一种用于检测白血病易感的基因组合、引物、探针和用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 101962670 A (43)申请公布日 2011.02.02 CN 101962670 A *CN101962670A* (21)申请号 200910069888.3 (22)申请日 2009.07.24 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 南京微宇基因工程有限公司 地址 210018 江苏省南京市玄武区珠江路 222 号 10 层 E 座 (72)发明人 杨亚非 (74)专利代理机构 天津才智专利商标代理有限 公司 12108 代理人 王晓红 (54) 发明名称 一种用于检测白血病易感的基因组合、 引物、。

2、 探针和用途 (57) 摘要 本发明公开了一种用于检测白血病易感的基 因组合、 引物、 探针和用途， 它包括与白血病关系 密切的三个基因的组合 ： 毒物代谢类的 CYP1A1 基 因、 NQO1基因， DNA修复类的XRCC1基因。 包括下述 SNP位点 ： CYP1A1基因的rs4646903位点、 NQO1的 rs1800566 位点、 XRCC1 的 rs1799782 和 rs25487 位点。通过检测一组与白血病易感性相关的基因 及位点， 利用特异性引物和探针， 通过单核苷酸延 伸技术结合微阵列芯片技术， 综合检测和分析受 检人群是否携带 “白血病易感基因” ， 将白血病易 感人群从。

3、人群中筛选出来， 改变不良的生活习惯， 达到预防的目的。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 CN 101962671 A1/1 页 2 1. 一种用于检测白血病易感的基因组合， 其特征在于， 它包括与白血病关系密切的三 个基因的组合 ： 毒物代谢类的 CYP1A1 基因、 NQO1 基因， DNA 修复类的 XRCC1 基因。 2. 根据权利要求 1 所述的用于检测白血病易感的基因组合， 其特征在于， 包括下述 SNP 位点 ： CYP1A1 基因的 rs4646903 位点、 NQO1 的 rs180056。

4、6 位点、 XRCC1 的 rs1799782 和 rs25487 位点。 3. 如权利要求 2 所述的用于检测白血病易感的基因组合， 用于针对所述位点设计特异 性的引物对和探针。 4. 如权利要求 2 所述的用于检测白血病易感的基因组合设计的特异性引物， 其特征在 于， 所述的特异性引物对的序列如下， 用于进行多重 PCR 扩增， 能同时扩增出上述 4 个位点 的基因片段 ： 针对 rs4646903 位点 ： AGGGTCCCCAGGTCATCC CCCCAACTACTCAGAGGCT 针对 rs1800566 位点 ： ATTTGAATTCGGGCGTCT TGTGCTTTCTGTATC。

5、CTCAGAGT 针对 rs1799782 位点 ： TYAGGACCCAYGTTGTCC CCAGTTCCGTGTGAAGGA 针对 rs25487 位点 ： RTGCGTAAGGAGTGGGTG TGTGTTCTCCGCTGGCAG。 5. 如权利要求 2 所述的用于检测白血病易感的基因组合设计的特异性探针， 其特征在 于， 所述的特异性探针序列如下， 能同时对 4 个位点进行检测分型 ： 针对 rs4646903 位点 ： TTGTTTCACTGTAACCTCCACCTCC 针对 rs1800566 位点 ： TGCCCAATGCTATATGTCAGTTGAG 针对 rs1799782 。

6、位点 ： TCACCTGGRGATGTCTTGTTGATCC 针对 rs25487 位点 ： CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC。 6. 如权利要求 4 或 5 所述的引物或探针， 用于通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片 技术特异性检出白血病易感基因。 权 利 要 求 书 CN 101962670 A CN 101962671 A1/6 页 3 一种用于检测白血病易感的基因组合、 引物、 探针和用途 技术领域 0001 本发明涉及一种基因组合、 引物、 探针和用途， 尤其是一种用于检测白血病易感的 基因组合、 引物、 探针和用途。 背景技术 0002 白血病在我国人群中发病率高。

7、， 是儿童和青年最常见的恶性肿瘤。近年来其发病 率呈上升趋势， 病因至今尚未阐明。目前公认的观点是白血病是环境 - 基因相互作用引起 的。基因方面涉及代谢、 DNA 损伤修复基因等的变异。研究发现， 致癌物代谢通路中的代谢 酶家族在人群中呈多态性， 不同个体对特定致癌物的代谢能力有巨大的差异。同样， DNA 修 复能力也存在显著的个体差异。 人类基因组计划研究成果表明， 每个人的基因都是一样的， 但在序列上有极小的变异如单核苷酸多态(SNPs)。 正是这些基因的SNP多态性导致了基因 产物的功能差异， 从而决定个体对引起白血病发病的特定致癌物的代谢能力及 DNA 损伤后 修复能力的不同。因此，。

