一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法及装置.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410707828.0 (22)申请日 2014.11.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104388300 A (43)申请公布日 2015.03.04 (73)专利权人 山东师范大学 地址 250014 山东省济南市历下区文化东 路88号 (72)发明人 唐波李忠义李清岭 (74)专利代理机构 济南日新专利代理事务所 37224 代理人 刘亚宁 (51)Int.Cl. C12M 1/00(2006.01) 审查员 银欢 (54)发明名称 一种用于单细。

2、胞定量分析的微流控连续进 样方法及装置 (57)摘要 本发明公开了一种用于单细胞定量分析的 微流控连续进样方法和装置。 这种方法和装置是 以十字通道上引入辅助聚焦通道的微流控芯片 为操作平台， 以芯片通道末端五个宽贮液池中一 定体积比的样品或电泳缓冲液提供的静压力和 四路程控直流电压提供的电动为流体操控手段, 来实现微流控芯片上多个微通道内样品和试剂 的平行化处理、 皮升级进样体积控制和连续进样 操作。 特别是， 所公开的这种方法和装置， 不仅可 以提供微流控芯片上一次单细胞进样的3步操作 即细胞上样、 单细胞装载/捕获、 单细胞溶膜及电 泳分离， 而且一次进样完成后， 自动重复上述3步 操作。

3、， 实现单细胞连续进样。 权利要求书2页 说明书7页 附图5页 CN 104388300 B 2017.07.28 CN 104388300 B 1.一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法， 其特征在于： 以微流控芯片作为 操作平台， 以静压力和电动作为流体操控手段； 一次进样包括细胞上样、 单细胞捕获/装载、 单细胞溶膜及电泳分离三步操作； 一次进样完成后， 自动重复上述三步操作， 实现连续进 样； 所述的微流控芯片， 其通道末端的五个宽贮液池分别定义为样品池S、 辅助聚焦液池A、 样品废液池SW、 缓冲液池B和缓冲液废液池BW； 其通道之间的二个交叉口分别定义为 “聚焦” 交叉口J和 。

4、“十字” 交叉口C， 样品池S经过交叉口J、 交叉口C到样品废液池SW之间的通道S-J- C-SW定义为细胞上样通道， 交叉口J与交叉口C之间的通道J-C定义为单细胞捕获/装载通 道， 交叉口C与缓冲液废液BW之间的通道C-BW定义为单细胞溶膜和电泳分离通道； 所述的静压力， 包括在样品池S、 辅助聚焦液池A、 缓冲液池B、 缓冲液废液池BW中加入等 体积的样品或电泳缓冲液， 样品废液池SW中加入一定体积的电泳缓冲液， 并保证样品池S、 辅助聚焦液池A、 缓冲液池B、 缓冲液废液池BW中样品或电泳缓冲液与样品废液池SW中电泳 缓冲液的体积比为1.31.5： 1而形成的液压差； 所述的电动由施加。

5、到辅助聚焦液池A、 样品废液池SW、 缓冲液池B和缓冲液废液池BW上 的独立或/和同步输出的四组程控直流电压 （V1、V2、V3、V4） 组成； 所述的细胞上样， 采用静压力操控即样品池S、 辅助聚焦液池A、 缓冲液池B、 缓冲液废液 池BW与样品废液池SW之间存在液压差， 在交叉口C处形成水力门控， 此时从样品池S流出的 细胞样品经过从辅助聚焦液池A流出电泳缓冲液流的挤压在通道J-C处形成二相层流的线 状细胞流， 并经交叉口C流向样品废液池SW； 与此同时， 从缓冲液池B和缓冲液废液池BW流出 的电泳缓冲液流与交叉口C处的线状细胞流汇合形成三相层流后流向样品废液池SW， 从而 避免上样通道S。

6、-J-C-SW内的细胞样品向分离通道C-BW的扩散； 所述的单细胞捕获/装载， 采用电动操控即样品池 S 不施加电压， 辅助聚焦液池A施加 500-800V电压， 缓冲液废液池BW施加0V电压， 样品废液池SW 和缓冲液池B 为 “悬空” ， 此时 在电压的作用下捕获通道J-C中的单个细胞， 并装载送入分离通道C-BW， 从而实现单细胞的 捕获/装载与样品进样体积的控制； 所述的单细胞溶膜及电泳分离， 采用电动操控即样品池 S 不施加电压， 辅助聚焦液池 A “悬空” ， 缓冲液池B、 样品废液池SW、 缓冲液废液池BW分别施加2500V、 1500V、 0V的电压， 在 交叉口C处形成电动门。

