小鼠体内， 随着细胞的不断增殖和生长， 外源糖蛋白被持续 说 明 书 CN 1019。
11、21336 B 3 2/9 页 4 分泌到小鼠体内作为抗原刺激机体产生抗体。 将血清呈阳性反应的小鼠脾细胞与骨髓瘤细 胞进行融合后， 通过多次筛选， 可以得到可特异识别外源糖蛋白的单克隆抗体。 该方法与传 统的生产糖蛋白单克隆抗体的方法相比具有明显的优势 ： 在此过程中， 细胞表达分泌的蛋 白具有正确的糖基化修饰， 不需对它们进行富集， 而且这些抗原是持续性的分泌到小鼠体 内， 不断刺激机体的免疫系统， 这样既解决了糖蛋白富集的难题， 又解决了糖蛋白抗原性低 的问题。我们采用该方法成功地生产了 AGP 的单克隆抗体， 这些抗体可以特异性的识别糖 基化修饰的 AGP， 而对非糖基化的 AGP 几。
12、乎不具有识别能力。 发明内容 0004 一)本发明涉及一种能够特异性识别血浆糖蛋白AGP的鼠源单克隆抗体BPI-AGP， 以及该单克隆抗体在疾病检测中的应用。该单克隆抗体 BPI-AGP 的亚类为 IgG1 型， 而且可 以特异性的识别糖基化修饰的 AGP， 而对非糖基化的 AGP 几乎不具有识别能力。 0005 二 ) 本发明涉及一种能够分泌特异性识别 AGP 单克隆抗体的杂交瘤细胞系。该杂 交瘤细胞系产生的抗 AGP 单克隆抗体 BPI-AGP 用于对血液中糖蛋白的表达水平的检测。如 用于检测疾病状态下患者血液中 AGP 的丰度改变。 0006 三 ) 本发明涉及制备该杂交瘤细胞系的方法，。
13、 其中包括 ： 1) 将含有带有 RFP 标签 的外源基因AGP的逆转录病毒载体转染病毒包装细胞， 收集病毒后感染B16细胞， 并通过药 物处理进行稳定株的筛选， 通过 RFP 抗体检测稳定株对这些糖蛋白的分泌 ； 2) 将所得的稳 定株与弗氏完全佐剂混合后， 经皮下注射到 C57BL/6J 小鼠脾脏侧的腰窝处 ； 3) 使用弗氏完 全佐剂进行腹部皮下注射以增强免疫反应 ； 4) 使用人血浆蛋白和原核表达的 AGP 对单克隆 抗体同时进行筛选， 以获得特异针对糖基化修饰蛋白的单克隆抗体 ； 5) 对这些单克隆抗体 的检测和评估。 0007 四 ) 本发明选择了分泌蛋白作为抗原， 该抗原可以分泌。
14、到细胞外， 直接入血， 刺激 机体产生体液免疫反应。与传统的抗体生产方法不同， 该抗原是随着细胞的生长而不断持 续被分泌到细胞外的。因此， 引起的刺激也是连续性的。在细胞和宿主选择方面， 黑色素瘤 细胞 B16 即是宿主 C57BL/J6 小鼠来源的， 因此， 注射了稳定株细胞的小鼠只对外源性的分 泌糖蛋白有免疫反应， 而不会对 B16 细胞自身来源的其他任何蛋白有免疫反应。这一策略 保证了生产出的抗体的单一性和优越性。而 B16 细胞是一种易转染、 对外源基因可以稳定 高效表达的细胞。 0008 五 ) 本发明对标签蛋白红色荧光蛋白 RFP 的引入同时考虑到了三方面的因素 ： 1) 由于 R。
15、FP 基因是融合在外源糖蛋白的 C 端， 因此， 它不会对蛋白的分泌产生影响， 而在整个 转染、 感染和筛选的过程中， 红色荧光可以表明转染、 感染效率以及外源蛋白在细胞内的表 达状况 ； 2) 在对筛选到的稳定株进行检测时， RFP 抗体可以作为一个有效的工具， 对外源糖 蛋白的分泌进行测定 ； 3)作为一种载体蛋白， RFP可以增加肌体对糖蛋白的免疫反应。 该原 理类似于在使用多肽作为免疫原时采用 KLH 作为载体蛋白增强免疫反应。这是由于糖蛋白 上的糖链作为一种半抗原降低了糖蛋白的抗原性， 因此使用分子量较大的 RFP(28Kd)， 而不 是通常用的 HIS-Tag 等作为融合蛋白。 0。
