一种以基因优化方法获得的抗草甘膦基因及其表达载体
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种基因优化的方法，以此方法获得的抗草甘膦的EPSP 合成酶基因，含有此基因的质粒和转化子。
草甘膦是使用最为广泛的广谱除草剂，具有对人畜基本无毒，杂草难以对它产生抗性，低土壤残 留量等特点，市场潜力巨大。为适应大规模机械化生产及施用草甘膦的需要，从二十世纪八十年代中 期开始，人们为培育抗草甘膦农作物作了大量的工作。目前，通过农业基因工程技术获得了许多抗草 甘膦作物，它们具有如下特点：(1)改变了农业传统耕作方式，使耕作管理更加容易：(2)除草效 果更加明显：(3)减少除草剂用量，有利于保护环境：(4)增产增收。抗草甘膦作物的种植将大大 减少除草剂的使用量，1996年美国种植抗草甘膦的大豆，每公顷除草剂用量减少9％至39％：1996 年加拿大种植抗草甘膦的作物，使平均每公顷的除草剂用量比常规减少了1.0千克。美国孟山都公司 开发的抗草甘膦作物，也即抗农达系列，已经被大面积种植，并产生了巨大的经济效益。
由aroA基因编码的EPSP合成酶仅存在于微生物和植物中，在芳香族氨基酸代谢途径中起作用， 催化莽草酸-3-磷酸(S-3-P)与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)作用，生成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸 (EPSP)。已鉴定的EPSP合成酶可分为两类：第一类可由大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌等产生(下称 第一类EPSP合成酶或第一类酶)；第二类在根瘤农杆菌CP4、无色细菌LBAA及假单胞菌PG2982中发 现(下称第二类EPSP合成酶或第二类酶)。这两类EPSP合成酶的同源性不高，氨基酸的相似性少于 50％，第二类酶不能与第一类酶的单克隆抗体发生交叉反应，而且两者的酶学性质也有区别。
由于草甘膦具有与PEP相似的结构，可作为竞争性抑制剂，形成EPSP合成酶·S-3-P·草甘膦复 合物，阻遏PEP与酶的结合，从而阻断芳香族氨基酸的的合成，杀灭绝大多数的植物，杂草和农作物 皆不例外。
过去，获得抗草甘膦转基因农作物研究遵循的途径主要有：一、导入过量表达的EPSP合成酶基 因，以此抵御草甘膦的竞争性抑制；二、通过定点突变，获得对草甘膦低亲和性或无亲和性的EPSP 合成酶，从而消除草甘膦的抑制作用。因为细菌的EPSP合成酶对草甘膦的抗性比植物来源的酶高两个 数量级左右，所以，用基因工程的方法，把细菌的EPSP合成酶基因导入植物中，可使植物获得一定的 抗性。为提高抗性水平，可采用提高外源EPSP合成酶基因的表达量或通过定点突变降低该酶对草甘膦 亲和力等措施。Comai，L.等人将鼠伤寒沙门氏杆菌的aroA基因作定点突变，使EPSP合成酶的第101 位脯氨酸变成丝氨酸，用突变后的基因转化烟草，可使烟草对草甘膦表现出较强的抗性；Padgette SR 等人将大肠杆菌的aroA基因表达蛋白的第96位甘氨酸改成丙氨酸，突变后的EPSP合成酶无论存在 于大肠杆菌内还是在豌豆内，都因对草甘膦亲和力的降低而表现出较高水平的草甘膦抗性。此外，把 来源于农杆菌变种CP4的抗草甘膦的EPSP合成酶基因引入甜菜、棉花和大豆中，均成功获得具有草甘 膦抗性的转基因作物。
但是，外源基因过量表达必然会影响植物自身的生长。而由于对酶活性中心附近氨基酸残基的作 用并不明了，所以，定点突变的效果十分有限。目前，遇到的困难是，定点突变后的EPSP合成酶对草 甘膦亲和力的下降也伴随着对原底物亲和力的下降，也即影响了酶的催化活性。
本发明的目的是提供一种基因优化的方法，以此方法可以人为加大发生基因突变的几率；并通过 该基因优化方法获得发生修饰突变的高活性的抗草甘膦的EPSP合成酶基因，以及含有此基因的质粒和 转化子。该基因编码的EPSP合成酶具有较高的抗草甘膦的水平，可作为培育抗草甘膦农作物新品种的 优良材料。
本发明的基因优化方法是同时用两个或两个以上同源性大于50％的基因序列作为源模板，设计与 源模板序列相对应的两端引物，并采用两步扩增反应的PCR扩增方法，从而得到一系列具有多点突变的 基因片段。
首先，要选择两个或两个以上同源性大于50％的基因序列作为源模板，并设计出与源模板序列相 对应的两端引物。第一步扩增的目的是通过一端引物与源模板的随机结合，交错延伸，合成一系列序 列各异的重组的DNA单链。引物的用量较少，大约是1pmol-5pmol即可。DNA链延伸的时间也较短， 可取1-5秒，即每次引物与模板退火结合后，最多只延伸几十bp，便进入下一个变性-复性-延伸的循 环。由于DNA具有同源重组的特性，所以，在每一次退火时，引物与各模板间的结合机会是相等的。 引物与模板结合的随机性，就造成了延伸的DNA链的不均一性。为增大延伸中的DNA链与模板结合的 机会，本发明设计了两个循环程序，第一个循环只进行5-10次，退火温度较低，约40-50℃，以保证 起始引物与模板的退火结合；第二个循环进行30-60次，并且退火温度也要相应提高到50-60℃，使 上述循环中合成的短DNA链与模板的结合比起始引物与模板的结合更有优势。在每一次循环中，延伸 链在各模板间随机结合，随机读取各模板序列信息，指导自身的合成。最终，合成出一系列不均一地 携带了各源模板序列信息的新的DNA片段。
