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1、(10)授权公告号 CN 101988070 B (45)授权公告日 2013.06.26 CN 101988070 B *CN101988070B* (21)申请号 200910140993.1 (22)申请日 2009.05.13 C12N 15/34(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (73)专利权人 中国水产科学研究院黄海水产研 究所 地址 266071 山东省青岛市南京路 106 号 (72)发明人 刘庆慧 黄捷 陈文博 梁艳 CN 1831009 A,2006.09.13, 全文 . Van Hulten,M.C. et al. AAK77787.1.GenB。
2、ank .2005, Van Hulten,M.C.et al. AF369029.2.GenBank .2005, (54) 发明名称 对虾白斑综合征病毒 VP292 多肽与应用 (57) 摘要 本发明利用对虾白斑综合征病毒 (WSSV) 基 因表达技术， 获得一种对虾白斑杆状病毒 WSV237 基因编码的蛋白起名VP292。 本发明还涉及VP292 的生产方法， VP292 多核苷酸和多肽的应用以及 与 VP292 多肽特异性结合的抗体。对该基因及其 表达产物的抑制可能是防治对虾白斑病的有效途 径之一， 有望运用于对虾白斑病的防治。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 姚进孝。
3、 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 (10)授权公告号 CN 101988070 B CN 101988070 B *CN101988070B* 1/1 页 2 1.一种能保护对虾抗WSSV感染的重组蛋白VP292作为饲料添加剂的应用， 其特征在于 所述 VP292 氨基酸序列如 SEQ ID NO.2 所述。 2. 一种能与权利要求 1 所述的 VP292 多肽特异性结合的抗体。 3. 一种疫苗， 包含药学可接受的载体和至少一种根据权利要求 2 的所述抗体。 权 利 要 求 书 CN。
4、 101988070 B 2 1/7 页 3 对虾白斑综合征病毒 VP292 多肽与应用 技术领域 0001 本发明涉及基因生物工程技术领域。具体地说， 本发明涉及对虾白斑综合征病毒 VP292的核苷酸序列， 还涉及由该核苷酸序列编码的一种多肽。 本发明还涉及这些多核苷酸 和多肽的应用， 以及所述多核苷酸和多肽的生产方法。 背景技术 0002 对虾白斑杆状病毒 (WSSV) 是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾 的主要病毒原之一， 它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾， 此外还可侵染淡水及海洋 生态系统中多种蟹类、 龙虾类、 端足类、 水蝇类等甲壳纲动物， 具有较广泛的宿主范围， 因此。
5、 它不仅严重危害对虾养殖， 还对海洋生态造成了影响。WSSV 是双链 DNA 病毒， 基因组全长 305Kb， 是迄今为止发现的最大的动物病毒 (J Virol.2001， 75 ： 11811-11820)。基因组序列 遗传及形态学特征都表明 WSSV 是一种新病毒， 它不属于目前已知的任一种病毒家族， 因此 国际病毒分类委员会将 WSSV 归属为新的 Whispovirus 属， Nimaviridae 种 (www.ncbi.nlm. nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm)。由于这是一个全新的病毒， 而且 WSSV 基因组较大， 所 以绝大多数 WSSV 病毒结构蛋。
6、白与其他病毒没有同源性， 因此这些蛋白的功能无法通过与 其他病毒蛋白的同源性分析进行预测， 因而使 WSSV 功能研究具有极大的难度。已有 20 余 个基因初步确证其功能， 尚有许多基因的功能未知。目前还难以对 WSSV 进行预防和控制， 一方面由于 WSSV 能在自然环境中存活长时间， 更重要的是人们对此病毒分子水平的了解 还很少。 0003 已有研究表明， 虽然对虾等无脊椎动物没有类似于脊椎动物的适应性免疫系 统， 但最新的研究发现， WSSV 的重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。Witteveldt， J 等人首先用 pET28 原核表达载体表达 VP28 蛋白用于制备亚单位疫苗， 。