16、009 六 ) 本发明倾向于选择采用逆转录病毒作为载体将外源基因导入到 B16 细胞中。 这是因为对一些基因长度比较大的糖蛋白来说， 在与 RFP 基因融合后的基因长度过大不利 说 明 书 CN 101921336 B 4 3/9 页 5 于采用传统的直接转染的方法进行稳定株的筛选。 而逆转录病毒却可以包装比较大的基因 片断， 而且它的感染效率往往很高， 可以大大缩短筛选稳定株所需的时间。 但本发明同样也 涉及其他转染方法在该抗体生产过程中的应用。 0010 七 ) 本发明采用脾脏侧腰窝处的皮下注射免疫。这主要是考虑到以下几个方面 ： 1) 首先机体内产生免疫反应的重要器官即是脾脏 ； 2) 。
17、在众多的免疫方式中， 抗原的直接脾 脏免疫方式已经被证明是一种更加有效的选择。 但是， 这种注射方法对于机体的影响显著， 很可能造成动物的死亡。在本发明中， 由于 B16 是一种恶性程度高、 易转移的肿瘤细胞， 很 易导致小鼠的死亡。如果将 B16 细胞直接注射小鼠脾脏内， 则在很短时间内就可能导致小 鼠的死亡， 而此时有效抗体还没有大量产生。 0011 八 ) 本发明首创佐剂与细胞混合注射。佐剂的使用在抗原呈递过程中起到关键的 作用， 可以大大提高抗体的产生。在本发明中， 佐剂与细胞混合注射后， 虽然会杀死部分细 胞， 但是存活的细胞一旦分泌出糖蛋白后， 其周围的佐剂就会及时对这些抗原进行呈。
18、递， 增 加抗体的产生。我们的实验亦表明佐剂的混合注射会明显提高抗体的产出。而在细胞注射 后， 单独的佐剂腹下注射也是为了增强肌体的免疫反应。 0012 九 ) 本发明所涉及的生产单克隆抗体的技术可适用于生产针对跨膜及膜外蛋白 (如细胞基质类蛋白)的抗体。 这是由于将这些基因转入B16细胞后， 这些位于细胞外的蛋 白或蛋白中的一部分可以作为抗原持续性的刺激机体产生抗体。 该方法产生的抗体往往仅 识别跨膜蛋白的胞外区域， 具有较强的特异性。而且这些跨膜及膜外蛋白往往也具有一定 的糖基化修饰， 因此， 使用该方法可以生产出可特异性识别这些糖基化修饰的抗体。 使用该 方法也可以生产特异针对蛋白质其它。
19、修饰形式的抗体， 包括磷酸化、 硝基化等。 只要在天然 状态下会发生修饰的蛋白， 通过该方法都能生产出能特异识别该修饰形式蛋白的抗体。 附图说明 0013 图 1 ： 表示稳定株分泌蛋白的免疫印迹检测结果， 结果显示带有 RFP 融合标签的糖 蛋白被顺利地分泌到细胞外， 且从目标蛋白的分子量变化上也表明 AGP 发生了明显的糖基 化修饰。 0014 图2 ： 表示B16-RFP-AGP稳定株的荧光镜检测结果， 具体而言， B16-RFP-AGP的荧光 显微照片表明红色荧光仅分布在胞质区域， 这也证实了 AGP 糖蛋白的分泌性质。 0015 图 3 ： 注射免疫 B16-RFP-AGP 稳定株细。
20、胞的小鼠抗血清的免疫印迹检测结果， 具体 可见， 免疫了 B16-RFP-AGP 稳定细胞系的小鼠抗血清中已经包含了对蛋白糖基化修饰有特 异性的识别倾向的多克隆抗体。 0016 图4 ： 表示BPI-AGP单克隆抗体和Sigma-AGP单克隆抗体对不同修饰状态AGP抗原 的免疫印迹差异识别的实验结果， 具体而言， BPI-AGP 单克隆抗体对糖基化蛋白特异识别， 而对原核表达的无糖基化修饰的AGP没有识别， 对脱糖后AGP蛋白的识别也明显的减弱。 而 Sigma-AGP 单克隆抗体对这两种不同修饰形式的蛋白的识别没有偏向性。 0017 图 5 ： 表示 BPI-AGP 单克隆抗体和 Sigma。