以第一步扩增所获得的产物作为模板，加入根据源模板设计的两端引物，进行第二步扩增。热循 环所需的各温度时间参数按常规要求即可。30次循环后，便可获得一系列发生多点突变的完整的基因 片段。
本发明的基因优化方法的具体条件和操作步骤如下：
第一步扩增反应：
反应系统：1×taqDNA聚合酶缓冲液，4种dNTP各200umol/L，根据各模板5’-端设计的引物各 1pmol-5pmol，各源模板DNA约102-104拷贝，taqDNA聚合酶约0.5-5U。
反应程序及参数变化范围：
[1]预变性：94℃，5-10分钟；
[2]循环1：94℃60秒，40-50℃60秒， 72℃1-5秒，循环5-10次；
[3]循环2：94℃60秒，50-60℃60秒， 72℃5秒，循环30-60次；
[4]72℃10分钟。
第二步扩增反应：
反应系统：1×taqDNA聚合酶缓冲液，4种dNTP各200umol/L，根据各模板5’-端和3’-端设计 的引物各10pmol-50pmol，取上述第一步扩增反应的反应产物1ul作为模板，taqDNA聚合酶约0.5-5U。
反应程序及参数变化范围：
[1]94℃5分钟；
[2]循环：94℃90秒，45-55℃30-90秒，72℃60-240秒，循环30次；
[3]72℃10分钟。
按照上述本发明的基因优化方法，选择大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌的EPSP合成酶基因序列为 源模板，并设计出如下三条与该两个模板相对应的两端引物：
引物1：5’-CATG CCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3’，
引物2：5’-CGC GGATCCTCAGGCTGCCTGGCTAATCC-3’，
引物3：5’-CGC GGATCCTTAGGCAGGCGTACTCATTC-3’；
即可合成突变的EPSP合成酶基因。产物包括命名为aroAM12的DNA序列和命名为aroAM13的DNA 序列，它们分别如序列表1和序列表2所示。
将上述得到的aroAM12 DNA序列插入到质粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位点之间，即可得到含 有aroAM12 DNA序列的质粒pET-aroAM12，其结构如图1所示；将上述得到的aroAM13 DNA序列插入 到质粒pET11d的NcoI和BamHI酶切位点之间，即可得到含有aroAM13 DNA序列的质粒pET-aroAM13， 其结构如图2所示。
用上述得到的质粒pET-aroAM12转化大肠杆菌BL-21(DE3)，即可获得命名为BL21(aroAM12)的 具有草甘膦抗性的转化子；用上述得到的质粒pET-aroAM13转化大肠杆菌BL-21(DE3)，即可获得命 名为BL21(aroAM13)的具有草甘膦抗性的转化子。
下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
图1是pET-aroAM12质粒结构图；
图2是pET-aroAM13质粒结构图；
图3是转化子在含20mM草甘膦的M9液体培养基中的生长曲线；
图4是转化子在含30mM草甘膦的M9液体培养基中的生长曲线；
图5是转化子在含60mM草甘膦的M9液体培养基中的生长曲线；
图6是各转化子的蛋白电泳图；
图7是EPSP合成酶表达载体的构建图。
实施例1、突变EPSP合成酶基因的合成
根据从GENE BANK中查知的大肠杆菌(Escherichia coli)和鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)的EPSP合成酶基因的DNA序列，并通过比较发现，这两个序列的同源性为79％，符合 基因优化法的要求，可作为源模板。由于该两个序列的5’-端序列是相同的，所以，5’-端引物也可 相同。根据基因优化法的要求，设计出三条引物：
引物1：5’-CATG CCATGGAATCCCTGACGTTACAA-3’，
引物2：5’-CGC GGATCCTCAGGCTGCCTGGCTAATCC-3’，
引物3：5’-CGC GGATCCTTAGGCAGGCGTACTCATTC-3’；
上述带下划线处，表示相应的酶切位点。其中，引物1是在前面加有一个Nco I酶切位点的大肠 杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌的EPSP合成酶基因的相同的起始序列。引物2和引物3分别是大肠杆菌和鼠 伤寒沙门氏杆菌的EPSP合成酶基因1284bp前的序列加上BamHI的酶切位点。
合成反应包括两步PCR扩增，可按如下步骤和条件进行：
第一步扩增反应：
反应系统：在反应液中有两个模板(大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌的核DNA)各约102-104拷贝 以及1.5pmol引物1，各种dNTP200umol/L，1×taqDNA聚合酶缓冲液，taqDNA聚合酶约0.5-5U。
反应条件：
[1]预变性：94℃，10分钟；
