发酵法合成多粘菌素E的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101235406 B (45)授权公告日 2012.02.22 CN 101235406 B *CN101235406B* (21)申请号 200710036927.0 (22)申请日 2007.01.29 C12P 21/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/12(2006.01) (73)专利权人 上海医药工业研究院 地址 200040 上海市北京西路 1320 号 (72)发明人 齐艳艳 陈雪 田永辉 赵文杰 冯军 程睛华 林纲 薛春佳 朱裕辉 魏晓东 (74)专利代理机构 北京市金杜律师事务所 11256 代理人 徐雁漪。

2、 JP 昭 45-26074 A,1970.08.28, JP 昭 46-16152 ,1971.05.01, CN 1687399 A,2005.10.26, 陶银英 . 多粘菌素 E 产生菌高通量诱变育种 的研究 .中国优秀博硕士学位论文全文数据库 （硕士） 工程科技 I 辑 .2006, 第 9 卷 B016-137. 邢维玲 等.多粘菌素E高产菌株的选育. 中 国抗生素杂志 .2002, 第 27 卷 ( 第 6 期 ), (54) 发明名称 发酵法合成多粘菌素 E 的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种发酵法合成多粘菌素 E 的 方法， 包括将多粘芽孢杆菌 bacillus pol。

3、ymyxa AS1.541 接种于培养基中进行培养的步骤， 其特 征在于， 所述培养基使用的有机氮源的浓度为 410。 由本发明方法发酵合成多粘菌素E的 最高发酵单位可达 22143.7U/ml。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 潘天耀 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 101235406 B1/1 页 2 1. 一种发酵法合成多粘菌素 E 的方法， 包括将多粘芽孢杆菌 bacillus polymyxa AS1.541 接种于培养基中进行培养的步骤， 所述培养基包括碳源、 有机氮源、 无机氮源、 CaCO3以及。

4、微量元素， 其特征在于 ： 所述碳源为淀粉， 该碳源的浓度为 3 ； 所述有机氮源为大豆分离蛋白， 浓度为 4 10 ； 所述无机氮源为硫酸铵， 浓度为 0.1 ； CaCO3浓度为 0.8 ； 所述微量元素为 Mg2+或 Mn2+的可溶性盐类， 浓度为 0.001 0.005。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述有机氮源的浓度为 5 8。 3. 如权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所述有机氮源的浓度为 5.8 6.2。 4. 如权利要求 3 所述的方法， 其特征在于， 所述有机氮源的浓度为 6.0。 权 利 要 求 书 CN 101235406 B1/3 页 3 。

5、发酵法合成多粘菌素 E 的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种发酵法生物合成多粘菌素 E 的方法。 背景技术 0002 多粘菌素是由多粘芽孢杆菌 (bacillus polymyxa) 产生的， 由多种氨基酸和脂肪 酸组成的一族碱性环多肽类抗生素的总称。研究到目前为止已发现多粘菌素 A、 B、 C、 D、 E、 M 等多个组分中， 其中只有多粘菌素B(polymyxinB简称polymyxin)、 多粘菌素E(polymyxinE 简称 Colistin) 具有较低的毒性及良好的抗菌活力。因此对多粘菌素 B 和多粘菌素 E 研究 相对较多， 且目前已有相应的产品在临床上使用。 临床上常用它。

6、们的硫酸盐或甲磺酸盐， 其 中后者多用于非肠道给药途径， 在组织中水解出多粘菌素起作用。可用于治疗一些由革兰 氏阴性菌引起的脑膜炎、 痢疾等， 特别是它能抑制其他抗生素几乎没有作用的绿脓杆菌， 且 不产生耐药性， 因此它对防止烫伤和外科手术后感染绿脓杆菌及有耐药性的痢疾菌和由其 他革兰氏阴性菌引起的疾病等都有一定的临床意义。 0003 目前， 多粘菌素 E 的生产主要采用微生物发酵法进行生物合成， 但发酵单位相对 较低。其中， 对比文献 “多粘菌素 E 高产菌株的选育” ( 邢维玲， 周希贵等中国抗生素杂志 2002， 27(6) ： 326-327) 一文中披露了一种生物合成多粘菌素 E 的。