21、-AGP 单克隆抗体对不同修饰状态 AGP 抗 原的 ELISA 检测结果的差异的实验结果， 具体而言， BPI-AGP 单克隆抗体只对糖基化 AGP 有 特异的结合， 而对原核表达的非糖基化 AGP 几乎无结合。而 Sigma-AGP 单克隆抗体对两者 的结合均没有明显的差异。 说 明 书 CN 101921336 B 5 4/9 页 6 0018 图 6 ： 表示 BPI-AGP 单克隆抗体和 Sigma-AGP 单克隆抗体的免疫组化实验结果， 该结果表明 ： BPI-AGP 单克隆抗体对人肝脏组织中的糖基化 AGP 的识别的特异性高于 Sigma-AGP 单克隆抗体对人肝脏组织中的糖基化。
22、 AGP 的识别。 具体实施方式 0019 实施例 1 糖蛋白的基因克隆 0020 本发明人根据已公布的人 AGP 的基因序列 (SEQ ID NO.1) 设计 PCR 引物 ： 0021 AGP 5 正向引物 0022 5 -GCCAAGCTTATGGCGCTGTCCTGGGTTCT-3 (SEQ ID ON.2) 0023 AGP 3 反向引物 0024 5 -GGCGGATCCTAGGATTCCCCCTCCTC-3 (SEQ ID ON.3) 0025 以人肝 cDNA 文库为模板， PCR 扩增出全长 AGP 基因， (PCR 参数 ： 95 5 分钟 ； 94 30s 54 30s 。
23、72 1 分钟， 共 40 个循环 ； 72后延伸 10 分钟 ) 经 Hind III 和 BamH I 双酶切后与 pLNCX2-RFP 质粒连接 (RFP 基因来自于 pDsRed2 质粒， 从该质粒上用 Hind III 和Not I内切酶将RFP基因切下后， 连接到经同样双酶切的pLNCX2质粒上)， 化学转化感受 态细胞 E.coli DH5， 挑单克隆提取质粒进行测序， 验证序列无误。 0026 实施例 2 稳定表达并分泌外源糖蛋白的细胞株的构建、 筛选和验证 0027 从E.coli DH5中提取构建好的pLNCX2-RFP-AGP质粒和编码逆转录病毒包膜蛋 白的质粒 pVSV。
24、-G， 按照 DNA 和转染试剂 Lipofectamine2000(11668-019， Invitrogen) 的量 为15的比例进行两种质粒的共转染。 在氯奎的帮助下， 将两种质粒转入逆转录病毒包装 细胞 GP2-293 中。8 小时后进行换液以清除氯奎对细胞的毒性作用。撤除氯奎后的 48 小时 后， 收集 GP2-293 的培养基上清， 此时的培养基中被释放出的含有外源基因的逆转录病毒 颗粒最多。通过长时间的高速离心 (4， 50,000g， 90 分钟 ) 富集沉淀下来的逆转录病毒颗 粒。 将这些病毒进行复性后， 加入到目标细胞B16的培养基中， 在Polybrene(H9268， 。
25、Sigma) 试剂的帮助下， 这些病毒即可感染 B16 细胞， 同时将外源基因导入到目标细胞中。感染后的 细胞， 在 G418 的筛选作用下， 经过大约 2 周的时间， 即可获得单克隆稳定株细胞。采用免 疫印迹的方法对筛选得到的稳定株进行验证。方法如下 ： 将稳定株细胞的完全培养基吸出 后， 用生理盐水洗细胞 3 次， 然后换成无血清培养基继续培养 12 小时。收集这些无血清培 养基， 通过截留分子量为 30kD 的 Amicon Filter(UFC803008， Millipore) 进行培养基中蛋 白质的浓缩。浓缩 40 倍后的培养基即可直接用于免疫印迹检测。图 1 显示了稳定株分泌 到。