8、 代谢类基因、 DNA 修复基因等的多态性是决定人群对白血病易感性 的遗传因素。 0003 生物代谢酶参与许多常见化学致癌物的代谢、 活化或解毒过程。环境致癌物多为 无活性的原致癌物， 进入人体后大部分经以CYP450酶系为代表的I相酶代谢活化为亲电子 的终致癌物， 再由 II 相代谢酶代谢失活， 转化为亲水性物质排出体外， 致癌物能否引起靶 细胞癌变很大程度上取决于这两类酶的活性及其平衡关系。 生物代谢酶基因在人群中呈现 多态性分布， 相关基因缺失或变异有可能导致机体不能产生有活性的酶蛋白或使酶的表达 量减少， 机体的解毒能力降低， 致癌物在体内蓄积， 从而使所累个体患癌的危险性增大。大 量。

9、分子流行病学研究表明， 人群中肿瘤遗传易感性与代谢酶遗传多态性相关。 0004 CYP1A1 是 I 相代谢酶 CYP450 家族的一员， 其基因定位于人类染色体 15q22-q24， 含有 5934 个碱基对， 编码的蛋白质含有 512 个氨基酸残基， 其长度为 6311bp， 包括 7 个外 显子和 6 个内含子， 其中第一个外显子不编码蛋白质。CYP1A1 主要编码产物是芳烃羟化酶 (aryl hydrocarbon hydroxylase， AHH)。环境中大多数致癌物都是 CYP1A1 的底物， 主要代 谢多环芳烃类致癌剂。 其MspI多态(rs4646903)是由CYP1A13端非。

10、编码区的6235位点产 生 T C 突变， 形成 MspI 内切酶识别序列， 有野生型 (TT)、 杂合型 (TC)、 纯合突变型 (CC)3 种基因型。研究发现， CYP1A1 突变基因型可提高酶的诱导活性， 加速致癌物的活化。因此， 携带 CYP1A1MspI 突变基因型 CC 的个体对环境致癌物更敏感， 从而增加了个体患白血病的 危险。 0005 NQO1， 即 NAD(P)H ： 醌氧化还原酶， 又称 D- 硫辛酰胺脱氢酶， 是体内一种重要的 II 相反应酶， 主要存在胞质内， 但在内质网、 线粒体和高尔基体中也存在。NQO1 基因定位于人 类染色体16p22， 基因全长20kb， 含。

11、6个外显子。 NQO1以NAD(P)H为受体， 可将NADH或NADPH 的电子传递给醌类及其衍生物， 发生双电子还原反应， 生成低毒的氢醌类化合物。 其催化特 性在于无单电子还原产物半醌及自由基等氧化产物形成， 避免了对细胞的损伤， 降低具有 致癌性和致畸性的醌类化合物的危害。NQO1 与其他 I、 II 相代谢酶一起构成了体内对外源 说 明 书 CN 101962670 A CN 101962671 A2/6 页 4 致癌物质的代谢网络， 在机体的解毒代谢中发挥着重要作用。 0006 NQO1基因cDNA 609位点上(rs1800566)存在CT单核苷酸多态性， 通过孟德尔 方式遗传， 。

12、符合 Hardy-Weinberg 平衡。此位点多态性导致 NQO1 基因编码的 187 位氨基酸 由脯氨酸变成了丝氨酸， 虽不影响其 mRNA 的合成， 但可能改变了酶的二级结构， 使酶的活 性降低， 增加了氧自由基的生成。纯合野生基因型 CC 具有完全的 NQO1 酶活性， 杂合基因型 CT 的酶活性较纯合野生型降低 3 倍， 纯合突变基因型 TT 的酶活性则完全丧失。因此， NQO1 缺陷可降低细胞解毒致癌物的能力， 从而影响细胞代谢途径， 增加致癌物负荷并能导致某 些易感个体恶性变。研究表明， 成人纯合突变基因型 TT 会增加苯中毒的危险性， 并可增加 患白血病的危险性， 0007 人。