[2]循环1：94℃60秒，45℃60秒，72℃5秒；循环5次；
[3]循环2：94℃60秒，55℃60秒，72℃5秒；循环30次；
[4]72℃10分钟。
第二步扩增：
第一步扩增反应完毕，取反应液1微升作为第二轮反应的模板，并以1×taqDNA聚合酶缓冲液， 4种dNTP各200umol/L，引物1-3各15pmol，taqDNA聚合酶约0.5-5U构成反应系统。
反应条件：
[1]94℃5分钟；
[2]循环：94℃90秒，55℃90秒，72℃120秒；循环30次；
[3]72℃10分钟。
两步扩增反应进行完毕后，琼脂糖电泳鉴定PCR扩增结果。发现经PCR扩增，获得长约1.3kb左 右的DNA片段，与预期的EPSP合成酶基因的大小相吻合。由于采用了特定的基因优化方法，所以，所 获得的DNA片段并非序列均一的野生型的大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏杆菌的EPSP合成酶基因，而是不同 程度地携带着两源模板序列信息的，也即发生了不同程度突变的一组重组的EPSP合成酶基因。
实施例2、EPSP合成酶表达载体的构建及转化子的获得
把上述实施例1经PCR扩增后所获得的序列不均一DNA片段走琼脂糖凝胶电泳，并割下含有大小 约为1.3kb的DNA的凝胶带，用QIAGEN公司的“QIAquick Gel Extration Kit”，分离纯化这些DNA 片段。分离完毕，与质粒pET 11d同时分别用限制性内切酶NcoI和BamHI酶切，再把两者按载体： 插入片段＝1∶3的比例混合，用T4连接酶在16℃连接12小时。
取部分连接液，用标准氯化钙转化法转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得的转化子转点到含有30mM草 甘膦和1mM IPTG的M9固体培养基上，筛选能在该培养基上生长的具草甘膦抗性的转化子。把这些 初步筛选获得的抗性转化子转点到含有60mM草甘膦和1mM IPTG的M9固体培养基上，得到了两个具 有较强抗草甘膦活性的转化子，分别命名为BL21(aroAM12)和BL21(aroAM13)。
用QIAGEN公司的“QIAprep Spin Miniprep Kit”从转化子BL21(aroAM12)和BL21(aroAM13)中 提取质粒，分别命名为pET-aroAM12、pET-aroAM13(其结构分别如图1、图2所示)。以NcoI和BamHI 双酶切这两个重组质粒，琼脂糖电泳分析，得到大小分别约为5.7kb和1.3kb的片段。电泳结果说明， 在这两个质粒的NcoI和BamHI两酶切位点间，分别含有PCR扩增所获得的1.3Kb片段。用ABI377测 序仪测定插入片段的DNA序列，进一步证明克隆到载体pET 11d的NcoI和BamHI两酶切位点间的， 是发生突变的EPSP合成酶基因。我们把这两个突变的基因片段，分别命名为aroAM12和aroAM13。 aroAM12和aroAN13的DNA序列及其所编码的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶的氨基酸序列分别见序列 表1和序列表2。
同时，用上述实施例1的引物1-3，以大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌的核DNA为模板，采用标准 的PCR扩增法，获得野生型的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏杆菌的EPSP合成酶基因，分别命名为EcaroA和 StaroA，分别克隆到质粒pET-11d的NcoI和BamHI酶切位点间。重组质粒分别命名为pET-EcaroA 和pET-StaroA，用该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，所得转化子分别命名为BL21(EcaroA)和 BL21(StaroA)，作为上述含突变基因的转化子的对照。
以上所述的质粒pET-aroAM12、pET-aroAM13、pET-EcaroA和pET-StaroA的构建过程如图7所示。 图7中的“aroA”代表EPSP合成酶基因aroAM12、aroAM13、EcaroA或StaroA；“pET-aroA”代表 质粒pET-aroAM12、pET-aroAM13、pET-EcaroA或pET-StaroA。
实施例3、转化子aroAM12、aroAM13草甘膦抗性的检验
将转化子BL21(aroAM12)和BL21(aroAM13)以及BL21(EcaroA)和BL21(StaroA)，分别接种到含有 1mM IPTG、50μg/ml氨卞青霉素以及20、30或60mM草甘膦的M9基础培养基中，以200rpm、37 ℃空气浴的条件培养。从培养至16小时开始，每隔2小时测定一次培养液OD600，记录其生长情况， 测定结果如图3至图5所示。从图3至图5的生长曲线可以看出，携带突变基因的转化子在含有60mM 草甘膦的M9基本培养基上仍能生存，而携带有野生型基因的转化子在含有20mM的草甘膦的M9基本 培养基上的生长已受到严重的抑制。由此可见，突变子的抗草甘膦能力比野生型有了明显提高。
实施例4、突变EPSP合成酶基因DNA序列的测定及与野生型基因的比较