26、细胞外的糖蛋白的免疫印迹检测结果以及图2显示的稳定株(B16-RFP-AGP)的荧光显微 照片。从图 1 中可以看出带有 RFP 融合标签的糖蛋白被顺利的分泌到细胞外， 且从目标蛋 白的分子量变化上也表明 AGP 发生了明显的糖基化修饰。从图 2 中可以看出， B16-RFP-AGP 的荧光显微照片表明红色荧光仅分布在胞质区域， 这也证实了 AGP 糖蛋白的分泌性质。 0028 实施例 3AGP 重组抗原的制备 0029 根据已公布的人 AGP 的基因序列设计 PCR 引物 ： 0030 AGP 5 正向引物 0031 5 -GCCGGATCCATGGCGCTGTCCTGGGTTCT-3 (S。
27、EQ ID ON.4) 0032 AGP 3 反向引物 说 明 书 CN 101921336 B 6 5/9 页 7 0033 5 -GGCAAGCTTCTAGGATTCCCCCTCCTC-3 (SEQ ID ON.5) 0034 以人肝 cDNA 文库为模板， PCR 扩增出全长 AGP 基因， 经胶回收后进行 BamH I 和 Hind III 双酶切， 回收后， 与同样双酶切的 pET28a 载体进行连接， 化学转化感受态细胞 E.coli DH5， 经过双酶切验证以及质粒测序选取阳性克隆菌株。将选取的阳性克隆的质 粒化学转化感受态细胞 BL21(DE3)。接种可表达 AGP 的 BL2。
28、1 菌株， 当菌液的 OD 值达到 0.6 左右时， 加入 1mmol/L IPTG 诱导 4 小时。诱导以后的菌株经超声后离心， 上清和沉淀分别 进行 SDS-PAGE 电泳， 结果显示表达的产物为包涵体蛋白。大量培养细菌， IPTG 诱导 4 小时 后进行收菌， 超声破碎、 离心、 弃上清， 在沉淀中加入含 8M 尿素的提取液溶解表达的包涵体 蛋白。再次离心后， 上清即可用于纯化。使用 Ni-NAT 亲和层析柱对表达的 AGP 蛋白进行纯 化， 柱子经平衡、 上样、 淋洗后， 使用 10、 20、 50mM 咪唑进行分段洗脱， 去除其中的杂蛋白， 最 后采用 100mM 咪唑洗脱目的蛋白。。
29、纯化后的蛋白经 SDS-PAGE 电泳， 检测 AGP 蛋白的纯化效 果。其他所用的重组蛋白的制备， 如 RFP 也经历了相同的表达和纯化过程。 0035 实施例 4 抗人 AGP 单克隆抗体杂交瘤 (BPI-AGP， 保藏日 2009 年 1 月 14 日， 保藏号 为 CGMCC 2868， 包藏地中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC) 的制备 0036 稳定分泌表达RFP-AGP的B16细胞经胰酶消化并终止后， 离心收集细胞。 这些细胞 经PBS洗涤三次后， 用无血清的培养基重悬， 进行细胞计数。 按照等体积(100L100L) 的比例将 5-10 万个细胞与弗氏完全佐。
30、剂反复吹打几次， 混匀。混匀后的混合物经注射器注 射到小鼠脾脏侧腰窝处的皮下。以后， 每隔 7 天在小鼠腹部皮下注射弗氏完全佐剂进行免 疫加强。 0037 一个月后， 通过眼眶取血， 对血液中的抗血清进行免疫印迹检测。选择原核细胞 表达的 AGP， 人血中的糖基化修饰的 AGP(G9885， Sigma)， B16 稳定表达株分泌的糖基化的 RFP-AGP 蛋白以及原核细胞表达的 RFP 和 RFP-AGP 作为抗原检测注射肿瘤细胞后的小鼠抗 血清的效价。每种蛋白上样约 200ng， 进行 12聚丙烯酰胺凝胶电泳， 电泳结束后立即进 行电转移， 过程如下 ： 将 PVDF 膜置于 5mL 甲醇。