13、类 X 线交错互补修复基因 1(X-ray repair cross-complementinggroup 1， XRCC1) 是第一个分离到的影响细胞对电离辐射敏感性的哺乳动物基因， 它广泛参与 DNA 损 伤的修复， 是目前研究较多的一种 DNA 修复基因。XRCC1 定位于人类染色体 19q13.2-13.3， 大小为 33kb， 包含 17 个外显子， 编码 1 个由 633 个氨基酸组成的 70kD 的蛋白质。 XRCC1 作为脚手架蛋白， 通过直接与 DNA 聚合酶 、 DNA 连接酶 III 和多聚二磷酸腺苷 (adenosinediphosphate， ADP) 核糖聚合酶 (。

14、poly ADP-ribose polymerase， PARP) 形成复 合物， 共同参与因电离辐射和氧化损伤引起的碱基切除修复和单链断裂修复， 对维持基因 的稳定性发挥十分关键的作用。 在XRCC1基因中发现2个多态位点中， 它们是(rs1799782) C26304T 和 (rs25487)G28152A， 分别导致相应氨基酸残基 Arg194Trp 和 Arg399Gln 的改变。 这些氨基酸变异在进化上具有高度保守性， 因此这 2 个位点氨基酸的变异， 改变 XRCC1 基 因编码蛋白的功能， 从而引起恶性肿瘤的发生与发展， 其中 rs1799782 位点的 TT 基因型、 rs25。

15、487 位点的 AA 基因型增加个体患急性白血病的危险。 0008 现有技术检测白血病易感人群， 采用杂交芯片法或玻璃板芯片法， 以及利用 taqman 探针， 该方法准确率低、 假阴性和假阳性率较高， 且不能批量检测 ； 另一种直接测序 法， 虽准确率高， 但其成本高、 同样不能实现批量检测， 因此现有方法均无法满足大规模基 因筛选的要求。 发明内容 0009 本发明所要解决的技术问题是， 通过检测一组与白血病易感性相关的基因及位 点， 利用特异性引物和探针， 通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术， 综合检测和分析 受检人群是否携带 “白血病易感基因” ， 将白血病易感人群从人群中筛选出来。

16、， 改变不良的 生活习惯， 达到预防的目的。 0010 为了解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 一种用于检测白血病易感的 基因组合， 它包括与白血病关系密切的三个基因的组合 ： 毒物代谢类的 CYP1A1 基因、 NQO1 基因， DNA 修复类的 XRCC1 基因。 0011 包括下述SNP位点 ： CYP1A1基因的rs4646903位点、 NQO1的rs1800566位点、 XRCC1 的 rs1799782 和 rs25487 位点。 0012 所述的用于检测白血病易感的基因组合， 用于针对所述位点设计特异性的引物对 和探针。 0013 所述的用于检测白血病易感的基因组合设。

17、计的特异性引物， 所述的特异性引物对 说 明 书 CN 101962670 A CN 101962671 A3/6 页 5 的序列如下， 用于进行多重 PCR 扩增， 能同时扩增出上述 4 个位点的基因片段 ： 0014 针对 rs4646903 位点 ： AGGGTCCCCAGGTCATCC 0015 CCCCAACTACTCAGAGGCT 0016 针对 rs1800566 位点 ： ATTTGAATTCGGGCGTCT 0017 TGTGCTTTCTGTATCCTCAGAGT 0018 针对 rs1799782 位点 ： TYAGGACCCAYGTTGTCC 0019 CCAGTTCCG。

18、TGTGAAGGA 0020 针对 rs25487 位点 ： RTGCGTAAGGAGTGGGTG 0021 TGTGTTCTCCGCTGGCAG。 0022 所述的用于检测白血病易感的基因组合设计的特异性探针， 其特征在于， 所述的 特异性探针序列如下， 能同时对 4 个位点进行检测分型 ： 0023 针对 rs4646903 位点 ： TTGTTTCACTGTAACCTCCACCTCC 0024 针对 rs1800566 位点 ： TGCCCAATGCTATATGTCAGTTGAG 0025 针对 rs1799782 位点 ： TCACCTGGRGATGTCTTGTTGATCC 0026 。

19、针对 rs25487 位点 ： CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC。 0027 所述的引物或探针， 用于通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术特异性检出 白血病易感基因。 0028 本发明的有益效果是 ： (1) 分型结果准确性高达 99以上， 重复性好， 没有假阳性 影响 ； (2)同时检测多个SNP位点， 检测成本低 ； (3)通量高， 可一次对384个样本进行检测 ； (4) 操作简便 ； (5) 灵敏度高， 每次检测的 DNA 用量仅 2ng。本发明通过单核苷酸延伸技术 结合微阵列芯片技术， 利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性 (SNP) 的基因分型准确率 超过 99。