7、控， 此时在电动作用下从缓冲液池B引出的电泳缓冲液流经交叉口C 后分成两股流体： 一股流向缓冲液废液池BW的流体将被捕获/装载到分离通道C-BW中的单 细胞进行溶膜和胞内组分电泳分离， 而另一股流体则流向样品废液池SW， 以避免上样通道 S-J-C-SW中的细胞向分离通道泄露而影响单细胞分析结果的有效性； 所述的样品为细胞悬液或其他生化液体样品； 所述的单细胞捕获/装载与样品进样体积的控制也可以通过优化调节静压力、 细胞密 度、 单细胞捕获/装载操作的电压及运行时间来实现； 该用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法使用的装置包括微流控芯片、 四路程控 直流电压； 所述的微流控芯片， 结构为 “。

8、十字” 通道上引入辅助聚焦通道， 通道之间有两个交叉口 即 “聚焦” 交叉口J和 “十字” 交叉口C， 两个交叉口将微流控芯片的通道分成细胞悬液通道S- J、 辅助聚焦通道A-J、 单细胞捕获/装载通道J-C、 电泳缓冲液通道C-B、 细胞悬液及电泳缓冲 权利要求书 1/2 页 2 CN 104388300 B 2 液废液通道C-SW、 单细胞溶膜和电泳分离通道C-BW六个隔段； 其通道的末端分别安装有五 个相同结构的宽贮液池， 每个宽贮液池的结构为上下同心圆筒， 上部圆筒的内径大于其高 度23倍， 下部圆筒与芯片通道末端链接； 所述的四路程控直流电压， 包括串行通信接口、 单片机、 DA转换。

9、器、 DCDC高压电源模 块、 外接键盘和数码显示； 其对外接口有2个即串行通信接口和四路直流电压 （V1、V2、V3、 V4） ； 每路直流电压的输出设定由外接键盘或者串行通信接口连接的计算机实现， 每路直流 电压的输出显示则由数码管或上位机实现； 基于预先设定的实验参数， 单片机控制四路直 流电压的独立或/和同步的可编程输出流程与连续进样的操作步骤对应一致。 权利要求书 2/2 页 3 CN 104388300 B 3 一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法及装置 技术领域： 0001 本发明属于单细胞分析技术领域， 涉及一种可以提供微流控芯片上 “细胞上样、 单 细胞捕获/装载、 单。

10、细胞溶膜和胞内组分电泳分离” 等操作的进样方法和装置， 尤其涉及一 种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法和装置。 背景技术： 0002 单细胞定量分析是一类在单个细胞尺度上实现单细胞进样、 多参数测量和胞内组 分信息定量获取的全新实验技术。 该技术的发展与完善， 不仅可以在单细胞层面、 分子水平 上为生命科学、 医药健康等学科的分析和研究提供重要的技术支撑， 而且可以为生命奥妙 的诠释以及疾病机制与诊疗手段的探索提供全新的信息， 从根本上推动疾病早期诊断、 新 药创制等相关领域的跨越式发展。 0003 单细胞进样作为单细胞定量分析不可或缺的关键步骤,其作用是从群体细胞中精 确捕获单个目标细。

11、胞， 将其受控装载/送入分离通道或预定位点， 并完成观测、 溶膜、 电泳分 离等操作。 良好的进样方法除了包括对分析结果重要影响的因素如超小体积(单细胞)样品 的获取与进样体积的可控、 连续进样与较高通量等特征外， 进样方法的简单、 可重复、 易于 其他操作集成等特征不能忽视。 0004 受细胞尺度小、 受试进样体积下降、 检测精度和分析速度提升等条件的限制， 目前 用于单细胞分析研究的进样操作还高度依赖于传统的生命化学分析手段和操作者的细致 程度。 例如显微镜下的微管吸吮、 光镊、 磁镊、 膜片钳及流式细胞术等。 这些操作虽然可行， 但是缺点明显： (1)大量的操作都是在开放环境中进行， 操。