31、中， 处理 5 分钟 ； 加入 4 倍体积 (20mL) 水， 慢 加快摇， 将甲醇逐级稀释到 20， 倒去液体 ； 再用转膜缓冲液 (20甲醇， 25mM Tris-base， 192mM Glycine) 平衡 15 分钟。将凝胶浸泡于含有 0.01 SDS 的转膜缓冲液中， 10 分钟。 按照黑板 - 海绵 - 滤纸 - 凝 PVDF 膜 - 滤纸 - 海绵 - 白板的顺序， 做好三明治夹， 放入装有 0.01SDS转膜缓冲液的Trans-Blot Cell转膜仪中(Bio-Rad， Hercules， U.S.A.)， 350mA， 转膜 2 小时。PVDF 膜的进一步处理过程如下 ：。
32、 膜以 PBST 浸湿， 加 PBST 配制 5脱脂奶粉 封闭， 室温摇床上摇 2 小时， 4过夜， PBST 洗膜后加入 1 2000 稀释的小鼠抗血清， 室温 下孵育 2 小时， 洗膜后加入 1 4000 的羊抗鼠 IgG 的二抗 ( 用 HRP 标记 )， 孵育 1 小时， 再 次 PBST 洗膜， 使用 ECL 增强型免疫印迹检测试剂盒 (RPN2132， GE Healthcare) 发光， X 片 曝光。图 3 是注射了稳定株细胞后的小鼠血清的免疫印迹检测结果。免疫印迹实验结果 ( 图 3) 显示 ： 在注射免疫了稳定株细胞的小鼠血清中已经产生了可识别标签蛋白 RFP 以及 RFP。
33、-AGP 原核表达的融合蛋白的抗体， 同时， 该多克隆抗体还可特异识别糖基化修饰蛋白， 包括B16-RFP-AGP分泌到胞外的发生了糖基化修饰的AGP以及人血中天然存在的发生了糖 基化修饰的 AGP。而该抗体却对原核表达的无糖基化修饰的 AGP 没有识别。这表明该多克 隆抗体具有了对糖基化修饰的蛋白有特异性的识别倾向。 0038 用Western blot的方法检测小鼠多抗血清的效价， 如在12000稀释或稀释比例 说 明 书 CN 101921336 B 7 6/9 页 8 更高的情况下可以检测0.5L人血浆中的AGP即可用于进一步融合实验。 取免疫效价达到 要求的C57BL/6J小鼠的脾脏。
34、， 放在细胞筛上碾碎， 按51的比例与SP2/0细胞经PEG1500 进行融合。既融合后的细胞用甲基纤维素半固体培养基培养， 经 HAT 进行筛选， 挑出 500 个 单克隆细胞在 96 孔板中继续培养。使用原核表达纯化的 RFP 以及去除了白蛋白和免疫球 蛋白的人血清蛋白(Albumin/IgG Removal Kit， Cat.122642， CALBIOCHEM)分别作为抗原包 板， 对这些单克隆细胞的培养基上清进行 ELISA 筛选出分别识别不同抗原的抗体。得到的 阳性克隆细胞先注射小鼠生产腹水， 然后进行冻存。 0039 实施例 5 单克隆抗体的纯化 0040 从 -80冰箱或液氮罐。
35、中迅速取出冻存管 ； 迅速放入水浴锅中快速搅动， 使冻存 液在 2 分钟内全部融化成液体。用 75酒精擦拭冻存管。往 15mL 离心管中加入 3mL 血清 培养基， 将冻存液吸入离心管， 1500 转 / 分钟， 离心 5 分钟。弃上清， 用完全培养基悬起细 胞， 培养于 6 孔板或瓶中。6 孔板中培养基为 3mL， 第二天换液， 再补足 3mL ； 培养瓶培养基 为5mL。 对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起 ； 计数大约5105， 1mL。 悬浮的细胞腹 腔注射小鼠。 一般7-10天后便可开始收集腹水， 每隔2、 3天可重复取， 最终可收集1-10mL/ 只。每次取出的腹水 4000 。