将本发明的突变基因aroAM12和aroAM13分别与野生型的EPSP合成酶基因(EcaroA和StaroA) 作序列相似性的比较，发现aroAM112与对照StaroA相似，aroAM13与对照EcaroA相似，分别在不同 位点发生突变，结果如下述序列所示。
aroAM12编码的EPSP合成酶的氨基酸突变位点：
StaroA MESLTLQPIARVDGAINLPGSKSVSNRALLLAALPCGKTALTNLLDSDDVRHMLNALSAL 60
M12 L AC T VL MN 60
StaroA GINYTLSADRTRCDITGNGGALRAPGALELFLGNAGTAMRPLAAALCLGQNEIVLTGEPR 120
M12 L HA 120
StaroA MKERPIGHLVDSLRQGGANIDYLEQENYPPLRLRGGFTGGDIEVDGSVSSQFLTALLMTA 180
M12 180
StaroA PLAPKDTIIRVKGELVSKPYIDITLNLMKTFGVEIANHHYQQFVVKGGQQYHSPGRYLVE 240
M12 P ED Y ND Q KY 240
StaroA GDASSASYFLAAGAIKGGTVKVTGIGRKSMQGDIRFADVLEKMGATITWGDDFIACTRGE 300
M12 300
StaroA LHAIDMIMNHIPDAAMTIATTALFAKGTTTLRNIYNWRVKETDRLFAMATELRKVGAEVE 360
M12 360
StaroA EGHDYIRITPPAKLQHADIGTYNDHRMAMCFSLVALSDTPVTILDPKCTAKTFPDYFEQL 420
M12 420
StaroA ARMSTPA 427
M12 427
aroAM13编码的EPSP合成酶的氨基酸突变位点：
EcaroA MESLTLQPIARVDGTINLPGSKTVSNRALLLAALAHGKTVLTNLLDSDDVRHMLNALTAL 60
aroAM13 K SV 60
EcaroA GVSYTLSADRTRCEIIGNGGPLHAEGALELFLGNAGTAMRPLAAALCLGSNDIVLTGEPR 120
aroAM13 120
EcaroA MKERPIGHLVDALRLGGAKITYLEQENYPPLRLQGGFTGGNVDVDGSVSSQFLTALLMTA 180
aroAM13 180
EcaroA PLAPEDTVIRIKGDLVSKPYIDITLNLMKTFGVEIENQHYQQFVVKGGQSYQSPGTYLVE 240
aroAM13 240
EcaroA GDASSASYFLAAAAIKGGTVKVTGIGRNSMQGDIRFADVLEKMGATICWGDDYISCTRGE 300
aroAM13 300
EcaroA LNAIDMDMNHIPDAAMTIATAALFAKGTTRLRNIYNWRVKETDRLFAMATELRKVGAEVE 360
aroAM13 T TL 360
EcaroA EGHDYIRITPPEKLNFAEIATYNDHRMAMCFSLVALSDTPVTILDPKCTAKTFPDYFEQL 420
aroAM13 420
EcaroA ARISQAA 427
aroAM13 427
从上述序列可见：
命名为aroAM12的DNA序列的特征是，其所编码的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶的氨基酸序列 与鼠伤寒沙门氏杆菌aroA基因(StaroA)所编码的氨基酸序列相比，含有下列氨基酸置换：脯氨酸35 →丙氨酸；丙氨酸40→缬氨酸；苏氨酸42→蛋氨酸；精氨酸83→组氨酸；赖氨酸185→谷氨酸；异氨 酸201→天冬酰胺；谷氨酰胺230→赖氨酸。
命名为aroAM13的DNA序列的特征是，其所编码的具有草甘膦抗性的EPSP合成酶的氨基酸序列 与大肠杆菌aroA基因(EcaroA)所编码的氨基酸序列相比，含有下列氨基酸置换：苏氨酸23→丝氨酸； 精氨酸330→苏氨酸。
实施例5、各转化子的蛋白质表达情况的分析
分别用5ml含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液体培养基培养转化子BL21(aroAM12)、 BL21(aroAM13)以及BL21(EcaroA)、BL21(StaroA)，以200rpm、37℃空气浴的条件至细胞浓度达108/ml， 以1％的接种量，转接到新鲜的含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液体培养基中，200rpm、37℃继续 培养至OD600＝0.75时，加入IPTG至1mM以诱导重组蛋白的合成。在前述条件下，继续培养三小时。 离心收取菌体，采用Laemmli所述的方法，先用SDS-PAGE样品缓冲液重悬菌体，12.5％SDS-PAGE凝 胶电泳分离蛋白质。电泳完毕，用20％的考马氏亮蓝染色。电泳结果如图4所示，第一道为不含质粒 的大肠杆菌BL-21的蛋白粗提物；第二至第五道分别是含有质粒pET-StaroA，pET-EcaroA， pET-aroAM12和pET-aroAM13的BL-21的蛋白粗提物。从蛋白图谱上可见，经IPTG诱导之后，在所有 含有质粒的转化子的蛋白样品中均检测到了EPSP合成酶45KD的特异性蛋白带(如图中箭头所指位置)， 而作为空白对照的不含质粒的大肠杆菌BL-21，则没有产生该蛋白带。蛋白电泳结果表明，EPSP合成 酶基因得到有效表达。所检测的两个突变基因及其对照，即分别携带aroAM12、aroAM13以及EcaroA、 StaroA基因的转化子，在相同培养条件下，对EPSP合成酶蛋白的表达水平没有明显不同。该结果提 示我们，对草甘膦抗性的提高，不是由于EPSP合成酶表达量的提高而引起的。
