技术领域
本发明涉及食品加工领域，特别是一种类胡萝卜素几何异构体的超声波制备方法，能用于功能性食品中活性成分的构效分析。
背景技术
类胡萝卜素具有多种生物活性，其中有些类胡萝卜素是人体组织器官的重要组成成分，如叶黄素是视网膜黄斑的组成成分，摄入不足可能会导致老年性黄斑衰退症(AMD)，而老年性黄斑衰退症是西方国家导致老年人视力下降的主要疾病(Perera，C.O.，&Yen，G.M.Functional properties of carotenoids in human health.International Journal of Food Properties，2007，10(2)：201-230)。有些类胡萝卜素是微量营养素VA的来源，目前世界上仍有2亿的儿童患有VA的缺乏症(陈君石，韩蕃璠.《新营养科学》浅析[J].营养学报，2006，28(6)：461-467)。类胡萝卜素除了能够解决上述的营养缺乏症外，还具有多种生物活性，如抗氧化(Oshima，S.，Ojima，F.，Sakamoto，H.，Ishiguro，Y.，&Terao，J.Supplementationwith carotenoids inhibits singlet oxygen-mediated oxidation of human plasma low-densitylipoprotein.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44(8)：2306-2309)、抗癌(Rao，A.V.，&Rao，L.G. Carotenoids and human health.Pharmacological Research，2007，55(3)：207-216)、保护眼睛(Handelman，G.J.The evolving role of carotenoids in human biochemistry.Nutrition，2001，17(10)：818-822；马乐，林晓明.叶黄素干预对长期荧屏光暴露者视功能的影响.营养学报，2008，30(5)：438-442)、保护皮肤(Roberts，R.L.，Green，J.，&Lewis，B.Lutein and zeaxanthin in eye and skin health.Clinics in Dermatology，2009，27(2)：195-201；González，S.，Astner，S.，Wu，A.，Goukassian，D.，&Pathak，M.Dietary lutein/Zeaxanthindecreases ultraviolet B-induced epidermal hyperproliferation and acute inflammation inhairless mice.Journal of Investigative Dermatology，2003，121：399-405)等多种生物活性。
类胡萝卜素在果蔬中主要是以全反式的β-carotene的形式存在。但是由于聚异戊二烯不饱和结构导致其不稳定性，在其提取分离、加工贮存过程中如果条件不当极易发生异构化。如胡萝卜中β-carotene在热风干燥、真空干燥和压过热蒸汽干燥三种方法中发生降解，且在真空干燥和压过热蒸汽干燥中异构化为13-cis-β-carotene的比率大于热风干燥的异构化比率，但总的降解率却低于热风干燥的总降解率(Hiranvarachat，B.，Suvamakuta，P.，&Devahastin，S.Isomerisation kinetics and antioxidant activities of β-carotene in carrotsundergoing different drying techniques and conditions[J].Food Chemistry，2008，107(4)：1538-1546.)。胡萝卜汁在酸化过程中β-carotene未发生异构化，但是在罐装和贮藏过程中异构化为13-cis-β-carotene(Chen，H.E.，Peng，H.Y.，&Chen，B.H.Stability of carotenoidsand vitamin A during storage of carrot juice.Food Chemistry，1996，57(4)：497-503.)。固态的β-carotene在90℃和140℃加热时发生异构化(Qiu，D.，Chen，Z.R.，&Li，H.R.Effect ofheating on solid β-carotene.Food Chemistry，2009，112(2)：344-349.)。