12、作过程时间长， 极难进行样品污 染的控制， 而对于单细胞定量分析而言， 由于样品量极少， 极其微量的污染将导致严重的结 果错误； (2)大多数操作存在细胞样品与试剂操作的不平行现象， 不仅减缓了实验进度， 而 且很难保证单细胞进样与样品进样体积的操控精度； (3)大量的耗时操作， 不仅导致实验通 量无法上升， 同时还导致很多对操作时间要求较高的实验无法实现； (4)尽管流式细胞术能 对完整的细胞进行快速检测和分类， 但由于不能对单细胞内的组分进行电泳分离， 难以得 到精确的定量信息； (5)常规的 实验器具不仅需要较大的受试细胞样本， 而且很难适合干 细胞、 元祖细胞等珍稀样本， 导致较高的空。

13、载率以及假阳性与假阴性结果的较大系统误差， 使得精细的定量结果掩盖在设备带来的噪音中。 0005 微流控技术作为近年来能够精确操控微尺度生化流体的一种新兴手段， 其微米级 的通道尺度与细胞直径具有良好的相符性， 为实现单细胞的操纵和微环境调控提供了极为 便捷的条件， 因而该技术已成为单细胞进样与定量分析研究的重要手段。 微流控单细胞进 样通常包括微流控芯片上的 “细胞上样、 单细胞捕获/装载、 单细胞溶膜及电泳分离” 等多步 复杂操作。 迄今为止 ， 微流控单细胞进样按进样策略可以分为 ： (1)阀控泵进样 (Science.2007,315,81-84.)； (2)电动进样,主要模式有简单进。

14、样(J.Chromatogr.A,2005, 1063,227233.)、 夹流进样(J.Chromatogr.A.2009,1216,67466751.)和门式进样(Lab Chip,2011,11,11441150.)； (3)负压进样(Lab Chip,2010,10,14721475.)； (4)压力结合 说明书 1/7 页 4 CN 104388300 B 4 电动的进样(Electrophoresis 2010,31,16301636.)。 阀控泵进样需要机械微泵驱动细胞 流体， 外部气泵与芯片上多个微阀的联动来控制单细胞的捕获和溶膜。 这类方法的不足为： 所用芯片加工复杂， 方法。

15、实施高度依赖于复杂操作， 并不适合大规模的商业化使用。 电动进 样通过切换施加到芯片液池上的电压， 可以在简单 “十字” 或双 “T” 结构芯片上完成细胞上 样、 单个细胞的捕获、 溶膜及电泳分离。 这类方法简便灵活、 易于与芯片耦合和整个仪器系 统的小型化； 但是电动进样也存在样品歧视效应， 同时过高的电压(电场强度)会造成细胞 样品的不可逆损伤。 负压进样利用施加到 “十” 字芯片样品废液端(SW)和缓冲液废液端(BW) 的负压， 实现细胞上样和单细胞装载。 该类方法可以在一定程度上解决电动进样中样品歧 视效应的问题， 但其控制进样体积的能力有限， 方法实施依赖于多个仪器设备的联动和多 步。

16、复杂操作； 同时该方法也存在一个难以解决的矛盾， 即如果采用玻璃基质芯片有利于电 泳分离， 但与气动器件耦合困难， 而采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)弹性体芯片有利于与气动 器件的耦合， 但电泳分离困难。 压力结合电动的进样则是利用施加到 “十” 字芯片样品废液 端(SW)上的负压或静压力， 实现细胞上样， 然后撤销负压或静压力， 在分离通道两边施加一 个电场， 并借助显微镜观察实现单细胞的捕获与装载。 该类方法无样品歧视效应， 对细胞无 损伤。 但是该方法实施依赖于人工的多步操作， 同时由于其静压力采用传统贮液池(即贮液 池的高度大于其内径)， 贮液池的液面随着流体的流出而下降， 使得流速随液。

17、面下降而明显 减少， 难以适应进样体积精确调控和较长时 间的连续进样操作。 总体而言， 现有的微流控 单细胞进样方法仍存在以下共性问题： (1)难以实现连续进样。 目前的进样方法在完成一次 进样及分析后， 通常需要中断分析过程， 然后进行流体操控手段及样品、 试剂的移出， 清洗 芯片， 新样品、 试剂注入， 操控手段重新施加等大量的耗时操作， 导致系统的分析通量无法 上升。 (2)进样效率低。 目前进样的操控手段多是采用多个独立仪器设备的简单组合， 且单 个细胞的捕获往往需要借助显微镜， 使得样品、 试剂的操作难以平行或同步， 不仅导致进样 体积可控性差， 还影响分析系统的稳定性。 发明内容：。

