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1、(10)授权公告号 CN 101830868 B (45)授权公告日 2011.11.16 CN 101830868 B *CN101830868B* (21)申请号 200910218306.3 (22)申请日 2009.12.09 CGMCC No.3400 2009.11.05 C07D 303/14(2006.01) A01N 43/20(2006.01) A01P 5/00(2006.01) C12P 17/02(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 云南大学 地址 650091 云南省昆明市翠湖北路 2 号 (72)发明人 牛雪梅 张克勤 魏录。
2、霞 褚衍生 (74)专利代理机构 昆明今威专利代理有限公司 53115 代理人 杨宏珍 CN 1651382 A,2005.08.10,说明书第1页第 2 段至第 2 页第 3 段 . US 5565489 A,1996.10.15,说明书第4栏第 2 段至第 5 栏第 1 段 . Stadler,M. et al.New Biologically Active Compounds from the Nematode-Trapping Fungus Arthrobotrys oligospora Fresen. Z.Naturforsch. .1993, 第 48c 卷 843-850. Me。
3、hta,G. et al.First total synthesis of yanuthones: novel farnesylated epoxycyclohexenoid marine natural products.Tetrahedron Letters .2005, 第 46 卷 5219-5223. Anderson,M.G. et al.Structures and Absolute Configurations of Antibiotics of the Oligosporon Group from the Nematode-trapping Fungus Arthrobotr。
4、ys oligospora.The Journal of Antibiotics .1995,第48卷(第5期),391-398. (54) 发明名称 法尼基环六烷醇类衍生物及其应用 (57) 摘要 本发明涉及法尼基环六烷醇类衍生物及其 应用， 属微生物农药技术领域。本发明的生产菌 株 Talaromyces sp.YM1-3 已 于 2009 年 11 月 05 日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏号为 CGMCC NO.3400。本发明由 YM1-3 经 常规发酵、 提取分离获得两个新的结构相似的 法尼基环六烷醇类代谢产物， 命名为法尼基环 六烷醇 D(oligosporol D。
5、) 和法尼基环六烷醇 E(oligosporol E)。本发明的法尼基环六烷醇类 代谢产物在液体浸泡法的抗线虫活性测试中显示 出杀线虫活性， 均能有效毒杀线虫。 本发明的法尼 基环六烷醇类衍生物具有对环境无污染、 成本低、 毒杀线虫效果佳的优点， 能作为制备杀线虫药剂 的应用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 赵奇奇 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 CN 101830868 B1/1 页 2 1. 法尼基环六烷醇类衍生物， 由生产菌株经常规发酵、 提取分离获得 ； 其特征在于 ： a.生产菌株T。
6、alaromyces sp.YM1-3已于2009年11月05日保存于中国普通微生物菌 种保藏管理中心， 保藏号为 CGMCC NO.3400 ； b. 法尼基环六烷醇类衍生物由 2 种化合物组成， 其结构式为 ： 2. 权利要求 1 所述的法尼基环六烷醇类衍生物的应用， 其特征在于该法尼基环六烷醇 类衍生物作为制备杀线虫药物的应用。 权 利 要 求 书 CN 101830868 B1/5 页 3 法尼基环六烷醇类衍生物及其应用 技术领域 ： 0001 本发明涉及法尼基环六烷醇类衍生物及其应用， 属微生物农药技术领域。 背景技术 ： 0002 利用微生物本身及其代谢产物来防治农业害虫近年来在病。