7、试验结果效果 很好 (Witteveldt， J.， Cifuentes， C.C.， Vlak， J.M.， van Huhen， M.C.W.Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus by oralvaccination.J Viro1.2004.78(4) ： 2057-2061)。贾启军 ( 贾启军， 孟小林， 徐进平等 . 对虾白斑综合症病 毒囊膜蛋白 VP19 的融合表达及其抗病毒感染作用 .2006， 21(6) ： 585-588) 等人用 WSSV 囊 膜蛋白 VP19 免疫螯虾， 证实了 。
8、VP19 也可以作为亚单位疫苗应用于预防 WSSV。鉴于 VP28 和 VP19 都对白斑综合症病毒有很好的防治效果， 有些研究人员着手研究是否其他的一些结构 蛋白也可以对白斑综合症病毒产生免疫的效果。而结果也证实了当初的设想， 已经证实的 如 VP37， VP187 都可以有效地抑制白斑综合症病毒的感染 (Qing-hui Liu， Xiu-LiZhang， Cui-Yan Ma， Yan Liang， Jie Huang.VP37 of white spot syndrome virus interactwith shrimp cells.Letters in Applied Microb。
9、iology.2009.48 ： 44-50 ； Deng-Feng Li， Ming-Chang Zhang， Hai-Jie Yang， Yan-Bing Zhu， Xun Xu， -integrin mediatesWSSV infection.Virology.2007368 ： 122-132)。 0004 由于 WSSV 具有广泛的宿主范围， 在甲壳纲和昆虫纲动物中均有其敏感的宿主， 以 虾、 蟹等十足目类为多。 目前， 普遍认为WSSV存在水平传播(经口感染或浸泡感染)及垂直 说 明 书 CN 101988070 B 3 2/7 页 4 传播两种传播途径， 可独立在动物中流行， 。
10、因此难于在短期内彻底消除。而 WSSV 为暴发性 传染病， 该病感染率和死亡率都极高， 所以研究针对 WSSV 的全新预防用的安全有效疫苗， 实数当务之急。基因工程疫苗技术是一项新兴的具有应用前景的生物技术， 对 WSSV 囊膜蛋 白的表征为发展免疫途径预防 WSSV 感染提供技术方法。 发明内容 0005 本发明中的编码 VP292 序列是如此获得的。以纯化的 WSSV 基因组 DNA 作为模板。 根据 WSV237 序列设计合成 SEQ ID No.3 和 SEQ ID No.4 的序列作为引物， 经 PCR 扩增获得 了 WSV237 的部分序列 SED ID No.1 的序列。然后通过。
11、重组表达 WSV237 基因， 纯化 WSV237 基因的表达产物， 动物活体实验分析其在甲壳动物抗 WSSV 感染抑制的作用。在本发明被公 布之前， 尚没有任何人公开过本申请中涉及的 VP292 序列。 0006 本发明的目的是提供一种新的 WSSV 多肽， 它包括 ： 具有 SEQ ID No.2 氨基酸序列 的多肽， 或者其活性片段， 或其活性衍生物。较佳， 该多肽是具有 SEQID No.1 序列的多肽。 此蛋白被命名为 VP292。 0007 本发明的另一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的 VP292 的方法。 0008 本发明还提供了 VP292 的应用， 即蛋白疫苗， 其含有。
12、 VP292 编码序列， 以及药学上 可接受的载体。更明确的， 本发明的这种疫苗含有 SEQ ID No.2 中所述的氨基酸序列或其 衍生序列。 0009 此外， 本发明的核酸序列可以被用来制造核酸疫苗， 对甲壳动物进行接种， 以抗 WSSV 感染。载体疫苗包括活的减毒细菌或病毒疫苗， 以及药学上可接受的载体。 0010 在本发明的一个具体实施方案中， 本发明中分离的多核苷酸全长为 876 个核苷 酸， 其详细序列见 SEQ ID No.1， 其中开放阅读框位于 1-876 位核苷酸。 0011 另一方面， 本发明还包括对 VP292DNA 或是其片段编码的多肽能特异性相互作用 的多克隆抗体、。
13、 单克隆抗体及其它能抑制 VP292 基因产物或片段。 0012 本发明的技术方案如下 ： 0013 1.WSSV-VP292 基因的制备 ： 0014 (1) 采用酚 - 氯仿法提取 DNA。取 400l 纯化的病毒液， 加入 DNA 抽提缓冲液 5.3l， 0.5mol/L 的 EDTA(pH8.0)106.7l， 胰 RNA 酶 6.5ul 和 10 SDS 28l， 37下温 育 1h。加入蛋白酶 K(20mg/ml)4l， 50孵育 3-4h。用酚氯仿异戊醇 (25 24 1) 和氯仿各抽提 1 次， 乙醇沉淀， 收集 DNA， 用 TE 缓冲液稀释 DNA 至 100g/ml， 用。