实施例6、EPSP合成酶粗提物的制备
分别用5ml含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液体培养基培养转化子aroAM12、aroAM13以及 EcaroA、StaroA，以200rpm、37℃空气浴的条件至细胞浓度达108/ml，以1％的接种量，转接到新 鲜的含有50μg/ml氨卞青霉素的LB液体培养基中，200rpm、37℃继续培养至OD600＝0.75时，加 入IPTG至1mM以诱导重组蛋白的合成。在前述条件下，继续培养三小时。离心收取菌体。用缓冲液A (50mM Tris-Cl，0.1mM DTT，pH7.2)重悬菌体。细胞悬液置-70℃冻结，再在室温中重融。然后用 Fluko公司的乳化机处理细胞悬液使其破壁。以12000rpm离心30分钟，弃去细胞碎片。上清液即为 EPSP合成酶粗提物，可用于有关该酶的各项指标的测定。
实施例7、制备S-3-P(shikimate-3-phosphate)
S-3-P的制备采取P.F.Knowles等的方法，从Klebsiella pneumoniae(ATCC 25597)的培养液 中提取。接种该菌于12升营养肉汤液体培养基(酵母提取物2.8g/L，牛肉膏7.8g/L，酪蛋白7.8g/L， 葡萄糖5.6g/L，氯化钠5.6g/L，pH7.5)中，37℃振摇培养90小时。离心去菌体，用盐酸调节上 清液pH至3，并加入0.5ml甲苯，上30目活性炭柱，依次用2升已用盐酸调节pH至2.5的水：1.5％，5％ 和10％的乙醇洗柱。最后，用500ml没酸化的5％乙醇洗柱子一次。然后，用2.5升5％乙醇、3升10％ 乙醇、2升25％乙醇洗脱所要的S-3-P。合并所有的洗脱液，用真空干燥法干燥除水，得到糖浆状的残 留物。把该糖浆状物溶于150ml水中，用氨水调pH至7，加入100ml乙酸钡与之反应，然后加乙醇至 80％(v/v)的浓度，0℃放置过夜。离心收取沉淀，并用75％乙醇洗沉淀两次，用无水乙醇洗沉淀一次， 真空干燥后，便获得S3P的钡盐，可用于EPSP合成酶酶活的测定。
实施例8、EPSP合成酶活力及米氏常数的测定
EPSP合成酶活力的测定采用Lanzetta所述的孔雀绿显色定量测定无机磷的方法。反应系统含有 50mM Hepes/NaOH，pH7.2，1mM PEP，0.5mM S-3-P，0.1mM(NH4)Mo7O24·4H2O。各组分按量加好 后，先在30℃预热5分钟，然后加入适量上述粗提酶液，酶反应持续20分钟，即加入孔雀绿溶液终 止反应。精确反应60秒，立刻加入34％柠檬酸钠溶液，混匀后静置15分钟，测定0D660，所用的空白 对照管的成分与反应管起始成分相同，区别在于没有酶作用的时间，即加入酶液后，立刻加入孔雀绿 溶液，其它各步操作与酶反应管相同。
米氏常数的测定，采用传统的双倒数作图法。测定结果如表一所示。
表一
酶的名称 酶的比活a (nkat/mg protein) 米氏常数Km(PEP)b (mM) 米氏常数 Ki[草甘膦]c (mM) StaroA EcaroA aroA-M12 aroA-M13 0.096±0.014 0.107±0.015 1.358±0.21 1.245±0.20 0.801±0.008 0.464±0.014 0.038±0.0004 0.025±0.002 0.003±0.001 0.012±0.001 0.351±0.028 0.338±0.017
a.酶的比活，是在底物过量的条件下，即在含1.0mMPEP和0.5mM S-3-P的反应系统中测定的 酶的比活力。
b.表示底物之一PEP所对应的米氏常数，反应系统中，S-3-P的含量固定在0.5mM，而PEP则取由 0.1mM至0.5mM的一系列变化值。
c.表示PEP的竞争性抑制剂草甘膦与酶的解离常数。
d.以上各数据均为对两批EPSP合成酶粗提物，各测定三次后获得。
虽然在现有的报导中，不乏用遗传工程的手段使第一类EPSP合成酶的草甘膦抗性提高的成功例 子。但是，第一类酶却有一个典型的特点：抗性的提高，伴随着酶与底物之一PEP的亲和力的下降， 也即K[PEP]的增大，从而导致酶的催化效率的下降。前述的较成功的例子，即将突变后的第101位脯氨 酸变成丝氨酸的鼠伤寒沙门氏杆菌的aroA基因转化烟草，使烟草对草甘膦表现出较强的抗性；以及 将突变后的第96位甘氨酸变成丙氨酸的大肠杆菌的aroA基因转化豌豆，因EPSP合成酶对草甘膦亲 和力的降低而使转化后的豌豆表现出较高水平的草甘膦抗性，都属于这种情况。由于K[PEP]的增大，降 低了酶的催化效率，因此抗性的获得，依赖于EPSP合成酶的过量表达，而这样往往会导致作物产量的 减少。