18、 0006 本发明旨在克服现有微流控单细胞进样技术的不足， 目的之一是提供一种微流控 芯片上一次单细胞进样所涉及的细胞上样、 单细胞捕获/装载、 单细胞溶膜及电泳分离等多 步操作， 尤其是在一次单细胞进样完成后， 可以自动重复上述操作， 实现连续单细胞进样， 具有多次进样连续可控、 进样体积可调、 效率高、 重现性好的用于单细胞定量分析的微流控 连续进样方法； 目的之二是提供为实现目的之一的方法所使用的装置简便、 操作简单的用 于单细胞定量分析的微流控连续进样装置。 0007 本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现： 0008 一种用于单细胞定量分析的微流控连续进样方法， 以微流控芯片作为操。

19、作平台， 以静压力和电动作为流体操控手段； 一次进样包括细胞上样、 单细胞装载/捕获、 单细胞溶 膜及电泳分离三步操作； 一次进样完成后， 自动重复上述三步操作， 即可实现多次连续进 样； 0009 所述的微流控芯片， 其通道末端的五个宽贮液池分别定义为样品池S、 辅助聚焦液 池A、 样品废液池SW、 缓冲液池B和缓冲液废液池BW； 其通道之间的二个交叉口分别定义为 “聚焦” 交叉口J和 “十字” 交叉口C,样品池S经过交叉口J、 交叉口C到样品废液池SW之间的通 说明书 2/7 页 5 CN 104388300 B 5 道S-J-C-SW定义为细胞上样通道， 交叉口J与交叉口C之间的通道J-。

20、C定义为单细胞捕获/装 载通道， 交叉口C与缓冲液废液BW之间的通道C-BW定义为单细胞溶膜和电泳分离通道； 0010 所述的静压力， 包括分别依次在样品池S、 辅助聚焦液池A、 缓冲液池B、 缓冲液废液 池BW中加入等体积的样品或电泳缓冲液， 样品废液池SW中加入一定体积的电泳缓冲液， 并 保证样品池S、 辅助聚焦液池A、 缓冲液池B、 缓冲液废液池BW中样品或电泳缓冲液与样品废 液池SW中电泳缓冲液的体积比为1.31.5： 1而形成的液压差； 0011 所述的电动则由施加到辅助聚焦液池A、 样品废液池SW、 缓冲液池B和缓冲液废液 池BW上的独立或/和同步输出的四组程控直流电压(V1、 V。

21、2、 V3、 V4)组成； 所述的细胞上样， 采 用静压力操控即样品池S、 辅助聚焦液池A、 缓冲液池B、 缓冲液废液池BW与样品废液池SW之 间存在液压差， 在交叉口C处形成水力门控， 此时从样品池S流出的细胞样品经过从辅助聚 焦液池A流出电泳缓冲液流的挤压在通道J-C处形成二相层流的线状细胞流， 并经交叉口C 流向样品废液池SW； 与此同时从缓冲液池B和缓冲液废液池BW流出的电泳缓冲液流与交叉 口C处的线状细胞流汇合形成三相层流(两边为电泳缓冲液流， 中间为线状样品流)后流向 样品废液池SW， 从而避免上样通道S-J-C-SW内的细胞样品向分离通道C-BW的扩散； 0012 所述的单细胞捕。

22、获/装载， 采用电动操控即样品池S不施加电压， 辅助聚焦液池A施 加低电压， 缓冲废液池BW施加0V电压(接地)， 样品废液池SW和缓冲液池B为 “悬空(既不施加 电压， 也不接地)” ， 此时在电压(电场)的作用下捕获通道J-C中的单个细胞， 并装载送入分 离通道C-BW， 从而实现单细胞的捕获/装载与样品进样体积的控制； 0013 所述的单细胞溶膜及电泳分离， 采用电动操控即样品池S不施加电压， 辅助聚焦液 池A “悬空” ， 缓冲液池B、 样品废液池SW、 缓冲液废液池BW分别施加2500V、 1500V、 0V的电压， 在交叉口C处形成电动门控， 此时在电动作用下从缓冲液池B引出的电泳。

