一种植物叶绿素酶的纯化方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102115736 A (43)申请公布日 2011.07.06 CN 102115736 A *CN102115736A* (21)申请号 201010576405.1 (22)申请日 2010.12.07 C12N 9/16(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 唐蕾 张建华 张宏建 毛忠贵 (54) 发明名称 一种植物叶绿素酶的纯化方法 (57) 摘要 本发明属于植物生物技术领域， 公开了一种 植物叶绿素酶的纯化方法。本发明以植物蛋白粗 提液为材料， 依次采用有机溶剂沉淀、 离子交换色。

2、 谱和非变性凝胶电泳方法， 纯化叶绿素酶。利用 本发明的植物叶绿素酶纯化方法， 步骤简单、 周期 短、 操作方便， 克服了经典方法存在的步骤多、 酶 失活等缺陷。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 CN 102115738 A1/1 页 2 1. 一种植物叶绿素酶的纯化方法， 其特征在于， 依次采用有机溶剂沉淀、 离子交换色谱 和非变性凝胶电泳等方法， 纯化植物蛋白粗提液中的叶绿素酶。 2. 根据如权利要求 1 所述的有机溶剂沉淀方法， 其特征在于， 有机溶剂选用丙酮、 甲 醇、 乙醇中的任一种， 其在植物蛋。

3、白粗提液中的体积比浓度为 20-40。 3. 根据权利要求 1 所述的离子交换色谱方法， 其特征在于， 所述离子交换介质分别优 选 DEAE-Sephacel、 DEAE-Sepharose CL-6B。 4. 根据如权利要求 1 所述的非变性凝胶电泳方法， 其特征在于， 浓缩胶中丙烯酰胺的 质量浓度为 5-6， 分离胶中丙烯酰胺的质量浓度为 12-14。 权 利 要 求 书 CN 102115736 A CN 102115738 A1/3 页 3 一种植物叶绿素酶的纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及一种植物叶绿素酶的纯化方法， 具体地， 依次采用有机溶剂沉淀、 离子 交换层析和非变性凝。

4、胶电泳方法， 简洁地从植物蛋白粗提液中分离得到纯化的叶绿素酶， 属于植物生物技术领域。 背景技术 0002 叶绿素酶 (Chlorophyllase， EC 3.1.1.14)， 催化叶绿素水解生成脱植醇叶绿素和 植醇。1913 年， Willstatter 和 Stoll 首次报道了植物中存在叶绿素酶， 其后， 叶绿素酶的 生理功能及其应用研究得到了迅速的发展， 概括为 ： (1) 叶绿素酶的生理功能 ； (2) 细胞内 分布 ； (3) 酶的生化动力学特征 ； (4) 基因克隆与诱导表达 ； (5) 油脂加工的脱绿。 0003 上述研究与应用的基础在于得到纯的叶绿素酶蛋白。目前， 植物叶绿。

5、素酶的分离 纯化主要是利用硫酸铵分级沉淀、 疏水层析、 离子交换、 分子筛过滤等方法， 过程复杂， 酶收 率低。例如 Tsuchiya 等 (Tsuchiya T， et al.Purification and characterization of two isozymesof chlorophyllase from mature leaves of Chenopodium album.Plant CellPhysiology， 1997， 38(9) ： 1026-1031) 在分离藜叶绿素酶的过程中采用硫酸铵沉淀、 ToyopealHW-55 疏水层析、 Con A 层析、 Hepari。

6、n 层析、 Mono Q 离子交换色谱和 Superdex 200 分子筛过滤 6 步纯化， 得到纯的叶绿素酶， 但过多的纯化步骤， 造成严重的酶活损失， 仅 Toyopeal HW-55 一步， 酶收率就降低了 91.4， 最终收率只有 0.24-0.51。 0004 Shioi 等 (Shioi Y，et al.A simple purification method for the preparation ofsolublized chlorophyllase from Chlorella protothecoides， AnalvticalBiochemistry， 1980， 105。

7、(1) ： 74-79) 采用硫酸铵分级沉淀、 Sepharose CL-6B 和Sephadex G-200分子筛层析纯化小球藻的叶绿素酶， 提高了酶的收率， 简化了纯化程序， 但是对于复杂的植物细胞体系， 该方法所得酶的纯度达不到要求。 0005 因此， 改良植物叶绿素酶纯化的方法， 简化纯化步骤， 在保持酶活性的同时， 达到 纯度要求， 具有一定的价值。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种植物叶绿素酶的纯化方法， 简化纯化步骤， 在保持酶 活性的同时达到叶绿素酶纯度的要求。 0007 实现上述目的的技术方案如下 ： 0008 (1) 有机溶液沉淀 0009 植物蛋白粗提液， 在。