而异构化的类胡萝卜素会引起物理化学、色度、营养价值、和生物活性的改变。物理化学特性方面，顺式的类胡萝卜素会引起热稳定性下降、熔点降低、溶解性增大、光谱特征改变(产生新的吸收峰)(Schieber，A.，Carle，R.Occurrence ofcarotenoid cis-isomers in food：Technological，analytical，and nutritional implications.Trends in Food Science&Technology，2005，16：416-422)。色度方面会引起颜色的下降，影响食品的感官品质。营养价值方面13-cis-beta-carotene和9-cis-beta-carotene在VA活性方面分别下降为全反式的53％和38％(Minguez-Mosquera，M.I.，Hornero-Mendez，D.，&Perez-Galvez，A.(2002).Carotenoids andprovitamin A in functional foods.In W. J.Hurst(Ed.)，Methods of analysis for functional foodsand nutraceuticals(pp.101-157).Boca Raton，London，New York，Washington，DC：CRCPress.)。生物活性方面，如全反式的β-carotene的生物利用率要高于9-cis-beta-carotene和13-cis-beta-carotene(Deming，D.M.，Teixeira，S.R.，Erdman，J.W.All-trans-β-caroteneappears to be more bioavailable than 9-cis or 13-cis-β-carotene in gerbils given single oral dosesofeach isomer.Journal ofNutrition，2002，132，2700-2708.)，但是异构化的番茄红素的生物利用率要高于反式的番茄红素(Unlu，N.Z.，Bohn，T.，Francis，D.M.，Nagaraja，H.N.，Clinton，S.K.Schwartz，S.J.Lycopene from heat-induced cis-isomer-rich tomato sauce is morebioavailable than from all-trans-rich tomato sauce in human subjects.，British Journal ofNutrition(2007)，98，140-146)。在抗氧化活性方面研究，异构化的β-胡萝卜素的抗氧化活性与全反式的β-胡萝卜素的相比没有明显的变化，但是部分异构化后的番茄红素与全反式的番茄红素相比抗氧化活性提高(Bohm，V.，Puspitasari-Nienaber，N.L.，Ferruzzi，M.G.，Schwartz，S.J.Trolox equivalent antioxidant capacity of different geometrical isomers ofα-Carotene，β-carotene，lycopene，and zeaxanthin，Journal of agricultural and foodchemistry，2002，50，221-226)。
虽然关于类胡萝卜素异构体对生物活性的研究有所涉及，但是研究还不够深入，目前除了抗氧化活性外其它的活性大部分没有深入开展。制约此研究的关键是目前仍没于商业化的关于各种类胡萝卜素的异构体。因此实验中有效的制备类胡萝卜素异构体的方法至关重要。目前文献中报道的制备类胡萝卜素异构体的方法主要有碘催化的光照法(Bohm，V.；Puspitasari-Nienaber，N.L.；Ferruzzi，M.G.；SCHWARTZ，S.J.Trolox Equivalent AntioxidantCapacity of Different Geometrical Isomers of r-Carotene，Carotene，Lycopene，and Zeaxanthin，Journal ofagricultural and food chemistry，2002，50，221-226)和以二氯甲烷溶剂的四氯化肽催化法(Rajendran，V；Chen，B.H.Isomerization of β-carotene by titanium tetrachloridecatalyst，Journal ofchemical sciences，2007，119(3)：253-258)。但是通过对国内外专利及文献的检索，我们没有发现用超声波催化类胡萝卜素几何异构体的研究和报导。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种类胡萝卜素几何异构体的超声波制备方法，采用该方法能有效获得不同种类和数量的类胡萝卜素几何异构体。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种类胡萝卜素几何异构体的超声波制备方法，包括以下步骤：