23、缓冲液流经交叉口 C后分成两股流体： 一股流向缓冲液废液池BW的流体将被捕获/装载到分离通道C-BW中的单 细胞进行溶膜和胞内组分电泳分离， 而另一股流体则流向样品废液池SW， 以避免上样通道 S-J-C-SW中的细胞向分离通道泄露而影响单细胞分析结果的有效性。 0014 至此， 一次单细胞进样完成， 自动重复上述3步操作(细胞上样， 单细胞装载/捕获， 单细胞溶膜及电泳分离)， 即可实现连续进样。 0015 本发明的目的之一还可通过如下技术措施来实现： 0016 本发明所述的样品为细胞悬液或其他生化液体样品； 所述的单细胞捕获/装载与 样品进样体积的控制也可以通过优化调节静压力、 细胞密度、。

24、 单细胞捕获/装载操作的电压 及运行时间来实现。 0017 本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现： 0018 该用于单细胞定量分析的微流控连续进样装置包括微流控芯片、 四路程控直流电 压； 0019 所述的微流控芯片， 结构为 “十字” 通道上引入辅助聚焦通道， 通道之间有两个交 叉口即 “聚焦” 交叉口J和 “十字” 交叉口C， 两个交叉口将微流控芯片的通道分成S-J(细胞悬 液通道)、 A-J(辅助聚焦通道)、 J-C(单细胞捕获/装载通道)、 C-B(电泳缓冲液通道)、 C-SW (细胞悬液及电泳缓冲废液通道)、 C-BW(单细胞溶膜和电泳分离通道)六个隔段； 其通道的 末端分别安装。

25、有五个相同结构的宽贮液池， 每个宽贮液池的结构为上下同心圆筒， 上部圆 筒的内径大于其高度23倍,下部圆筒与芯片通道末端链接； 说明书 3/7 页 6 CN 104388300 B 6 0020 所述的四路程控直流电压， 包括串行通信接口(RS232)、 单片机(MCS-51)、 DA转换 器(DAC7614)、 DCDC高压电源模块、 外接键盘和数码显示； 其对外接口有2个即串行通信接 口和四路直流电压(V1、 V2、 V3、 V4)； 每路直流电压( “电压/接通” 、“0V/接地” 、“悬空/断开” ) 的输出设定由外接键盘或者串行通信接口RS232连接的计算机(上位机)实现， 每路直流。

26、电 压的输出显示则由数码管或上位机实现； 基于预先设定的实验参数， 单片机控制四路直流 电压的独立或/和同步的可编程输出流程与连续进样的操作步骤对应一致。 0021 将本发明应用于细胞或其他生化样品的连续进样及定量分析， 实施装置还包括激 光诱导荧光检测系统或者其他检测单元， 以便进行进样流形观察、 进样条件优化、 测定电泳 分离的有关组分及其含量。 0022 本发明的优点： 0023 1、 样品池S中始终不加电压的进样方法， 可以有效避免单细胞溶膜、 电泳分离阶段 高电压对样品池内细胞的损伤； 0024 2、 芯片液池采用宽贮液池的设计， 在保持液池液面下降缓慢的同时， 可以保证较 长时间的。

27、流速稳定， 便于提高进样体积控制和连续进样操作的稳定性； 0025 3、 芯片结构采用 “十字” 通道引入辅助聚焦通道的设计， 不仅可以提供细胞上样、 单细胞捕获/装载操作的聚焦层流控制， 提高进样体积与单细胞进样的有效性， 而且可以通 过在辅助聚焦液池中添加预溶膜试剂来减少后续单细胞溶膜操作的时间， 以保证单细胞的 原始特性和分析结果的准确性； 0026 4、 本发明可以提供微流控芯片上一次单细胞进样所涉及的细胞上样、 单细胞捕 获/装载、 单细胞溶膜及电泳分离等多步操作， 尤其可以提供一次单细胞进样完成后， 自动 重复上述操作， 实现连续单细胞进样， 具有多次进样连续可控、 进样体积可调、。

28、 效率高、 重现 性好、 装置简便、 操作简单等优点。 0027 本发明不仅可以实现一次单细胞进样所涉及的细胞上样、 单细胞捕获/装载、 单细 胞溶膜及电泳分离等操作， 而且具有多次单细胞进样连续可控、 操作简便、 便于单细胞定量 分析等优点。 附图说明： 0028 图1为本发明实施例的方法原理图； 0029 图2为本发明实施例的装置示意图； 0030 图3为本发明实施例的装置应用示意图； 0031 图4为本发明实施例的控制进样体积及其对应的电泳图和流形图； 0032 图5为本发明实施例用于连续进样的电泳图及重现性； 0033 图6为本发明实施例用于细胞上样、 单细胞捕获/装载、 单细胞溶膜及。