14、于 PCR 反应 的模板。 0015 (2)PCR扩增VP292基因 ： 以病毒DNA为模板， PCR扩增目的基因VP292。 PCR反应条 件为 ： 20l反应体系中含双蒸水14L， 2.5L 10 x PCR buffer， 0.5L25mmol/L MgCl2， 1L dNTPs， 上、 下游引物各 0.5L， 0.5L Taq DNA 聚合酶 (5U/L)， 0.5L 模板。PCR 反 应条件 ： 94 10min， 94 30s， 51.0 30s， 72 1min(8 个循环 )， 94 30s， 56.2 30s， 72 1min(30 个循环 )， 72 10min。取 2l 。
15、PCR 产物作 1琼脂糖凝胶电泳， PCR 产物应 在约 876bp 处有一条扩增带。 0016 2. 重组体的构建 ： 0017 (1) 表达载体的构建 ： 用 XhoI 和 Hind III 对 VP292 基因片段和质粒 pBAD/gIIIA 说 明 书 CN 101988070 B 4 3/7 页 5 进行双酶切， 酶切体系见下表， 酶切条件为 ： 37水浴 2h， 65加热 5min， 等体积酚 ： 氯仿抽 提， 无水乙醇沉淀DNA。 纯化的酶切片段经过16连接过夜， 然后转化到大肠杆菌Top10中， 筛选重组体， 提取重组载体质粒， 进行双酶切并对该重组载体质粒进行测序鉴定。 00。
16、18 质粒的双酶切体系 ： 0019 0020 (2) 目的产物 VP292 的表达 ： 挑重组体单菌落接种到含 50g/ml Amp 的新鲜 LB 液体培养基中， 37培养 8 10h， 之后按 1接种到新鲜的 LB( 含 50g/mlAmp) 液体培养 基中， 37培养到 OD 值为 0.6 时加终浓度为 0.4mmol/L 的阿拉伯糖诱导， 10000g， 4， 离心 10min， 收集菌体， 用 10mM PBS(pH 8.0) 重悬菌体， 超声破碎， 离心收集上清和沉淀。将收集 的上清和沉淀， 进行 SDS-PAGE 和 Western-blot。 0021 (3) 纯化 VP292。
17、 ： 以优化后的条件扩大培养重组基因工程菌， 超声波破碎后， 离 心 (10000g， 4， 10min) 将得到的裂解物沉淀收集， 镍琼脂糖凝胶装柱， 用缓冲液 (50mM PBS， pH7.4， 0.5M NaCl) 平衡 2-5 个床体积， 将收集的沉淀重悬 (50mM PBS， pH7.4， 0.5M NaCl)0.45m滤膜过滤， 上样流速1ml/min， 选择在50mM的咪唑缓冲液的阶段选择洗脱， 收 集。 0022 3.动物活体实验分析VP292在甲壳动物抗WSSV感染抑制的作用 ： 将表达的VP292 多肽片段以 2-5 (W/W) 的比例均匀加入普通饵料中制成药饵， 挑选体重。
18、 2-5g 的健康的凡 钠缤对虾， 随机分为 3 个处理组， (a.VP292 组， b. 阳性对照组， c. 阴性对照组 )， 各实验组 分别投喂各种饲料， 连续喂 7 天， 然后分别投喂 ( 除阴性对照组外 )WSSV 感染致死的剪碎螯 虾， 记录各组死亡率。 0023 在本发明中， 术语 “编码 VP292 序列” 是指编码具有 WSV237 蛋白多肽的核苷酸序 列 (SEQ ID No.2)。 0024 该术语还包括能编码具有与VP292相同功能的蛋白的、 SEQ ID NO.1序列的变异形 式。这些形式包括 ： 若干个 ( 通常为 1-90 个， 较佳地 1-60 个， 更佳地 1-。
19、20 个， 最佳地 1-10 个 ) 核苷酸的缺失、 插入和 / 或取代， 以及在 5 和 / 或 3 添加数个 ( 通常为 60 个以内， 较 佳地为 30 个以内， 更佳地 10 个以内， 最佳的 5 个以内 ) 核苷酸。 0025 在本发明中，“纯化” VP292 是指其至少占样品总物质的至少 50， 较佳地至少 75， 更佳地至少 90 ( 按干重或湿重计 )。纯化可以用任何合适的方法进行测量， 如用柱 层析、 PAGE 或 HPLC 测量多肽的纯度。 0026 在本发明中， 术语 “VP292” 指具有基因调控活性的 SEQ ID NO.2 的多肽。该术语 还包括具有基因调控功能的、。
20、 SEQ ID NO.2 序列的变异形式。这些变异形式包括 ( 但不限 于 ) ： 若干个 ( 通常为 1-50 个， 较佳地 1-30 个， 更佳地 1-20 个， 最佳的 1-10 个 ) 核苷酸的 缺失、 插入和 / 或取代， 以及在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个或数个 ( 通常为 30 个以内， 较 说 明 书 CN 101988070 B 5 4/7 页 6 佳地为 10 个以内， 更佳地 5 个以内 ) 氨基酸。例如， 在本领域中， 用性能相近或相似的氨基 酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。又比如， 在 C 末端和 / 或 N 末端添加一个或数 个氨基酸通常也不会改。