7、虫害防治中的地位已 越来越重要。由于微生物杀虫剂， 对人畜安全， 毒性小， 环境污染小， 低残留， 对有害靶标特 异性强， 不易杀伤天敌和有益生物， 有利于生态平衡。生产原料和有效成分属天然产物， 能 保证自然生产的可持续发展， 因此， 近年来， 微生物杀虫剂的品种在不断增加， 应用范围在 不断扩大， 微生物杀虫剂的研究开发和应用已进人了一个新的历史时期。 0003 由于微生物代谢物可以方便地解决菌株活体应用时的种种缺点， 为害虫防治提供 更为广泛的选择， 随着生物技术的发展， 微生物代谢产物在害虫防治上的应用研究引起人 们越来越多的重视。 发明内容 ： 0004 本发明的目的旨在提供一种具有。
8、杀线虫活性的法尼基环六烷醇类衍生物及其应 用。 0005 本发明从具有毒杀线虫功能的真菌中筛选出高毒力 Talaromyces sp.YM1-3， 从 YM1-3 菌株的次生代谢产物中提取高毒力杀线虫化合物， 为研究开发生物杀线虫制剂和研 究开发仿生生物农药奠定基础。 0006 本发明是这样实现的 ： 0007 本发明人在前期研究中， 筛选获得了具有良好杀线虫功能的真菌 Talaromyces sp.YM1-3， YM1-3 菌株已于 2009 年 11 月 05 日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心， 保藏号为 CGMCC NO.3400。 0008 本发明将 YM1-3 菌株采用 YEP。
9、 培养基， 用常规发酵方法培养， 将发酵液低压浓缩 后， 用乙酸乙酯萃取， 然后将有机部分合并浓缩后， 再通过硅胶 ( 氯仿 / 甲醇 洗脱 ) 和 Sephedex-LH20凝胶柱(甲醇洗脱)反复层析， 即得到本发明的无色的法尼基环六烷醇类化 合物， 该类化合物是经核磁共振波谱， 质谱， 红外光谱紫外和旋光光谱确定为两个新的结构 相似的法尼基环六烷醇类代谢产物， 命名为法尼基环六烷醇D(oligosporol D)和法尼基环 六烷醇 E(oligosporol E)。该类代谢产物的结构如下 ( 以下分别简称为化合物 1 和 2， 上 部分为化合物 1 的结构式， 下部分为化合物 2 的结构式。
10、 ) ： 0009 说 明 书 CN 101830868 B2/5 页 4 0010 本发明所述的从少孢节从孢中分离得到的法尼基环六烷醇类次生代谢产物的物 理外观分别为无色油状， 与硫酸显色呈棕色 ； 黄色油状， 与硫酸显色呈黄绿色变灰色 ； 无色 油状， 与硫酸显色呈黄色变灰色。分子式都为 C22H34O6。核磁谱特征见表 1， 其溶解溶剂为 CD3COCD3， 400MHz， ： ppm. 0011 法尼基环六烷醇 D(oligosporol D)(1) ： Colorless oil ； -12.29 (c 0.1， MeOH) ； UV(MeOH)max(log)203(4.14) ；。
11、 IR(KBr)vmax 3424， 2966， 2922， 2856， 1657， 1638， 1631， 1460， 1451， 1442， 1433， 1383， 1271， 1172， 1109， 1087， 1019， 948， 740， 670， 580， 552cm-1 ； 1H NMR and 13C NMR seeTable 1 ； Negative ESI-MS m/z 429M+Cl- ； Negative HRESI-MS m/z 429.2044M+Cl-(calculated for C22H34O6Cl， 429.2043). 0012 法尼基环六烷醇 E(oli。
12、gosporol E)(2) ： Colorless oil ； +19.36 (c 0.3， MeOH) ； UV(MeOH)max(log)205.2(3.90) ； IR(KBr)vmax 3423， 2967， 2924， 2856， 1657， 1639， 1630， 1441， 1384， 1261， 1167， 1104， 1076， 1021， 950， 896cm-1 ； 1H NMR and 13C NMR see Table 1 ； Negative ESI-MS m/z429M+Cl-； Negative HRESI-MS m/z 429.2041M+Cl-， calc。
13、ulated 429.2047for C22H34O6Cl. 0013 表 1. 化合物 1 和 2 的 1H and 13C NMR 数据a 0014 说 明 书 CN 101830868 B3/5 页 5 0015 aData were measured in acetone-d 6 at 400MHz for 1H and 100MHz for 13C with reference to thesolvent signals， in ppm and J in Hz. 0016 实验表明 ： 本发明的活性化合物在液体浸泡法的抗线虫活性测试中， 在处理 时间为 48 小时时， 化合物对 Pa。