36、转， 10 分钟离心， 中间为腹水。小心吸出腹水收集于离心管中， 4保存。 0041 将腹水在 4条件下， 10000 转离心 10 分钟， 去除脂类物质。离心后吸取上清， 并用偶联缓冲液以 1 3( 腹水， 偶连液比 ) 稀释， 过 0.22m 膜， 用 HiTrap Protein A FF(17-5079-01， GE Healthcare) 纯化单克隆抗体。用 5-10 柱体积的偶联缓冲液平衡柱子 后上样。再用 5 倍柱体积的偶联缓冲液洗柱。在收集管中加入 60-200L 中和液， 利于维 持抗体的生物活性， 避免抗体失活。用 5 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱抗体， 并收集在步骤 6 的 收。
37、集管中。可以得到纯化较高的单克隆抗体。这些抗体被命名为 BPI-AGP 抗体。 0042 实施例 6 单克隆抗体亲和常数的测定 0043 包被免疫用人血清中纯化出的糖基化 AGP(G9885， Sigma) 以及原核表达纯化的 AGP， 包被浓度为 2g/mL， 100L/ 孔， 4包被过夜， 1PBST 洗 3 次。每孔加 200L 封 闭液 37封闭 2 小时， 1PBST 洗 3 次。抗 AGP 单克隆抗体 (BPI-AGP) 以及商品单克隆抗 体 (A5566， Sigma)， 从 1 200 开始 2 倍梯度稀释， 最后 1 孔留空白对照， 37孵育 1 小时， 1PBST 洗 3 。
38、次。HRP 标记的羊抗鼠二抗 1 20000 稀释， 每孔 100L， 37孵育 1 小时， 1PBST 洗 3 次。显色液 100L/ 孔显色 10 分钟， 50L/ 孔终止液终止反应。用酶标仪测 定吸光值。 0044 0045 150000 为单个 IgG 抗体平均分子量值， 抗体原始浓度单位为 mg/mL。 结果显示， 商品单克隆抗体 (A5566， Sigma) 对糖基化 AGP(G9885， Sigma) 和原核表达的非糖基化 AGP 的亲和常数分别为 ： 3109和2.3109， 而BPI-AGP单克隆抗体对糖基化AGP和原核表达的 非糖基化 AGP 的亲和常数分别为 ： 9108。
39、和 1104。 0046 实施例 7 单克隆抗体亚类测定 0047 用 100mM PBS(pH7.4) 稀释包被羊抗鼠 IgG 至 0.5g/mL， 每孔加 100L， 4， 过 说 明 书 CN 101921336 B 8 7/9 页 9 夜。倾空液体， 用含 0.05吐温的 PBS 洗 3 次， 每孔加入 200L 封闭液， 37孵育 1 小时。 倾空液体， 用 PBS-T 清洗 3 次。每孔加入 0.1mL 杂交瘤上清， 37孵育 1 小时。倾空液体用 PBS-T 清洗 3 次。用封闭液 1 1000 稀释 HRP 标记的羊抗鼠 (， ) 抗体或 1 2000 稀 释 HRP 标记的羊。
40、抗鼠 (IgM， IgG1， IgG2a， IgG2b， IgG3， IgA) 抗体 0.1mL 每孔， 分别加入适当 的孔中， 37用孵育 1 小时。倾空液体， 用 PBS-T 清洗 3 次。每孔加 50L 底物溶液， 10-20 分钟内测 405nm 波长下的 OD 值。 0048 实验结果显示， 本发明单克隆抗体为 IgG1 型鼠源单克隆抗体。 0049 实施例 8 本发明单克隆抗体用途的验证 - 免疫印迹 0050 选择原核细胞表达的 AGP， 人血中的糖基化修饰的 AGP(G9885， Sigma) 以及脱糖后 的AGP作为抗原可以分别检测本发明单克隆抗体和商品的抗体(A5566， 。