1)、以全反式类胡萝卜素作为原料，以二氯甲烷为溶剂，配置成全反式类胡萝卜素浓度为9～11μg/ml的类胡萝卜素溶液；
2)、将25～35ml的类胡萝卜素溶液放入容器中，利用20khz的探头式脉冲超声波进行处理，处理过程如下：探头插入液下1cm，液面高度保持5～8cm，脉冲时间为2～5s，占空比为50％～90％，温度-5～25℃，声强60.51～544.59W/cm2，处理时间5～20分；
3)、将步骤2)所得的产物采用C30类胡萝卜素色谱柱进行常规色谱分离，得类胡萝卜素几何异构体；
上述步骤1)～步骤3)均采取避光操作。
作为本发明的类胡萝卜素几何异构体的超声波制备方法的改进：当步骤2)处理温度为-5～15℃，得单一的类胡萝卜素异构体；当处理温度为15.5～25℃，得至少2种的类胡萝卜素异构体。
作为本发明的类胡萝卜素几何异构体的超声波制备方法的进一步改进：全反式类胡萝卜素为胡萝卜素、叶黄素、番茄红素、玉米黄素或隐黄质。
作为本发明的类胡萝卜素几何异构体的超声波制备方法的进一步改进：步骤2)中容器为棕色容器，采用低温恒温槽来控制温度。
在本发明的制备方法中，当步骤2)中的理温度为-5～15℃，得到的是单一的类胡萝卜素异构体；且处理时间在10分钟内异构化的速率大于降解的速率，并且在60.51-544.59W/cm2的范围内，声强的增大可以缩短作用时间。
当步骤2)中的处理温度为15.5～25℃，可以得若干种的类胡萝卜素异构体；且作用时间在20钟时内降异构化的速率大于降解的速率，并且在60.51-544.59W/cm2的范围内，声强的增大可以缩短作用时间。
采用本发明方法制备而得的类胡萝卜素几何异构体，可用以下方法来判断所得类胡萝卜素几何异构体的具体种类：
用DAD扫描210到600nm范围内β-carotene几何异构体的紫外可见光谱，几何异构体根据紫外可见光谱的数据所得的Q值和文献数据进行判断，Q值指的是紫外可见光谱中最低波长的吸收值与中间波长吸收值的比值，其中最低波长的吸收峰是当双键中存在顺式构型时的顺式峰的吸收峰。
本发明的类胡萝卜素几何异构体的超声波制备方法，具有如下优点：
1、本发明可对超声波作用的声强、温度、作用时间进行调整，因此可以有效控制产生异构体的种类和数量。
2、本发明具有高效、易控制异构化和降解比率的优点。
本发明采用超声波制备类胡萝卜素异构体，只需要10分钟之内就可以制得所需要的异构体，并且可以通过调节温度来制得所需要的异构体和降解比率；但是现有技术中的碘化的光照法和二氯甲烷溶剂的四氯化肽催化法的制备时间较长，而且异构体的种类不易控制，降解比率不易控制。
3、所得几何异构体适合功能食品中各种类胡萝卜素的立体异构对生物活性功效的评价。
具体实施方式
实施例1、β-胡萝卜素几何异构体的超声波制备方法，依次进行以下步骤：
1)、称取5mg全反式β-胡萝卜素；以二氯甲烷为溶剂，用500ml容量瓶配制10.0μg/ml的β-carotene溶液；即每mlβ-carotene溶液中含有10.0μg的全反式β-胡萝卜素；
2)、取30ml的β-carotene溶液加入到棕色样品玻璃管中，用探头式脉冲超声波(20khz，10mm探头)处理，处理过程中用低温恒温槽控制温度，具体设置如下：探头插入液下1cm，液面高度保持6cm，脉冲时间为2s，占空比为66.7％，温度-5℃，声强302.55W/cm2，处理时间10分钟。
3)、将步骤2)所得的产物进行色谱分离；具体步骤和条件如下：
采用C30类胡萝卜素色谱柱，柱温设为35℃，流速设为1.0ml/min。采用梯度洗脱的方法，由甲醇和二氯甲烷组成流动相。以下A代表甲醇，所述％为体积％。
80％A，0-5min；80-78％A，in 5-7.5min；78-66％A，in 7.5-18.5min；66％A，18.5-21min。百分比中省略的为二氯甲烷。双波长紫外检测器的检测波长为455和480nm。在保留时间14分钟的时候分离出一种几何异构体。
4)、β-carotene几何异构体的鉴定
用DAD扫描了210到600nm范围内β-carotene几何异构体的紫外可见光谱，几何异构体根据紫外可见光谱的数据所得的Q值和文献数据进行判断，Q值指的是紫外可见光谱中最低波长的吸收值与中间波长吸收值的比值，其中最低波长的吸收峰是当双键中存在顺式构型时的顺式峰的吸收峰。用上述方法鉴定所得到的异构为15-cis-β-carotene。
上述步骤均采取避光操作。
实施例2、β-胡萝卜素几何异构体的超声波制备方法，依次进行以下步骤：
1)、称取5mg全反式β-胡萝卜素；以二氯甲烷为溶剂，用500ml容量瓶配制10.0μg/ml的β-carotene溶液；即每ml β-carotene溶液中含有10.0μg的全反式β-胡萝卜素；
2)、取30ml的β-carotene溶液加入到棕色样品玻璃管中，用探头式脉冲超声波(20khz，10mm探头)处理，处理过程中用低温恒温槽控制温度，具体设置如下：探头插入液下1cm，液面高度保持6cm，脉冲时间为2s，占空比为50％，温度25℃，声强60.51W/cm2，处理时间20分钟。