8、 4下边搅拌边缓慢加入有机溶剂， 有机溶剂可选用乙醇、 甲 醇或丙酮中的任一种， 控制有机溶剂的体积比浓度为 20-40 ； 随后 10000-12000rpm 离心 沉淀， 弃去上清液， 向每 1g 沉淀中加入含有质量体积比浓度为 0.24的 TritonX-100 磷酸 缓冲液 (20mmol/L， pH7.0)10-15mL， 于 4下缓慢搅拌 1h， 随后 10000-12000rpm 离心， 弃去 沉淀， 上清液即为酶液 I。 说 明 书 CN 102115736 A CN 102115738 A2/3 页 4 0010 (2) 离子交换层析 0011 将步骤(1)得到的酶液I上样于。

9、DEAE-Sephacel或DEAE-Sepharose CL-6B离子交 换层析柱， 然后用含有0-29.3g/L NaCl的磷酸缓冲液(20mmol/L， pH7.0)洗脱， 收集具有叶 绿素酶活性的组分， 加入超滤浓缩离心管中， 3000rpm， 4离心， 得到的浓缩液即为酶液 II。 0012 (3) 非变性凝胶电泳 0013 将步骤 (2) 中得到的酶液 II 与上样缓冲液 (20mmol/L、 pH6.8 的 Tris-HCl ； 质量 体积比为 10的甘氨酸 ； 质量体积比为 0.1的十二烷基磺酸钠 ) 混合加样于丙烯酰胺质 量浓度为 5-6的浓缩胶及丙烯酰胺质量浓度为 12-1。

10、4的分离胶上， 电泳。电泳后将分离 胶每0.5cm横向割成条带， 分别放入磷酸缓冲液(20mmol/L， pH7.0)中， 37过夜浸出蛋白， 收集有叶绿素酶活性的组分即为纯化的叶绿素酶液 III。 0014 上述酶的纯度可采用质量浓度为 14的丙烯酰胺， 质量体积比为 1的十二烷基 磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测， 电泳缓冲液为 25mmol/L Tris- 甘氨酸 (pH 8.3)， 以考 马斯亮蓝 R-250 染色， 甲醇 / 冰醋酸 / 蒸馏水 (1 1 8) 脱色。 0015 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果 ： 0016 本发明依次采用有机溶剂沉淀、 离子交换层析、 非。

11、变性凝胶电泳方法纯化植物叶 绿素酶， 与现有的植物叶绿素酶纯化方法相比， 纯化步骤少。 将本发明纯化的酶液按所述检 测方法检测， 结果为单一条带， 表明产物纯度高。 具体实施方式 0017 实施例 1 0018 利用本发明的方法纯化银杏叶绿素酶， 具体为 ： 0019 (1) 有机溶剂沉淀 0020 将银杏叶蛋白粗提液在 4下， 边搅拌边缓慢加入丙酮， 丙酮的体积百分比浓度 为 40， 10000rpm 离心后倾去上清液， 收集沉淀部分， 向每 1g 沉淀加入含有质量体积比 为 0.24的 TritonX-100 磷酸缓冲液 (20mmol/L， pH7.0)10mL， 于 4下缓慢搅拌 1h。

12、， 随 后 10000rpm 离心， 收集上清液， 弃去沉淀， 上清液为银杏叶绿素酶液 I ； 此步酶的回收率为 20.5。 0021 (2) 离子交换层析 0022 将步骤 (1) 的酶液 I 上样于 DEAE-Sephacel， 用含 14.6g/L NaCl 的磷酸缓冲液 (20mmol/L， pH7.0) 洗脱， 收集含有叶绿素酶活性的组分， 加入超滤浓缩离心管中， 3000rpm， 4离心， 得到浓缩液， 浓缩液即为银杏叶绿素酶液 II ； 此步酶的回收率为 10.8。 0023 (3) 非变性凝胶电泳 0024 将步骤 (2) 中的酶液 I I 与上样缓冲液 (20mmol/L、 。

13、pH6.8 的 Tris-HCl ； 质量体积 比为 10的甘氨酸 ； 质量体积比为 0.1的十二烷基磺酸钠 ) 混合加样于丙烯酰胺质量浓 度为5的浓缩胶和丙烯酰胺质量浓度为14的分离胶上， 电泳。 电泳后将分离胶每0.5cm 横向割成条带， 分别放入磷酸缓冲液 (20mmol/L， pH7.0) 中 37过夜浸出蛋白， 收集合有叶 绿素酶活性的组分即为纯化的银杏叶绿素酶液 III， 此步得到的叶绿素酶液 III 经质量浓 度为 14的丙烯酰胺， 质量体积比为 1的十二烷基磺酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为 单一蛋白条带。 说 明 书 CN 102115736 A CN 102115738 A3/3 页 5 0025 实施例 2 0026 与实施例 1 基本相同， 其不同之处在于 0027 使用的植物材料为菜椒 ； 0028 步骤 (1) 中使用的有机溶剂为乙醇， 体积百分比浓度为 30 ； 0029 步骤 (2) 中的离子交换介质为 DEAE-Sepharose CL-6B。 0030 实施例 3 0031 与实施例 1 基本相同， 其不同之处在于 0032 使用的植物材料为豌豆叶 ； 0033 步骤 (3) 中浓缩胶的丙烯酰胺质量浓度为 6， 分离胶的丙烯酰胺质量浓度为 12.5。 说 明 书 CN 102115736 A 。