7、培养基， 其有机氮源为玉 米浆， 含量 0.03L/L 培养液， 有机氮源含量低， 因此发酵单位也较低， 为 16295U/ml。 发明内容 0004 本发明需要解决的技术问题是提高多粘芽孢杆菌发酵生物合成多粘菌素 E 的产 量。 0005 为此， 本发明提供一种发酵法合成多粘菌素 E 的方法， 包括将多粘芽孢杆菌 bacillus polymyxa AS1.541 接种于培养基中进行培养的步骤， 其特征在于， 所述培养基中 的有机氮源的浓度为 4 10。 0006 所述有机氮源的浓度优选为 5 8， 更优选为 5.8 6.2， 最优选为 6.0。 0007 本发明方法中的培养基包括碳源、 有。

8、机氮源、 无机氮源、 CaCO3以及微量元素等。 0008 优选地， 该培养基的有机氮源采用大豆分离蛋白、 豆粕、 玉米浆、 花生粉、 棉仔饼粉 或黄豆饼粉等。 0009 更优选地， 有机氮源采用大豆分离蛋白。 0010 该培养基所使用的碳源包括但不限于玉米粉、 淀粉、 葡萄糖和蔗糖， 优选淀粉 ； 培 养基中碳源的浓度为 1 6， 优选 2 4。 0011 所述 CaCO3在培养基中的浓度为 0.5 2.0， 优选 0.8 1.0。 0012 所述微量元素包括但不限于 Mg2+和 Mn2+的可溶性盐类， 其浓度通常为 0.001 0.005， 优选 0.002。 0013 本发明方法中， 最。

9、优选的培养基组分和重量百分比含量为 ： 淀粉 3， 大豆分离蛋 白 6， 硫酸铵 0.1， CaCO30.8， MgSO40.002， MnSO40.002， 余量为水。 说 明 书 CN 101235406 B2/3 页 4 0014 本发明方法中的培养基由于高含量有机氮源的独特配方， 因此所合成的多粘菌 素 E 的发酵单位得以大大提高。本发明方法发酵合成多粘菌素 E 的最高发酵单位可达 22143.7U/ml。 具体实施方式 0015 实施例 1 0016 按照以下配方配制本发明方法所使用的培养基， 其中培养基 a 为本发明的配方， 培养基 b 为对比文献的配方 ： 0017 培养基 a 。

10、： 大豆分离蛋白 60g， 淀粉 30g， 硫酸铵 1g， CaCO38g， MgSO47H2O 0.02g， MnSO4H2O 0.01g， 蒸馏水定容至 1L。 0018 培养基 b ： 玉米浆 0.03L， 淀粉 10.0g， 硫酸铵 8.0g， CaCO310.0g， 蒸馏水定容至 1L。 0019 其中培养基 a 和 b 均接入 AS 1.541 的种子培养物， 接种量 7， 0020 消前 pH 值调至 7.2 ； 温度 30 ； 装量 30ml/250ml ； 培养 40 小时后放瓶， 结果前者 得到 22143.7U/ml 多粘菌素 E， 后者得到 16295U/ml 多粘菌素。

11、 E。 0021 实施例 2 0022 将培养基 a 中的大豆分离蛋白 60g 换成大豆分离蛋白 40g， 结果得到 16452.1U/ml 多粘菌素 E。 0023 实施例 3 0024 将培养基 a 中的大豆分离蛋白 60g 换成大豆分离蛋白 100g， 结果得到 19072.3U/ ml 多粘菌素 E。 0025 实施例 4 0026 将培养基 a 中的大豆分离蛋白 60g 换成大豆分离蛋白 50g， 结果得到 18965.2U/ml 多粘菌素 E。 0027 实施例 5 0028 将培养基 a 中的大豆分离蛋白 60g 换成大豆分离蛋白 80g， 结果得到 19720.3U/ml 多粘。

12、菌素 E。 0029 实施例 6 0030 将培养基 a 中的大豆分离蛋白 60g 换成大豆分离蛋白 58g， 结果得到 21018.6U/ml 多粘菌素 E。 0031 实施例 7 0032 将培养基 a 中的大豆分离蛋白 60g 换成大豆分离蛋白 62g， 结果得到 21832.4U/ml 多粘菌素 E。 0033 实施例 8 0034 将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成花生粉60g， 结果得到10854U/ml多粘菌素 E。 0035 实施例 9 0036 将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成黄豆饼粉60g， 结果得到13456U/ml多粘菌 素 E。 0037 实施例 10 说 明 书 CN 101235406 B3/3 页 5 0038 将培养基 a 中的大豆分离蛋白 60g 换成豆粕 60g， 结果得到 14332U/ml 多粘菌素 E。 0039 实施例 11 0040 将培养基a中的大豆分离蛋白60g换成棉子饼粉60g， 结果得到11003U/ml多粘菌 素 E。 说 明 书 。