3)、将步骤2)所得的产物进行色谱分离，具体步骤和条件如下：
采用C30类胡萝卜素色谱柱，柱温设为35℃，流速设为1.0ml/min。采用梯度洗脱的方法，由甲醇和二氯甲烷组成流动相。以下A代表甲醇，所述％为体积％。
80％A，0-5min；80-78％A，in 5-7.5min；78-66％A，in 7.5-18.5min；66％A，18.5-21min；百分比中省略的为二氯甲烷。双波长紫外检测器的检测波长为455和480nm。得到2种异构体，保留时间分别为14和19分钟。
4)、β-carotene几何异构体的鉴定
用DAD扫描了210到600nm范围内β-carotene几何异构体的紫外可见光谱，几何异构体根据紫外可见光谱的数据所得的Q值和文献数据进行判断，Q值指的是紫外可见光谱中最低波长的吸收值与中间波长吸收值的比值，其中最低波长的吸收峰是当双键中存在顺式构型时的顺式峰的吸收峰。经上述方法鉴定保留时间为14分钟时得到的异构体为15-cis-β-carotene，保留时间为19分钟时得到的异构体为9，13-cis-β-carotene。
上述步骤均采取避光操作。
实施例3、番茄红素几何异构体的超声波制备方法，依次进行以下步骤：
1)、称取5mg全反式番茄红素(lycopene)；以二氯甲烷为溶剂，用500ml容量瓶配制10.0μg/ml的lycopene溶液；即每ml lycopene溶液中含有10.0μg的全反式番茄红素；
2)、取30ml的lycopene溶液加入到棕色样品玻璃管中，用探头式脉冲超声波(20khz，10mm探头)处理，处理过程中用低温恒温槽中控制温度，具体设置如下：探头插入液下1cm，液面高度保持6cm，脉冲时间为2s，占空比为50％，温度5℃，声强60.51W/cm2，处理时间8分。
3)、将步骤2)所得的产物进行色谱分离，具体步骤和条件如下：
采用C30类胡萝卜素色谱柱，柱温设为35℃，流速设为1.0ml/min。采用梯度洗脱的方法，由甲醇和二氯甲烷组成流动相。以下A代表甲醇，所述％为体积％。
85％A，0-5min；85-75％A，in 5-10min；75-70％A，in 10-15min；70-65％A，in15-20min；65％A；in 20-25min；百分比中省略的为二氯甲烷。双波长紫外检测器的检测波长为467和510nm。其中保留时间为12分钟，得到一种几何异构体。
4)、lycopene几何异构体的鉴定
用DAD扫描了210到600nm范围内lycopene几何异构体的紫外可见光谱，几何异构体根据紫外可见光谱的数据所得的Q值和文献数据进行判断，Q值指的是紫外可见光谱中最低波长的吸收值与中间波长吸收值的比值，其中最低波长的吸收峰是当双键中存在顺式构型时的顺式峰的吸收峰。经鉴定为13-cis-lycopene。
上述步骤均采取避光操作。
实施例4番茄红素几何异构体的超声波制备方法，依次进行以下步骤：
1)、称取5mg全反式番茄红素(lycopene)；以二氯甲烷为溶剂，用500ml容量瓶配制10.0μg/ml的lycopene溶液；即每ml lycopene溶液中含有10.0μg的全反式番茄红素；
2)、取30ml的lycopene溶液加入到棕色样品玻璃管中，用探头式脉冲超声波(20khz，10mm探头)处理，处理过程中用低温恒温槽中控制温度，具体设置如下：探头插入液下1cm，液面高度保持6cm，脉冲时间为2s，占空比为50％，温度25℃，声强60.51W/cm2，处理时间18分钟。
3)、将步骤2)所得的产物进行色谱分离，具体步骤和条件如下：
采用C30类胡萝卜素色谱柱，柱温设为35℃，流速设为1.0ml/min。采用梯度洗脱的方法，由甲醇和二氯甲烷组成流动相。以下A代表甲醇，所述％为体积％。
85％A，0-5min；85-75％A，in 5-10min；75-70％A，in 10-15min；70-65％A，in 15-20min；65％A，in 20-25min；百分比中省略的为二氯甲烷。双波长紫外检测器的检测波长为467和510nm。得到3种几何异构体，保留时间分别为12、15、19分钟。
4)、lycopene几何异构体的鉴定
用DAD扫描了210到600nm范围内lycopene几何异构体的紫外可见光谱，几何异构体根据紫外可见光谱的数据所得的Q值和文献数据进行判断，Q值指的是紫外可见光谱中最低波长的吸收值与中间波长吸收值的比值，其中最低波长的吸收峰是当双键中存在顺式构型时的顺式峰的吸收峰。经鉴定保留时间分别为12、15、19分钟时分别对应得到13-cis-lycopene，5-cis-lycopene，13-cis-lycopene.
上述步骤均采取避光操作。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。