41、Sigma)在对不同抗 原识别的特异性。 0051 脱糖过程如下 ： 将 50g 的人血 AGP 蛋白溶解到 45L 的 20mM pH 8.0 的碳酸氢 铵缓冲液中。然后加入 5L 0.2 SDS 和 100mM - 巯基乙醇的变性溶液。100加热 10 分钟将糖蛋白变性。冷却到室温后， 加入 5L 15的 TRITON X-100， 混匀。最后加入 5LPNGase F 混匀后， 37温育 3 小时。100加热 5 分钟终止反应。 0052 免疫印迹实验过程如下 ： 每种蛋白上样约 200ng， 进行 12聚丙烯酰胺凝胶电泳， 电泳结束后立即进行电转移， 转移过程同实施例 4。将蛋白质转移。
42、到 PVDF 膜上， 冰浴中 350mA 恒流转移 2 小时。杂交过程如下 ： 膜以 PBST 浸湿， 加 PBST 配制 5脱脂奶粉封闭， 室 温摇床上摇 2 小时， 4过夜， PBST 洗膜后加入 1 2000BPI-AGP 单克隆抗体或 1 10,000 商品单克隆抗体 (A5566， Sigma)， 室温下孵育 2 小时， 洗膜后加入 1 4000 的羊抗鼠 IgG 的二抗 ( 用 HRP 标记 )， 孵育 1 小时， 再次 PBST 洗膜， 使用 ECL 增强型免疫印迹检测试剂盒 (RPN2132， GE Healthcare) 发光， X 片曝光。图 4 显示的是两种单克隆抗体的免。
43、疫印记的结 果， 从图 4 中可以看出， BPI-AGP 单克隆抗体对糖基化蛋白有特异的识别， 如， B16-RFP-AGP 分泌到胞外的发生了糖基化修饰的 AGP 以及人血中天然存在的发生了糖基化修饰的 AGP。 而该抗体却对原核表达的无糖基化修饰的 AGP 没有识别， 对脱糖后 AGP 蛋白的识别也明显 的减弱。而商品的单克隆抗体对这两种不同修饰形式的蛋白的识别没有偏向性， 如对人血 中天然存在的发生了糖基化修饰的 AGP 和原核表达的无糖基化修饰的 AGP 以及脱糖后 AGP 蛋白的识别都没有明显的差异。 0053 实施例 9 本发明单克隆抗体用途的验证 -ELISA 实验 0054 从。
44、原核表达产物中纯化出的 AGP 和从 Sigma 购买的从人血中纯化出的糖基化 AGP(G9885， Sigma) 分别作为抗原用来检测 BPI-AGP 抗体和商品 AGP 抗体的差异。每孔 200ng 的抗原， 4过夜包被。PBST 溶液洗 2 次， 2 BSA 溶液 37封闭 2 小时。PBST 溶液 洗 2 次， PBS 不同稀释梯度的一抗 (1 200， 1 400， 1 800， .1 256000)37孵育 1 小时。PBST 溶液洗 3 次， 1 20000 稀释的 HRP 标记的抗鼠二抗 37孵育 1 小时。PBST 溶液洗 3 次， 加入显色底物 TMB 进行显色， 2M H。
45、2SO4终止反应。450nm 读取的光吸收值如图 5。从图 5 中可以明显看出 BPI-AGP 单克隆抗体只对糖基化 AGP 有特异的识别， 其对糖基化 AGP(200ng) 的效价为 1 50,000， 对原核表达的非糖基化 AGP 几乎无识别。而商品 AGP 抗 体对两者的识别没有明显的差异， 效价都在 1 100,000 左右。 0055 实施例 10 本发明单克隆抗体用途的验证 - 免疫组化实验 说 明 书 CN 101921336 B 9 8/9 页 10 0056 组织切片的蜡片经二甲苯脱蜡后， 再经 100， 95， 85， 75乙醇进行水化。 0.3 H2O2室温 10 分钟，。