14、nagrellus redivevus 线虫的 LC50( 半致死率 ) 分别为 110.2gml-1和 80.6gml-1， 表现了杀线虫活性。 0017 因此， 该类化合物能作为制备杀线虫药剂的应用。 0018 本发明具有对环境无污染、 成本低、 毒杀线虫效果佳的优点。 具体实施方式 ： 0019 实施例 1 ： 0020 化合物 1 和 2 的分离制备 ： 0021 1. 真菌 YM1-3 的种子培养 ： 0022 YEP 培养基 ： Yeast extract( 酵母膏 )1g， Multi-peptone( 多蛋白胨 )2g， Beef extract( 牛肉膏 )1g， Gluco。
15、se( 葡萄糖 )10g， Agar( 琼脂 )20g， Distilled water( 蒸馏 水 )1L， 自然 PH， 灭菌后倒成平板。将 YM1-3 菌块接种到平板上， 38培养 5 7 天。 0023 2. 真菌 YM1-3 的液体发酵培养 ： 0024 YEP 培养基 ： YEP 培养基 ： Yeast extract( 酵母膏 )1g， Multi-peptone( 多蛋白 说 明 书 CN 101830868 B4/5 页 6 胨 )2g， Beef extract( 牛肉膏 )1g， Glucose( 葡萄糖 )10g， Distilled water( 蒸馏水 )1L， 自。
16、然 PH。将平板菌种接种到 500ml 三角瓶中 ( 每瓶装 250ml) 液体培养基， 在 38下摇床 培养， 转速 180rpm， 培养时间 12 天。 0025 3. 将发酵液过滤， 滤液即发酵原液减压浓缩后， 用乙酸乙酯萃取， 然后将乙酸乙酯 部萃取物合并后进行硅胶色谱分离， 以甲醇 / 氯仿 0-25为洗脱剂梯度洗脱。 0026 4.收集210的甲醇/氯仿洗脱液， 减压浓缩。 将浓缩液再进行反复硅胶色谱 分离 0027 5. 收集 TLC 板上硫酸显色为绿色的洗脱液浓缩， 经甲醇 Sephedex-LH 20， 丙酮 Sephedex-LH 20 反复分离后得到化合物 1 和 2。 。
17、0028 实施例 2 ： 0029 用液体浸入法检测本发明化合物的单体抗线虫活性的实验 ： 0030 1. 试验用药剂 0031 将化合物 1 和 2 溶于 10l 丙酮， 再加入 10浓度的吐温 -20 溶液， 分别制备 400gml-1、 200gml-1、 100gml-1、 50gml-1和 25gml-1浓度的供试液， 在该 溶液中， 丙酮的终浓度不超过 3， 吐温 -20 的终浓度不超过 0.5。另 将相同浓度的丙酮 溶解于含有 0.5 (v/v) 的吐温 -20 水溶液作为对照。 0032 2. 线虫的培养与制备 0033 将 P.redivevus 线虫接种于燕麦培养基上 ( 。
18、燕麦 20g， 水 80ml)， 于 28培养 5 7 天。用贝尔曼漏斗法洗出所需线虫， 经 1次氯酸钠消毒 2 分钟后， 用无菌蒸馏水将线虫 稀释为 6000/ml 作为线虫悬液。 0034 3. 试验方法 0035 将供试液 3ml 放于 6cm 平板中， 加入活线虫 18000 条， 置于 28恒温培养箱， 分别 于 6， 12， 18， 24， 36 小时和 48 小时在光学显微镜下检查计算线虫死亡率。并在双目显微镜 下观察线虫体壁消解的情况。 0036 鉴定死亡的方法 ： 死亡线虫僵直或呈 “J” 型， 活线虫则卷曲扭动。用针尖拨动静止 线虫身体各部， 线虫仍未做出任何反应则鉴定为死。
19、亡。 0037 死亡率 ( 死亡线虫数 /( 死亡线虫数 + 活线虫数 )100 0038 校正死亡率供试样品死亡率 - 对照组死亡率 0039 以未加样品的测试溶液为对照， 整个实验重复三次， 取三次平均值， 计算出平均死 亡率和校正死亡率。 0040 4. 实验结果 0041 表 1 供试化合物对 P.redivevus 线虫的毒杀性结果 0042 说 明 书 CN 101830868 B5/5 页 7 0043 结果表明 ： 本发明的化合物 1 和 2 对松材线虫都有较好的毒杀作用， 能用于制备 农药杀线剂用。化合物 1 和 2 对 P.redivevus 线虫的 LC50( 半致死率 ) 在 48 小时分别为 100gml-1和 80.6gml-1， 对腐生线虫具有良好毒杀活性。 说 明 书 。