21、变蛋白质的功能。该术语还包括 VP292 多肽的活性片段和活性衍生 物。 该多肽的变异形式包括 ： 同源序列、 等位变异体、 天然突变体、 诱导突变体、 修饰形式、 在 高或低的严谨度条件下能与 WSV292DNA 杂交的 DNA 所编码的蛋白、 以及利用抗 VP292 多肽 的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其它多肽， 如包含 VP292 多肽或片段的融合 蛋白。 0027 在本发明中， 术语 “WSSV 感染抑制” 是指在易感对虾白斑综合征病毒 (WSSV) 的动 物中， WSSV 感染的发生率和严重程度的降低， 如降低动物死亡数量。如果相对于对照群体， VP292 降低感染性至 1。
22、0， 通常至少 20， 较好至少 50或更高时即达到 WSSV 感染抑制。 0028 在本发明中， 术语 “甲壳动物” ， 通常指 “虾” ，“螃蟹” 和 “龙虾” 甲壳动物。 0029 本发明还提供 VP292 蛋白多肽的类似物， 这些类似物与天然 VP292 多肽的差别可 以是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而有之。 这些 多肽包括天然或诱导的遗传突变体， 诱导变异体可以通过各种技术得到， 如通过辐射或暴 露于诱变剂而产生的随机诱变， 还可通过定点诱变法或其他已知的分子生物学技术。类似 物还包括具有不同于天然 L- 氨基酸的残基 ( 如 D- 氨基酸 )。
23、 的类似物， 以及具有非天然存 在的或合成的氨基酸 ( 如 - 氨基酸 ) 类似物。应理解， 本发明的多肽并不限于上述列举的 代表性多肽。 0030 本发明中， 可选用本领域已知的各种载体， 如市售的载体。 0031 本发明中， 术语 “宿主细胞” 包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例 子包括大肠杆菌、 枯草杆菌等。 常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、 昆虫细胞和哺乳动物细 胞。 0032 在本申请的说明书和附图中， 用于表示碱基 ( 核苷酸 )， 氨基酸等的缩写是由生化 命名 IUPAC-IUB 委员会推荐的那些和本领域常用的那些， 说明如下 ： 0033 DNA ： 脱氧核糖核酸 。
24、； A ： 腺嘌呤 ； T ： 胸腺嘧啶 ； G ： 鸟嘌呤 ； C ： 胞嘧啶 ； 0034 G， Gly ： 苷氨酸 ； A， Ala ： 丙氨酸 ； V， Val ： 缬氨酸 ； L， Leu ： 亮氨酸 ； I， Ile ： 异亮氨 酸 ； S， Ser ： 丝氨酸 ； T， Thr ： 苏氨酸 ； C， Cys ： 半胱氨酸 ； M， Met ： 甲硫氨酸 ； E， Glu ： 谷氨酸 ； D， Asp ： 天门冬氨酸 ； K， Lys ： 赖氨酸 ； R， A ： g ： 精氨酸 ； H， His ： 组氨酸 ； F， Phe ： 苯丙氨酸 ； Y， Tyr ： 酪氨酸 ； W， 。
25、Trp ： 色氨酸 ； P， Pro ： 脯氨酸 ； N， Asn ： 天冬酰胺 ； Q， Gin ： 谷酰胺。 附图说明 0035 图 1 PCR 扩增 WSSV-VP292 0036 图 1 说明如下 ： Lane 1 ： VP292gene ； Lane-M ： DNA marker. 0037 图 2 重组质粒的双酶切核酸电泳图 0038 图 2 说明如下 ： Lane1 ： DNAMarker DL15000， Lane 2 ： 重组质粒双酶切， Lane 3 ： 重 组质粒， Lane 4 ： DNA Marker DL2000. 0039 图 3 重组 VP292 及表达纯化的 。
26、SDS-PAGE 图谱 0040 图 3 说明如下 ： 1， 阿拉伯糖诱导的空载质粒菌株 ； 2， ， 3 重组质粒包涵体上清 ； 4 和 5， 重组质粒包涵体沉淀 ； M， Marker ； 说 明 书 CN 101988070 B 6 5/7 页 7 0041 图 4 Westem-bloting 分析表达的 VP292 0042 图4说明如下 ： 1， 重组质粒包涵体沉淀， Lane 2 ： 重组质粒包涵体上清， Lane 3 ： 空 载体对照 具体实施方式 0043 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注。