20、。 具体实施方式 0029 本发明用于检测白血病易感的基因组合， 它包括与白血病关系密切的三个基因的 组合 ： 毒物代谢类的 CYP1A1 基因、 NQO1 基因， DNA 修复类的 XRCC1 基因。包括下述 SNP 位 点 ： CYP1A1基因的rs4646903位点、 NQO1的rs1800566位点、 XRCC1的rs1799782和rs25487 位点。 0030 所述的用于检测白血病易感的基因组合， 用于针对所述位点设计特异性的引物对 和探针。 0031 本发明所述的引物是针对 CYP1A1 基因的 rs4646903 位点、 NQO1 的 rs1800566 位 点、 XRCC1。

21、 的 rs1799782 和 rs25487 位点而设计， 可用于进行多重 PCR 扩增， 可同时扩增出 上述 4 个位点的基因片段。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的。优选的， 本 发明中所述引物为具有如下序列 ： 0032 针对 rs4646903 位点 ： AGGGTCCCCAGGTCATCC 0033 CCCCAACTACTCAGAGGCT 0034 针对 rs1800566 位点 ： ATTTGAATTCGGGCGTCT 0035 TGTGCTTTCTGTATCCTCAGAGT 0036 针对 rs1799782 位点 ： TYAGGACCCAYGTTGTCC 说 明 书 C。

22、N 101962670 A CN 101962671 A4/6 页 6 0037 CCAGTTCCGTGTGAAGGA 0038 针对 rs25487 位点 ： RTGCGTAAGGAGTGGGTG 0039 TGTGTTCTCCGCTGGCAG。 0040 特异性引物可用常规的合成技术进行合成， 本领域的技术人员能够理解， 本发明 的引物不限于这 4 条引物对。 0041 本发明所述探针， 是针对CYP1A1基因的rs4646903位点、 NQO1的rs1800566位点、 XRCC1 的 rs1799782 和 rs25487 位点而设计， 可同时对 4 个位点进行检测分型。设计这类探 针。

23、是本领域技术人员能够轻易完成的。优选的， 本发明中所述探针为具有如下序列 ： 0042 针对 rs4646903 位点 ： TTGTTTCACTGTAACCTCCACCTCC 0043 针对 rs1800566 位点 ： TGCCCAATGCTATATGTCAGTTGAG 0044 针对 rs1799782 位点 ： TCACCTGGRGATGTCTTGTTGATCC 0045 针对 rs25487 位点 ： CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC。 0046 特异性探针可用常规的合成技术进行合成， 本领域的技术人员能够理解， 本发明 的特异性探针不限于这 4 条探针。 0047 。

24、本发明中所述探针特指单核苷酸延伸技术中的延伸引物， 下面实施例中将叙述为 延伸引物。 0048 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明 ： 0049 1DNA 的提取 ： 0050 取受检者外周静脉血， 加入同等体积的细胞裂解液， 裂解两次， 充分裂解白细胞， 离心弃上清后加入蛋白酶 K 缓冲液和蛋白酶 K(50ug/ml)， 65孵育 10 分钟， 异丙醇沉淀、 75乙醇洗涤两次， 晾干后溶于适量 TB 溶液中。 0051 2PCR 扩增 0052 取受检者的基因组 DNA 提取液加入 96 孔板中， 进行多重 PCR 扩增 ： 0053 反 应 总 体 积 5ul，其 中 10M mo。

25、l/L dNTPs 0.0375ul， 10PCR Buffer0.5ul， 25mmol/L MgCl21ul， 模 板 DNA 30ng， 6 重 引 物 混 合 液 10uM/L each0.025ul， Amplitaq Gold(5U/ul)0.1ul， 补足水到 5ul。置于 PCR 仪上反应 ： 预变性 94 1min ； 94 30sec， 55 30sec， 72 1min， 40 个循环 ； Hold 4。 0054 扩增引物 ： 0055 1F AGGGTCCCCAGGTCATCC 0056 1R CCCCAACTACTCAGAGGCT 0057 2F ATTTGAATT。

26、CGGGCGTCT 0058 2R TGTGCTTTCTGTATCCTCAGAGT 0059 3F TYAGGACCCAYGTTGTCC 0060 3R CCAGTTCCGTGTGAAGGA 0061 4F RTGCGTAAGGAGTGGGTG 0062 4R TGTGTTCTCCGCTGGCAG 0063 3 纯化 0064 在 PCR 扩增产物中加入 2ul Exo I-SAP-IT 纯化试剂 ( 购自 USB)。将 96 孔板放入 PCR 仪中进行纯化， 纯化程序 ： 37 30min， 96 10min， Hold4。 说 明 书 CN 101962670 A CN 101962671。

