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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610277828.0 (22)申请日 2016.04.28 (71)申请人 王晓冰 地址 201600 上海市松江区莘松路1288弄 1251号1201室 (72)发明人 王晓冰 (74)专利代理机构 上海申新律师事务所 31272 代理人 竺路玲 (51)Int.Cl. C12N 5/0783(2010.01) A61K 35/17(2015.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种改良的NK细胞培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种改良。
2、的NK细胞培养方法， 本发明的培养方法分离培养的NK细胞的数量足， 扩增快， 一般外周血培养15天， 能够达到70亿个 细胞； 本发明通过培养基中添加乙酰化 葡聚糖 作为激活调动剂， 成功激活了NK细胞， 促使其分 泌IL2、 IL12和IFN-， 而IL2、 IL12和IFN-在NK 细胞活化后维持其活性和扩增速率起到关键的 作用， 使其更具有临床应用价值； 此外， 本发明方 法获得NK细胞的纯度高， 对流式细胞仪的检测结 果进行分析， 发现CD3-CD56+的NK细胞数达到 80以上， 满足临床应用的要求。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 105907714 A 2016.08。
3、.31 CN 105907714 A 1.一种改良的NK细胞培养方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤1： 用PBS稀释单克隆抗体CD16和CD2获得抗体稀释液， 然后用抗体稀释液过夜包被 细胞培养容器； 步骤2： 分离单个核细胞； 步骤3： 将步骤2获得的单个核细胞接种到培养容器中， 从接种时间开始计时， 每隔3天 更换新鲜的细胞培养基， 培养18天后收集细胞； 所述的细胞培养基中含有乙酰化 葡聚糖。 2.根据权利要求1所述的一种改良的NK细胞培养方法， 其特征在于， 所述的乙酰化 葡 聚糖浓度为10mg/ml。 3.根据权利要求1所述的一种改良的NK细胞培养方法， 其特征在于， 所述的。
4、细胞培养 基， 还含有10knockout血清替代品和500U/ml的IL-2。 4.根据权利要求1所述的一种改良的NK细胞培养方法， 其特征在于， 所述的细胞培养基 为CellGroSCGM或RPMI-1640培养基。 5.根据权利要求1所述的一种改良的NK细胞培养方法， 其特征在于， 所述的培养容器为 细胞培养瓶或细胞培养板。 6.根据权利要求1所述的一种改良的NK细胞培养方法， 其特征在于， 所述的培养容器为 T75细胞培养瓶。 7.根据权利要求1所述的一种改良的NK细胞培养方法， 其特征在于， 所述步骤3的接种 细胞密度为2106/ml。 8.根据权利要求1-7任意一项所述方法培养得到。
5、的NK细胞。 9.根据权利要求8所述的NK细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105907714 A 2 一种改良的NK细胞培养方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞培养领域， 尤其涉及一种改良的NK细胞培养方法。 背景技术 0002 自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK)是机体重要的免疫细胞， 主要分布于外 周血中， 占PBMC的5-10， 淋巴结和骨髓中也有NK活性， 但水平较外周血低。 NK细胞是一 群异质性、 多功能的免疫细胞， 是人类的众多免疫细胞中的一种， 表现为自然细胞毒活性的 杀伤细胞。 主要作用消灭攻击人类身体的病毒、 细菌、。
6、 癌细胞等。 发挥作用的方式分为： 直接 杀伤、 释放穿孔素、 NK细胞毒因子和TNF等。 每个人的身体里至少有50亿个NK细胞， 多则达到 1000亿个。 但NK细胞的数量和其活动力不是成正比的。 即使NK细胞显示有足够的数量， 但是 不激活他们， 他们的工作效率也是非常低的。 0003 目前， 国内外已经有大量的研究者进行了人NK细胞的培养和生物治疗方面的研 究， 但多数研究都是单纯利用IL-2和IL-12等白介素类细胞因子去培养， 但是这样获得的结 果往往有两个弊端， 要么是数量上不去， 达不到治疗性回输所需的量， 要么是纯度上不去， 达不到应有的效果。 因为白介素类细胞因子都不是强烈的。