27、明具体条件的实验方法， 通常按照常 规条件如 Sambrook 等， 分子克隆 ： 实验室手册 New York ： Cold SpringHarbor Laboratory Press， 2001) 中所述的实验条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 0044 实施例 1WSV254 基因片段的克隆和测序 0045 以 WSSV 基因组 DNA 为模板， 用引物 P1、 P2 扩增 WSV237 基因部分片段。 0046 P1 ： 5 -TTACTCGAGATGTTGTTTGATTTCT-3 ； 0047 P2 ： 5 GACAAGCTTTAATACGGGACCT-3 ； 0048 划线部分 。
28、CTCGAG 为 Xhol 酶切位点， AAGCTT 为 HindIII 酶切位点， 0049 PCR 反应条件为 ： 0050 94 10 分钟 0051 94 30 秒 0052 44.2 30 秒 0053 72 1 分钟 (8 个循环 ) 0054 94 30 秒 0055 51.7 30 秒 0056 72 1 分钟 (30 个循环 ) 0057 72 10 分钟 0058 琼脂糖凝胶电泳纯化扩增片段后， 克隆到原核表达质粒载体 pBAD/gIIIA， 获 得重组表达质粒 pBAD/gIIIA-rVP292， 进行测序， 测序所得 WSV237 部分基因序列详见 SEQIDNo.1.。
29、 0059 根据得到的核苷酸序列推导出的 WSV237 的氨基酸序列， 共 292 个氨基酸残基， 其 氨基酸序列详见 SEQIDNo.2. 0060 实施例 2 重组 VP292 片段的表达与纯化 0061 将含有WSV237基因的重组表达质粒pBAD/gIIIA-VP292转化大肠杆菌TOP10， 选取 阳性克隆在含 100mg/L 氨苄霉素的 LB 培养基中 37摇培至 OD600 0.6 时， 加入 L- 阿拉伯 糖至终浓度0.2， 37诱导5h后收集菌体。 加入冰冷的裂解缓冲液(1PBS， 10mMNaHPO4， 140mMNaCl， 2.7mM KCL， 1.8mMKH2HPO4)。
30、， 超声裂解细菌 (300W10s10 次 )， 4 15,000rpm 离心 20min， 装镊柱 (Ni-nitriloacetic acid resins)， 用 5-10 个柱床体积的洗涤缓冲液 (1PBS) 洗去杂蛋白 ； 洗脱缓冲液 (50mM Tris-HCL， 100mM， 咪唑， pH 8.0) 洗脱目的蛋白。 用 SDS-PAGE 鉴定纯化的蛋白的分子量约为 12.09kD， 纯度达 90以上。结果见图 1。 0062 实施例 3 重组 VP292 片段的抗体制备 0063 将实施例 2 中获得的纯化的重组蛋白用等体积的完全 Freund s 佐剂乳化， 用 0.25-0.。
31、5mg/mL 乳化过的蛋白对小鼠进行皮下注射， 每只 0.2mL。2 周后用不完全 Freund s 说 明 书 CN 101988070 B 7 6/7 页 8 佐剂乳化的同样剂量的相同抗原再注射以加强免疫产生抗体， 之后每隔 10 天加强免疫一 次， 至少进行 2 次。分析所获抗血清的滴度和特异性。 0064 在阅读了本发明的上述内容后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修 改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 0065 实施例 4 ： 使用 VP292 蛋白片段对 WSSV 感染的抑制 0066 (1)药饵制作 ： 将表达的VP292多肽片段以2-5(W/W。
32、)的比例均匀加入普通饵料 中制成药饵， 晾干后封存， 备用。 0067 (2) 实验动物分组 ： a.VP292 组， b. 阳性对照组， 投喂普通饵料 ； c. 阴性对照组， 投 喂普通饵料。挑选体重 2-5g 的健康凡纳滨对虾， 随机分为 3 个处理组， 每个实验组 3 个重 复， 每组 20 尾， 实验前暂养 7 天。 0068 (3) 动物实验 ： 各实验组分别投喂各种饲料， 连续喂 7 天， 然后分别投喂 ( 除阴性 对照组外 )WSSV 感染致死的剪碎螯虾， 记录各组死亡率。 0069 在 22-26条件下的养殖结果显示， VP292 蛋白组的对虾感染 7d 后的累积死亡率 为80。
33、， 阳性对照组的对虾在感染7天后累积死亡率达到100， 阴性对照组对虾无任何死 亡现象。 0070 序列表 0071 1.1.SEQ ID No.1 的信息 0072 (1) 序列特征 ： 0073 长度 ： 876bp 0074 类型 ： 核酸 0075 链性 ： 双链 0076 拓扑结构 ： 线性 0077 (2) 分子类型 ： DNA 0078 (3) 序列描述 ： SEQ ID No.1 0079 1 atgttgtttg atttctttct aaaaatggct gctgcaaaaa tggacgctat ccttgcggat 0080 61 attaatggga atgataca。