27、 A5/6 页 7 0065 4 引物延伸反应 0066 纯化后的 PCR 产物中加入延伸反应混合物 ： extension Dilution Buffer3.76ul， 延伸引物混合液 (1010uM/L each)0.03ul， 20Extension Mix 0.2ul， DNA 聚合酶 0.02ul， 补足水到 7ul。将装有延伸反应混合物的 96 孔板再次放入 PCR 仪中进行延伸反应， 反应程 序 ： Hold 96 3min ； 94 20sec， 40 11sec， 46 个循环 ； Hold 4。 0067 延伸引物序列 ： 0068 1P TTGTTTCACTGTAACCT。

28、CCACCTCC 0069 2P TGCCCAATGCTATATGTCAGTTGAG 0070 3P TCACCTGGRGATGTCTTGTTGATCC 0071 4P CGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC 0072 以上延伸探针 5 端具有与微阵列芯片地址引物对应的地址序列。 0073 5 延伸反应结束后， 加入杂交液可与微阵列芯片进行杂交反应。 0074 孵育温度 42， 孵育时间 2 小时。 0075 6 激光扫描检测荧光信号 0076 同时检测上述 3 个基因对预测、 比较个体的白血病易感性具有重要意义。本发明 将与白血病易感、 发生密切相关的基因进行组合， 通过大量的筛。

29、选数据表明所述 3 个基因 ： CYP1A1 基因、 NQO1 基因、 XRCC1 基因， 如 3 个基因都有位点发生突变， 则患急性白血病的概 率最高 ； 1 个基因有位点发生突变患白血病的概率较小。 0077 本发明采用单核苷酸延伸技术和微阵列芯片技术相结合的方法， 针对上述 4 个位 点， 设计一套多重 PCR 引物， 在一个扩增反应中同时扩增携带 SNP 位点的 4 个基因片段， 根 据 SNP 位点上游 5 端 23-25bp 的序列设计寡核苷酸探针， 此探针与序列杂交后 3 末端位 于 snp5 端上游 1bp 处。检测时聚合酶根据 SNP 携带的碱基在探针末端结合上一个携带荧 光。

30、的 ddNTP， 根据结合的 ddNTP 不同， 其所携带的荧光颜色也不相同， 在探针的 5 端根据与 微阵列芯片结合位置的不同设计有不同的20bp的Tag地址序列， 与微阵列芯片上对应的序 列互补， 延伸后的探针与微阵列芯片上对应区域上的序列杂交， 不同的探针结合在芯片的 不同区域， 通过检测对应位置的荧光， 达到同时进行多个 SNP 分型的目的。 0078 疾病的发生是一个十分复杂的过程， 受到多个蛋白和基因的共同影响， 其中任何 一个酶的改变都会影响疾病的易感性。传统的基因检测疾病的方法受到方法的限制， 往往 只能对一到两个基因的多态性进行分析， 只能覆盖一部份患病风险人群， 对于由于其。

31、他基 因上的多态性造成的疾病患病风险不能及时的预警， 检测的准确性因此会大幅降低， 受检 者不能全面的了解自身疾病的易感情况。 0079 本发明针对一种疾病不同的患病途径检测多个相关的基因和其多态性位点， 能更 准确更全面的检测受检者不同患病途径的患病风险， 能给受检者提出具有针对性和有效地 健康建议， 及时有效的避免其疾病的发生。 0080 由于本发明使用的检测方法可以高通量， 自动化的检测 SNP， 大幅降低了检测成 本， 可以对不同患病途径的多个基因同时进行检测， 本发明针对白血病不同的患病途径的 关键酶基因寻找挑选了 4 个多态性位点， 能更准确更全面的检测受检者不同患病途径的患 病风险， 能够给受检者提出具有针对性的健康建议， 及时有效的避免其疾病的发生。本发 明通过单核苷酸延伸技术结合微阵列芯片技术， 利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性 说 明 书 CN 101962670 A CN 101962671 A6/6 页 8 (SNP)的基因分型准确率超过99， 同时检测上述3个基因对检测、 比较个体的白血病易感 性具有重要意义。 0081 综上所述， 本发明的内容并不局限在上述的实施例中， 相同领域内的有识之士可 以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例， 但这种实施例都包括在本发 明的范围之内。 说 明 书 CN 101962670 A 。