从测序结果亦可见，酶蛋白的突变，是由于氨基酸的置换而非由于氨基酸的增加或缺失而引起的。 并且，发生置换的氨基酸，并不包含在前人报导的与酶的活性中心或酶与底物(包括PEP，S-3-P和 草甘膦)的结合位点相关的氨基酸中。根据前人的研究推测，K22，R27，G96，R100和P101等氨基酸 是酶与底物S-3-P结合的相关位点；而H385，C408和K411等氨基酸则和酶与PEP的结合有关。并且， 本发明所涉及的氨基酸置换，也未见有关其在草甘膦抗性中起重要作用的报导。
本发明创立了一个独特而有效的基因优化的方法，在传统PCR扩增法的基础上加以改良，选用了 多于一个的模板，并设计出与之相适应的引物，通过随机结合，交错延伸的PCR扩增过程，克服了定 点突变的局限性，增大了基因突变的几率和幅度。并运用本方法，获得了发生多点突变的EPSP合成酶 基因，从中筛选到正向突变的两个高抗性的突变子，与作为模板的野生型酶相比，具有高得多的酶活 力(降低的K[PEP])和大大增强的草甘膦抗性(升高的Ki[草甘膦])。这是首次有关第一类EPSP合成酶具有 该性质的报导。aroAM12的Ki[草甘膦]比鼠伤寒沙门氏杆菌的提高了117倍，而K[PEP]却仅为鼠伤寒沙门氏 杆菌的0.047％。aroAM13的Ki[草甘膦]比大肠杆菌的提高了28倍，而K[PEP]却仅为大肠杆菌的0.054％。 aroAM12的Ki[草甘膦]/K[PEP]值比鼠伤寒沙门氏杆菌的增大了2600倍；而aroAM13的Ki[草甘膦]/K[PEP]值比 大肠杆菌的增大了510倍。本发明提供的两个突变基因，都有望成为构建抗草甘膦农作物新品种的优 良材料。
序列表1
1.序列特征：长度：1284bp；类型：核酸及相应蛋白质；链数：单链；几何结构：线性；
2.分子类型：DNA；
3.来源：人工合成；
4.序列描述：SEQ ID NO.1
ATG GAA TCC CTG ACG TTA CAA CCC ATC GCG CGG GTC GAT GGC GCC ATT 48
M E S L T L Q P I A R V D G A I
1 5 10 15
AAT TTA CCT GGC TCC AAA AGT GTT TCA AAC CGT GCT TTG CTC CTG GCG 96
N L P G S K S V S N R A L L L A
20 25 30
GCT TTA GCT TGT GGT AAA ACC GTT CTG ATG AAT CTG CTG GAT AGC GAT 144
A L A C G K T V L M N L L D S D
35 40 45
GAC GTC CGC CAT ATG CTC AAT GCC CTG AGC GCG TTG GGG ATC AAT TAC 192
D V R H M L N A L S A L G I N Y
50 55 60
ACC CTT TCT GCC GAT CGC ACC CGC TGT GAT ATC ACG GGT AAT GGC GGC 240
T L S A D R T R C D I T G N G G
65 70 75 80
GCA TTA CAT GCG CCA GGC GCT CTG GAA CTG TTT CTC GGT AAT GCC GGA 288
A L H A P G A L E L F L G N A G
85 90 95
ACC GCG ATG CGT CCG TTA GCG GCA GCG CTT TGT CTG GGG CAA AAT GAG 336
T A M R P L A A A L C L G Q N E
100 105 110
ATA GTG TTA ACC GGC GAA CCG CGT ATG AAA GAG CGT CCG ATA GGC CAT 384
I V L T G E P R M K E R P I G H
115 120 125
CTG GTC GAT TCG CTG CGT CAG GGC GGG GCG AAT ATT GAT TAC CTG GAG 432
L V D S L R Q G G A N I D Y L E
130 135 140
CAG GAA AAC TAT CCG CCC CTG CGT CTG CGC GGC GGT TTT ACC GGC GGC 480
Q E N Y P P L R L R G G F T G G
145 150 155 160
GAC ATT GAG GTT GAT GGT AGC GTT TCC AGC CAG TTC CTG ACC GCT CTG 528
D I E V D G S V S S Q F L T A L
165 170 175
CTG ATG ACG GCG CCG CTG GCG CCT GAA GAC ACA ATT ATT CGC GTT AAA 576
L M T A P L A P E D T I I R V K
180 185 190
GGC GAA CTG GTA TCA AAA CCT TAC AAC GAT ATC ACG CTA AAT TTA ATG 624
G E L V S K P Y N D I T L N L M
195 200 205
AAA ACC TTT GGC GTG GAG ATA GCG AAC CAT CAC TAC CAA CAA TTT GTC 672