29、电泳分离的 流形图； 0034 图7为本发明实施例用于单个PC-12细胞连续进样与胞内NO连续检测的电泳图； 0035 图8为本发明实施例用于定量分析186个PC-12细胞内NO含量的统计直方图； 0036 图9为本发明的进样过程示意图。 具体实施方式： 说明书 4/7 页 7 CN 104388300 B 7 0037 下面结合附图对本发明作进一步说明。 0038 参见附图1： 0039 图中： (1)细胞上样； (2)单细胞捕获/装载； (3)单细胞溶膜及电泳分离； S样品池， SW样品废液池， A辅助聚焦液池， B缓冲液池， BW缓冲液废液池； 黑色虚线箭头为静压力驱动 的液流方向， 黑。

30、色实线箭头为电场方向； 浅灰色实心圆点为细胞悬液， 黑色实心圆点为捕 获/装载和溶膜的(目标)单细胞； 天蓝色为电泳缓冲液。 0040 本发明的方法包括如下步骤： 0041 第一步， 细胞上样。 首先在样品池S与辅助聚焦液池A、 缓冲液池B、 缓冲液废液池BW 中分别依次加入等体积的样品(细胞悬液或其他生化液体样品)和电泳缓冲液， 样品废液池 SW中加入一定体积的电泳缓冲液， 并保证样品池S、 辅助聚焦液池A、 缓冲液池B、 缓冲液废液 池BW中样品或电泳缓冲液与样品废液池SW中电泳缓冲液的体积比为1.3-1.5:1。 随后将四 路程控直流电压(V1、 V2、 V3、 V4)的铂丝电极对应插入。

31、辅助聚焦液池A、 样品废液池SW、 缓冲液 池B和缓冲液废液池BW， 并按表1的输出 方式启动四路程控直流电压的输出。 此时， 由于四 路程控直流电压的输出均为 “悬空” ， 样品池S、 辅助聚焦液池A、 缓冲液池B、 缓冲液废液池BW 与样品废液池SW之间存在液压差， 芯片内的流体(样品和电泳缓冲液)只受静压力操控， 并 在交叉口C处形成水力门控(附图1， (1)， 使得从样品池S中流出的细胞样品经过从辅助聚 焦液池A流出的电泳缓冲液流的挤压在通道J-C处形成二相层流的线状细胞流， 并经交叉口 C流向样品废液池SW； 与此同时从缓冲液池B和缓冲液废液池BW流出的电泳缓冲液流与交叉 口C处的线。

32、状细胞流汇合形成三相层流后流向样品废液池SW， 从而避免上样通道S-J-C-SW 内的细胞向分离通道扩散。 0042 表1： 四路程控直流电压用于连续进样的典型输出 0043 0044 a,一次进样完成后， 按预设循环次数自动重复3步操作； F,悬空； 0,接地。 0045 第二步， 单细胞捕获/装载。 基于电动操控(见表1)， 即样品池S不施加电压， 辅助聚 焦液池A施加低电压， 缓冲废液池BW施加0V电压(接地)， 样品废液池SW和缓冲液池B为 “悬空 (既不施加电压， 也不接地)” ， 此时在电动(电压)的作用下驱动捕获通道J-C中的单个细胞， 并装载送入分离通道C-BW。 该步操作中可。

33、以通过对静压力、 电压和运行时间的优化来控制 单细胞捕获/装载的精度及样品进样体积与进样量的大小。 0046 第三步， 单细胞溶膜及电泳分离。 基于电动操控(见表1)， 即样品池S不施加电压， 辅助聚焦液池A “悬空” ， 缓冲液池B、 样品废液池SW、 缓冲液废液池BW分别施加2500V、 1500V、 0V的电压， 在交叉口C处形成电动门控， 此时在电动作用下从缓冲液池B引出的电泳缓冲液 流经交叉口C后分成两股流体： 一股流向缓冲液废液池BW的流体将被捕获/装载到分离通道 C-BW中的单细胞进行溶膜和胞内组分电泳分离， 而另一股则流向样品废液池SW， 以避免上 说明书 5/7 页 8 CN。