46、 去除组织内的辣根过氧化物酶活性， PBS 洗 3 次 5 分钟。5脱 脂奶粉， 37封闭 2 小时。滴加一抗 (BPI-AGP 抗体以及商品单克隆抗体 )(1 500)， 湿盒 4过夜， PBS 洗 3 次 5 分钟， 滴加羊抗鼠二抗， 室温孵育 60 分钟， PBS 洗 3 次 5 分钟， DAB-H2O2显色， 镜下控制 3-5 分钟， PBS 漂洗， 终止显色， 苏木素复染 45 秒， 1盐酸酒精分 色， 温热的自来水冲洗反蓝， 75， 85， 95和 100乙醇脱水各 15 分钟， 二甲苯透明， 中 性树胶封片。如图 6 所示， 图 6 显示 BPI-AGP 抗体与商品 AGP 抗体。
47、对人肝脏组织中的糖基 化 AGP 的识别差异不大， 但是 BPI-AGP 抗体的特异性更好。 0057 北京华大蛋白质研发中心有限公司 0058 一种抗人 1 酸性糖蛋白单克隆抗体及其制备方法 0059 0060 5 0061 PatentIn version 3.5 0062 1 0063 606 0064 DNA 0065 human 0066 1 0067 atggcgctgt cctgggttct tacagtcctg agcctcctac ctctgctgga agcccagatc 60 0068 ccattgtgtg ccaacctagt accggtgccc atcaccaacg。
48、 ccaccctgga ccggatcact 120 0069 ggcaagtggt tttatatcgc atcggccttt cgaaacgagg agtacaataa gtcggttcag 180 0070 gagatccaag caaccttctt ttacttcacc cccaacaaga cagaggacac gatctttctc 240 0071 agagagtacc agacccgaca ggaccagtgc atctataaca ccacctacct gaatgtccag 300 0072 cgggaaaatg ggaccatctc cagatacgtg ggaggccaag。
49、 agcatttcgc tcacttgctg 360 0073 atcctcaggg acaccaagac ctacatgctt gcttttgacg tgaacgatga gaagaactgg 420 0074 gggctgtctg tctatgctga caagccagag acgaccaagg agcaactggg agagttctac 480 0075 gaagctctcg actgcttgcg cattcccaag tcagatgtcg tgtacaccga ttggaaaaag 540 0076 gataagtgtg agccactgga gaagcagcac gagaaggaga ggaaacagga ggagggggaa 600 0077 tcctag 606 0078 2 0079 29 0080 DNA 0081 primer 0082 2 0083 gccaagct ta tggcgctgtc ctgggt tct 29 0084 3 0085 26 0086 DNA 0087 primer 说 明 书 CN 101921336 B 10 9/9 页 11 0088 3 0089。