K T F G V E I A N H H Y Q Q F V
210 215 220
GTG AAG GGC GGT CAA AAG TAT CAC TCT CCA GGT CGC TAT CTG GTC GAG 720
V K G G Q K Y H S P G R Y L V E
225 230 235 240
GGC GAT GCC TCG TCA GCG TCC TAT TTT CTC GCC GCT GGG GCG ATA AAA 768
G D A S S A S Y F L A A G A I K
245 250 255
GGC GGC ACG GTA AAA GTG ACC GGG ATT GGC CGC AAA AGT ATG CAG GGC 816
G G T V K V T G I G R K S M Q G
260 265 270
GAT ATT CGT TTT GCC GAT GTG CTG GAG AAA ATG GGC GCG ACC ATT ACC 864
D I R F A D V L E K M G A T I T
275 280 285
TGG GGC GAT GAT TTT ATT GCC TGC ACG CGC GGC GAA TTG CAC GCC ATA 912
W G D D F I A C T R G E L H A I
290 295 300
GAT ATG GAT ATG AAC CAT ATT CCG GAT GCG GCG ATG ACG ATT GCC ACC 960
D M D M N H I P D A A M T I A T
305 310 315 320
ACG GCG CTG TTT GCG AAA GGA ACC ACG ACG TTG CGC AAT ATT TAT AAC 1008
T A L F A K G T T T L R N I Y N
325 330 335
TGG CGA GTG AAA GAA ACC GAT CGC CTG TTC GCG ATG GCG ACC GAG CTA 1056
W R V K E T D R L F A M A T E L
340 345 350
CGT AAA GTG GGC GCT GAA GTC GAA GAA GGG CAC GAC TAT ATT CGT ATC 1104
R K V G A E V E E G H D Y I R I
355 360 365
ACG CCG CCG GCG AAG CTC CAA CAC GCG GAT ATT GGC ACG TAC AAC GAC 1152
T P P A K L Q H A D I G T Y N D
370 375 380
CAC CGT ATG GCG ATG TGT TTC TCA CTG GTC GCA CTG TCC GAT ACG CCA 1200
H R M A M C F S L V A L S D T P
385 390 395 400
GTC ACG ATC CTG GAC CCT AAA TGT ACC GCA AAA ACG TTC CCT GAT TAT 1248
V T I L D P K C T A K T F P D Y
405 410 415
TTC GAA CAA CTG GCG CGA ATG AGT ACG CCT GCC TAA 1284
F E Q L A R M S T P A *
420 425
序列表2
1.序列特征：长度：1284bp；类型：核酸及相应蛋白质；链数：单链；几何结构：线性；
2.分子类型：DNA；
3.来源：人工合成；
4.序列描述：SEQ ID NO.2
ATG GAA TCC CTG ACG TTA CAA CCC ATC GCT CGT GTC GAT GGC ACT ATT 48
M E S L T L Q P I A R V D G T I
1 5 10 15
AAT CTG CCC GGT TCC AAG AGC GTT TCT AAC CGC GCT TTA TTG CTG GCG 96
N L P G S K S V S N R A L L L A
20 25 30
GCA TTA GCA CAC GGC AAA ACA GTA TTA ACC AAT CTG CTG GAT AGC GAT 144
A L A H G K T V L T N L L D S D
35 40 45
GAC GTG CGC CAT ATG CTG AAT GCA TTA ACA GCG TTA GGG GTA AGC TAT 192
D V R H M L N A L T A L G V S Y
50 55 60
ACG CTT TCA GCC GAT CGT ACG CGT TGC GAA ATT ATC GGT AAC GGC GGT 240
T L S A D R T R C E I I G N G G
65 70 75 80
CCA TTA CAC GCA GAA GGT GCC CTG GAG TTG TTC CTC GGT AAC GCC GGA 288
P L H A E G A L E L F L G N A G
85 90 95
ACG GCA ATG CGT CCG CTG GCG GCA GCT CTT TGT CTG GGT AGC AAT GAT 336