34、 104388300 B 8 样通道S-J-C-SW中的细胞向分离通道泄露而影响单细胞分析结果的有效性。 0047 至此， 一次单细胞进样完成， 自动重复上述步骤， 即可实现连续进样。 0048 参见附图2： 0049 图中： 1微流控芯片； 2宽贮液池； 3微流控芯片的通道； 4四路程控直流电压。 0050 本发明用于单细胞定量分析的微流控连续进样的装置主要包括微流控芯片和四 路程控直流电压。 微流控芯片的材质为玻璃或石英， 其通道结构为 “十字” 通道上引入辅助 聚焦通道， 从而形成两个交叉口即 “聚焦” 交叉口J和 “十字” 交叉口C， 六个通道隔段即S-J (细胞悬液通道)、 A-J(。

35、辅助聚焦通道)、 J-C(单细胞捕获/装载通道)、 C-B(电泳缓冲液通 道)、 C-SW(细胞悬液及电泳缓冲废液通道)、 C-BW(单细胞溶膜和电泳分离通道)； 其通道的 末端分别安装有五个相同结构的宽贮液池(附图2， 2),每个宽贮液池的结构为上下同心圆 筒， 上部圆筒的内径大于其高度2-3倍,下部圆筒与芯片通道末端链接， 通过在五个宽贮液 池中加入一定体积比的样品或电泳缓冲液来提供连续进样所需的静压力操控。 四路程控直 流电压包括串行通信接口(RS232)、 单片机(MCS-51)、 DA转换器(DAC7614)、 DCDC高压电源 模块以及、 外接键盘和数码显示。 其中， 串行通信接口。

36、与外部计算机(上位机)相连， 用于通 讯、 四路程控直流电压的输出设定及单片机管理等， 四路直流电压(V1、 V2、 V3、 V4)通过铂丝 电极分别与辅助聚焦液池A、 样品废液池SW、 缓冲液池B和缓冲液废液池BW对应连接。 此外， 为了提高装置的便携性， 也可以由外接键盘和数码显示提供四路直流电压的输出设定和显 示功能。 基于设定的实验参数， 单片机控制四路直流电压的独立或/和同步的可编程输出流 程与连续进样的操作步骤对应一致。 0051 下面以荧光素Rh 6G样品和PC-12细胞样品的连续进样为例， 进一步说明本发明的 特点和性能。 0052 参见附图35： 0053 图3中： 1微流控。

37、芯片； 2激光诱导荧光检测检测系统； 3计算机； 4四组程控直流电 压。 0054 图4中： A为本发明控制捕获/装载时间为50、 100、 200、 500和1000毫秒时， 分别对应 的1 M Rh 6G的电泳图为1、 2、 3、 4、 5； B,C为捕获/装载时间为1000毫秒时的进样流型图和进 样体积(黄色圆圈内的绿色， 约为206pL)。 0055 图5中： 1 M Rh 6G连续进样36次， 保留时间、 峰面积的相对标准偏差分别为3.3 和4.1。 0056 以激光诱导荧光检测系统(附图3， 2)进行进样流形观察和检测。 该检测系统的CCD 相机观察/记录芯片 “十字” 交叉口C处。

38、荧光样品的进样情况， 波长为532nm的激 光经激发/ 收集光路激发分离通道 “检测点D” 处的电泳分离组分， 组分的荧光则经激发/收集光路由光 子计数器检测。 电泳缓冲液为30mM HEPES(PH 7.4)， 样品为1 MRh 6G溶液。 0057 首先依次用0.1M NaOH、 超纯水和电泳缓冲液清洗微流控芯片的通道， 将清洗后的 芯片放置到激光诱导荧光检测系统的X-Y-Z移动平台上， 检测点D距离芯片 “十字” 交叉口C 下游10mm处。 四路程控直流电压(V1、 V2、 V3、 V4)的铂丝电极对应插入辅助聚焦液池A、 样品废 液池SW、 缓冲液池B和缓冲液废液池BW。 随后依次在辅。