34、ga tttatccaag ctaatcacag acgtgattca aaagagagcc 0081 121 aaggctgtca tggatagaaa tagggctaaa atggacatga atagaagagt agatgaggct 0082 181 attcaggaag ccgtagcggc caagaaacaa aaagcattag tggtatttga taaactcgtg 0083 241 gaagaaactg acagcggaca aagtgtccct ccaacattat cgggatccga ttacgacgcg 0084 301 tgggtagaca gagccatg。
35、cc ttcgcatatt gaacttgtag agagtgttga gggagattct 0085 361 ttgtatgata aactccctcc ttttaacgta caagacatag acgaccaaat cggtgatgag 0086 421 atagatacac caatatctta ccttgccatg gtagtggtaa aagtcgactg tgaaactggg 0087 481 gatatcgaag aagagtacaa tcttgctcct acctttggtg tgacacaaaa taataaaata 0088 541 tacagagatg aaagagac。
36、ca gatttttaca aaggctgata aatctgtgcg tatttttaaa 0089 601 cttgctaaat tggatagtat atcaggtaaa agtagacaac tgacgtatgc ggtaaaaaat 0090 661 aacaatgaat atacagagtt tgtctgtagc gtctttgcag agtttgaatc tgacagtgac 0091 721 actactaaat caggtatagg tattcgtgaa tatgacaaac ctaaaaatga attcgaatat 0092 781 gaggagcgag agatcttt。
37、ac attttttatt ccaatacaac ccgcagggac gaaattattg 0093 841 ttatactttt tggtggacgt caggtcccgt attatatag 说 明 书 CN 101988070 B 8 7/7 页 9 0094 2.SEQ ID No.2 的信息 0095 (1) 序列特征 ： 0096 长度 ： 292 个氨基酸 0097 类型 ： 氨基酸 0098 拓扑结构 ： 线性 0099 (2) 分子类型 ： 蛋白质 0100 (3) 序列描述 ： SEQ ID No.2 0101 1 mlfdfflkma aakmdailad ingndt。
38、dlsk litdviqkra kavmdmrak mdmnrrvdea 0102 61 iqeavaakkq kalvvfdklv eetdsgqsvp ptlsgsdyda wvdrampshi elvesvegds 0103 121 lydklppfnv qdiddqigde idtpisylam vvvkvdcetg dieeeynlap tfgvtqnnki 0104 181 yrderdqift kadksvrifk lakldsisgk srqltyavkn nneytefvcs vfaefesdsd 0105 241 ttksgigire ydkpknefey eereiftf。
39、fi piqpagtkll lyflvdvrsr ii 0106 3.SEQ ID No.3 的信息 0107 (1) 序列特征 0108 A. 长度 ： 25bp 0109 B. 类型 ： 核酸 0110 C. 链性 ： 单链 0111 D. 拓扑结构 ： 线性 0112 (2) 分子类型 ： 寡核苷酸 0113 (3) 序列描述 ： SEQ ID No.3 0114 TTACTCGAGATGTTGTTTGATTTCT 0115 4.SEQ ID No.4 的信息 0116 (1) 序列特征 0117 E. 长度 ： 22bp 0118 F. 类型 ： 核酸 0119 G. 链性 ： 单链 0120 H. 拓扑结构 ： 线性 0121 (2) 分子类型 ： 寡核苷酸 0122 (3) 序列描述 ： SEQ ID No.4 0123 GACAAGCTTTA ATACGGGACCT 说 明 书 CN 101988070 B 9 1/1 页 10 图 1. 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101988070 B 10 。