T A M R P L A A A L C L G S N D
100 105 110
ATT GTG CTG ACC GGT GAG CCG CGT ATG AAA GAA CGC CCG ATT GGT CAT 384
I V L T G E P R M K E R P I G H
115 120 125
CTG GTG GAT GCG CTG CGC CTG GGC GGG GCG AAG ATC ACT TAC CTG GAA 432
L V D A L R L G G A K I T Y L E
130 135 140
CAA GAA AAT TAT CCG CCG TTG CGT TTA CAG GGC GGC TTT ACT GGC GGC 480
Q E N Y P P L R L Q G G F T G G
145 150 155 160
AAC GTT GAC GTT GAT GGC TCC GTT TCC AGC CAA TTC CTC ACC GCA CTG 528
N V D V D G S V S S Q F L T A L
165 170 175
TTA ATG ACT GCG CCT CTT GCG CCG GAA GAT ACG GTG ATT CGT ATT AAA 576
L M T A P L A P E D T V I R I K
180 185 190
GGC GAT CTG GTT TCT AAA CCT TAT ATC GAC ATC ACA CTC AAT CTG ATG 624
G D L V S K P Y I D I T L N L M
195 200 205
AAG ACG TTT GGT GTT GAA ATT GAA AAT CAG CAC TAT CAA CAA TTT GTC 672
K T F G V E I E N Q H Y Q Q F V
210 215 220
GTA AAA GGC GGG CAG TCT TAT CAG TCT CCG GGT ACT TAT TTG GTC GAA 720
V K G G Q S Y Q S P G T Y L V E
225 230 235 240
GGC GAT GCA TCT TCG GCT TCT TAC TTT CTG GCA GCA GCA GCA ATC AAA 768
G D A S S A S Y F L A A A A I K
245 250 255
GGC GGC ACT GTA AAA GTG ACC GGT ATT GGA CGT AAC AGT ATG CAG GGT 816
G G T V K V T G I G R N S M Q G
260 265 270
GAT ATT CGC TTT GCT GAT GTG CTG GAA AAA ATG GGC GCG ACC ATT TGC 864
D I R F A D V L E K M G A T I C
275 280 285
TGG GGC GAT GAT TAT ATT TCC TGC ACG CGT GGT GAA CTG AAC GCT ATT 912
W G D D Y I S C T R G E L N A I
290 295 300
GAT ATG GAT ATG AAC CAT ATT CCT GAT GCG GCG ATG ACC ATT GCC ACG 960
D M D M N H I P D A A M T I A T
305 310 315 320
GCG GCG TTA TTT GCA AAA GGC ACC ACC ACG CTG CGC AAT ATC TAT AAC 1008
A A L F A K G T T T L R N I Y N
325 330 335
TGG CGT GTT AAA GAG ACC GAT CGC CTG TTT GCG ATG GCA ACA GAA CTG 1056
W R V K E T D R L F A M A T E L
340 345 350
CGT AAA GTC GGC GCG GAA GTG GAA GAG GGG CAC GAT TAC ATT CGT ATC 1104
R K V G A E V E E G H D Y I R I
355 360 365
ACA CCT CCG GAA AAA CTG AAC TTT GCC GAG ATC GCG ACA TAC AAT GAT 1152
T P P E K L N F A E I A T Y N D
370 375 380
CAC CGG ATG GCG ATG TGT TTC TCG CTG GTG GCG TTG TCA GAT ACA CCA 1200
H R M A M C F S L V A L S D T P
385 390 395 400
GTG ACG ATT CTT GAT CCC AAA TGC ACG GCC AAA ACA TTT CCG GAT TAT 1248
V T I L D P K C T A K T F P D Y
405 410 415
TTC GAG CAG CTG GCG CGG ATT AGC CAG GCA GCC TGA 1284
F E Q L A R I S Q A A *
420 425