39、助聚焦液池A、 缓冲液池B和缓冲液废 液池BW中精确加入26 L的电泳缓冲液， 样品池S中加入26 L的1 M Rh 6G溶液， 样品废液池 SW中加入20 L的电泳缓冲液。 同时依照表1启动四路程控直流电压的输出。 此时在静压力和 说明书 6/7 页 9 CN 104388300 B 9 电动的操控下实现Rh 6G样品的进样体积控制(附图4)和连续进样(附图5)。 结果表明： 通过 调节进样第二步(捕获/装载)的时间可以有效控制进样体积的大小(捕获/装载时间与进样 体积的大小呈正相关， 1000毫秒时对应的进样体积约为206pL)； 在上述静压力和电动的操 控下,完成一次进样时间为42s， 。

40、连续进样36次， 1 M Rh 6G的保留时间、 峰面积的相对标准 偏差分别为3.3和4.1。 说明本发明可以实现皮升级样品的连续进样且具有良好的重现 性。 0058 参见附图68： 0059 图6中： (a)为细胞上样； (b)， (c)， (d)为单细胞捕获/装载； (e)， (f)为单细胞溶膜 及电泳分离； 细胞样品为PC-12细胞， 白色圆圈为目标单细胞， 白色实线箭头为目标单细胞 的流向。 0060 图7中： 连续8次单细胞进样， 单个PC-12细胞内NO的峰面积的相对标准偏差为 4.6。 0061 图8中： X坐标轴表示单个PC-12细胞内NO的含量， Y坐标轴表示相应NO浓度下的。

41、细 胞个数。 0062 以激光诱导荧光检测系统(附图3， 2)进行单细胞进样流形的观察和胞内NO的定量 检测。 电泳缓冲液为30mM HEPES与20mM甘露醇的混合液(PH 7.4)， 样品为大鼠肾上腺嗜铬 细胞瘤细胞(PC-12细胞)悬液， 密度约为5105cells/mL。 细胞预溶膜试剂为0.3SDS。 荧 光染料是DAR-4M AM(1uM)。 激光波长为532nm。 0063 首先将清洗后的芯片放置到激光诱导荧光检测系统的X-Y-Z移动平台上， 检测 点 D距离芯片 “十字” 交叉口C下游25mm处。 四路程控直流电压(V1、 V2、 V3、 V4)的铂丝电极分别插 入辅助聚焦液池。

42、A、 样品废液池SW、 缓冲液池B和缓冲液废液池BW。 0064 随后在辅助聚焦液池A、 缓冲液池B和缓冲液废液池BW中依次加入26 L的电泳缓冲 液， 样品池S中加入26 L的PC-12细胞悬液， 样品废液池SW注入20 L的电泳缓冲液， 同时依照 表1启动四路程控直流电压的输出， 开始进样的三步操作： 1)静压力驱动的细胞上样(附图 6， (a)； 2)低电压(该电压在通道内产生的电场强度约为100-150V/cm， 不会对细胞造成损 伤)驱动捕获通道J-C内的单个PC-12细胞， 并将其送入分离通道(附图6， (b)， (c)， (d)； 3) 高电压(该电压在通道内产生的电场强度约为4。

43、50V/cm)对分离通道C-BW内的单个目标PC- 12细胞进行载溶膜及电泳分离(附图6， (e)， (f)； 从而完成一次单细胞进样。 0065 接下来， 用荧光染料标记细胞， 以保证经溶膜及电泳分离后单个PC-12细胞内NO的 检测。 在辅助聚焦液池A中加入26 L的电泳缓冲液(内含预溶膜试剂)， 缓冲液池B和缓冲液 废液池BW中分别加入26 L的电泳缓冲液， 样品池S中加入26 L荧光标记的PC-12细胞悬液， 样品废液池SW中加入20 L的电泳缓冲液。 同时依照表1启动四路程控直流电压的输出。 基于 上述静压力和电动的流体操控， 即可实现单个PC-12细胞的连续进样和胞内NO的连续检测。

44、 (附图7)。 在此基础上， 采用外标法即不同浓度NO与其衍生产物荧光信号(峰面积)的标准曲 线， 得到多次连续进样下186个PC-12细胞内NO含量的定量结果(附图8)， 并用统计学方法验 证分析结果有效。 说明书 7/7 页 10 CN 104388300 B 10 图1 图2 说明书附图 1/5 页 11 CN 104388300 B 11 图3 图4 说明书附图 2/5 页 12 CN 104388300 B 12 图5 图6 说明书附图 3/5 页 13 CN 104388300 B 13 图7 图8 说明书附图 4/5 页 14 CN 104388300 B 14 图9 说明书附图 5/5 页 15 CN 104388300 B 15 。