7、NK细胞活化剂， 缺乏强有力的活 化作用。 但是， 当NK细胞被充分活化后， 白介素类细胞因子对NK细胞的活性维持和增殖发挥 了极为重要的作用。 因此， 获得高数量高纯度的NK细胞， 首先需要充分活化NK细胞。 发明内容 0004 本发明为解决现有技术中的上述问题提供一种区别于传统培养法的人NK细胞的 培养方法， 使之简单易行。 本发明中培养获得的人NK细胞被活化， NK细胞分泌的IL2、 IL12和 IFN-的表达水平更高， 细胞纯度高， 生长良好， 细胞增殖更快， 且细胞得率和存活率均大 大提高。 0005 为了实现上述技术目的， 本发明所采取的技术措施为： 0006 一种改良的NK细胞培。
8、养方法， 包括以下步骤： 0007 步骤1： 用PBS稀释单克隆抗体CD16和CD2获得抗体稀释液， 然后用抗体稀释液过夜 包被细胞培养容器； 0008 步骤2： 分离单个核细胞； 0009 步骤3： 将步骤2获得的单个核细胞接种到培养容器中， 从接种时间开始计时， 每隔 3天更换新鲜的细胞培养基， 培养18天后收集细胞； 所述的细胞培养基中含有乙酰化 葡聚 糖。 0010 为了优化上述技术方案， 本发明所采取的技术措施还包括： 0011 优选地， 上述的乙酰化 葡聚糖浓度为10mg/ml。 0012 优选地， 上述的细胞培养基， 还含有10knockout血清替代品和500U/ml的IL-2。
9、。 0013 优选地， 上述的10knockout血清替代品还可以替换成人血小板裂解物。 0014 优选地， 上述的细胞培养基为CellGroSCGM或RPMI-1640培养基。 说明书 1/4 页 3 CN 105907714 A 3 0015 优选地， 上述的培养容器为细胞培养瓶或细胞培养板， 更优选为T75细胞培养瓶。 0016 优选地， 上述步骤2的接种细胞密度为2106/ml。 0017 另一方面， 本发明还提供根据上述的细胞培养方法培养得到的NK细胞及其在制备 抗肿瘤药物中的应用。 0018 本发明采用上述技术方案， 与现有技术相比， 具有如下技术效果： 0019 (1)传统的方法。
10、NK细胞扩增慢， 数量很难满足临床需求， 而利用本发明的培养方法 分离培养的NK细胞的数量足， 扩增快， 一般外周血培养15天， 能够达到70亿个细胞； 0020 (2)传统的方法NK细胞活性低， NK细胞的数量和其活性不成正比， 而本发明通过培 养基中添加乙酰化 葡聚糖作为激活调动剂， 成功激活了NK细胞， 促使其分泌IL2、 IL12和 IFN-， 而IL2、 IL12和IFN-在NK细胞活化后维持其活性和扩增速率起到关键的作用， 使 其更具有临床应用价值； 0021 (3)与传统方法相比， 本发明方法获得NK细胞的纯度高， 对流式细胞仪检测结果进 行分析， 发现CD3-CD56+的NK细。
11、胞数达到80以上。 附图说明 0022 图1为实施例一中分离培养的NK传代细胞的显微镜图(10X)； 0023 图2为实施例一中分离培养的NK传代细胞的显微镜图(20X)； 0024 图3为实施例一中分离培养的NK传代细胞的显微镜图(40X)。 具体实施方式 0025 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于本发明而不 用于限制本发明的范围。 0026 实施例1 0027 1.本方法与常规方法的细胞扩增倍数的比较 0028 本实施例中实验组分离培养NK细胞的细胞培养方法， 具体步骤如下： 0029 步骤1.取肝素抗凝的静脉血60ml， 分2支取单个核细胞(PBMC)。
12、。 具体步骤如下： 向 50ml离心管中加入15ml淋巴细胞分离液， 再贴着管壁， 缓慢加入30ml静脉血， 避免破坏淋巴 细胞分离液的水相。 400g， 离心20分钟。 将上层血浆小心吸出至新的50ml离心管中， 56加 热25分钟， 充分灭活补体， 待用。 将中间层的白膜层， 即单个核细胞层吸出至新的15ml离心 管中， 用0.01M的PBS充分洗涤3次， 洗涤时， 200g离心5分钟， 弃上清， 所得即为PBMC。 0030 步骤2.将离心所得的PBMC用上述培养基重悬， 即： 用含10knockout血清替代品 和乙酰化 葡聚糖的1640培养基重悬， 细胞密度调整为2106/ml， 将。
13、细胞重悬液转移到T75 培养瓶中， 每3天更换新的培养基， 并利用显微镜观察细胞形态(如附图1-3)。 0031 本实施例实验对象分为实验组和常规组两组。 其中， 常规组按传统的技术培养。 分 别在第0、 6、 12及18天从两组取培养细胞， 用台盼蓝染色后计数， 将计数当天的细胞总数除 以培养前的细胞数(即第0天)， 数值即为细胞的扩增倍数。 以此方法可以动态比较两组细胞 的扩增情况， 结果如表1所示： 在培养的第6、 12、 18天， 本法的细胞扩增倍数均显著高于常规 组， P0.05。 说明书 2/4 页 4 CN 105907714 A 4 0032 培养天数(天)061218 常规组。
14、112.452.2742.574.7980.455.68 实验组120.454.3470.344.56153.456.45 0033 表1本方法与常规方法的细胞扩增倍数的比较 0034 由表1可以分析得出， 传统的方法培养NK细胞， 成本高， 工艺复杂， 效果不理想， 并 且细胞扩增慢， 数量很难满足临床需求， 而利用本发明的培养方法工艺相对简单， 分离培养 的NK细胞的数量足， 扩增快， 能够满足临床需求。 0035 实施例2 0036 1.本方法与常规方法的细胞纯度的比较 0037 本实施例实验对象分为实验组和常规组两组。 其中， 实验组按实施例1中的细胞培 养方法培养NK细胞。 常规组按。
15、传统的技术培养。 在第18天分别从两组培养体系取细胞培养 液， PBS洗涤两次， 洗涤后调整细胞浓度为2X105/ml， 加入流式抗体， 4C避光30min， 洗掉多余 抗体， PBS重悬后， 对细胞表型进行流式检测。 所用抗体来自美国BD公司， 结果如表2所示， 常 规组的CD3-CD56+的NK细胞占50.161.02， 本方法的CD3-CD56+的NK细胞占82.86 1.83， 两组有显著性差异(P0.05)。 0038 组别CD3-CD56+ 常规组50.161.02 实验组82.861.83 0039 表2本方法与常规方法的细胞纯度的比较 0040 由表2可以分析得出， 传统方法获。
16、得的NK细胞的纯度低， 很大程度上限制了NK细胞 的应用， 而本发明方法获得NK细胞的纯度高， 通过流式细胞仪的检测， CD3-CD56+的NK细胞数 达到80以上， 纯度达到了临床应用的要求， 对其临床上的应用有着重要的指导意义。 0041 实施例3 0042 1.本方法与常规方法的细胞分泌的IL2、 IL12、 IFN-的分泌水平比较 0043 本实施例实验对象分为实验组和常规组两组。 其中， 实验组按实施例1中的细胞培 养方法培养NK细胞。 常规组按传统的技术培养。 在第18天分别从两组培养体系取100毫升细 胞培养液， 用常规方法浓缩之后， 用试剂盒检测其中的IL2、 IL12、 IF。
17、N-含量， 所有试剂盒 购买自武汉博士德生物工程有限公司。 实验结果如表3所示， 实验组细胞分泌的IL2、 IL12、 IFN-含量显著高于常规组含量(单位 g/ml)。 0044 组别IL2IL12IFN- 常规组111.3181.7252.3 实验组211.6300.9401.8 0045 表3本方法与常规方法的细胞分泌的IL2、 IL12、 IFN-的分泌水平比较 0046 由表3可以分析得出， 与传统方法相比， 本发明通过培养基中添加乙酰化 葡聚糖 作为激活调动剂， 成功激活了NK细胞， 促使其分泌IL2、 IL12和IFN-， 而IL2、 IL12和IFN- 在NK细胞活化后维持其活。
18、性和扩增速率起到关键的作用， 使其更具有临床应用价值。 说明书 3/4 页 5 CN 105907714 A 5 0047 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述， 但其只是作为范例， 本发明并不限 制于以上描述的具体实施例。 对于本领域技术人员而言， 任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。 因此， 在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改， 都应涵盖在本发明的范围内。 说明书 4/4 页 6 CN 105907714 A 6 图1 说明书附图 1/3 页 7 CN 105907714 A 7 图2 说明书附图 2/3 页 8 CN 105907714 A 8 图3 说明书附图 3/3 页 9 CN 105907714 A 9 。