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1、(10)申请公布号 CN 102154461 A (43)申请公布日 2011.08.17 CN 102154461 A *CN102154461A* (21)申请号 201110003232.9 (22)申请日 2011.01.10 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号 (72)发明人 刘泽文 姚香梅 丁志平 刘淑华 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性分子检测 方法 (57) 摘要 本发明褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性分。
2、 子检测方法属于抗药性综合治理和褐飞虱综合防 治范畴。一种褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性 分子检测方法， 其特征在于如下步骤实现 ： 提取 单头褐飞虱 2-3 龄若虫基因组 DNA ； PCR 反应体 系 ;PCR 反应程序 ; 扩增产物的电泳检测 ： 该方法 稳定性高、 周期短、 灵敏度高， 适合褐飞虱对苯基 吡唑类杀虫剂抗性的早期检测。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 1 页 CN 102154462 A1/1 页 2 1. 一种褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性分子检测方法， 其特征。
3、在于如下步骤实现 ： a、 提取单头褐飞虱 2-3 龄若虫基因组 DNA ； b、 PCR 反应体系 2.5 L 10Buffer， 1.25 U Ex-Taq DNA polymerase， 2.5 L 单头褐飞虱基因组 DNA， 终浓度 0.2 mmol/L 的 dNTPs、 1 mmol/L 的 MgCl2， 1 mol/L 的内引物、 外引物， 加 双蒸水至反应总体积为 25 L ； 其中所述的外引物 P ： GGCTGATCGTCATCATATCGTGG ； Q ： GCAACGACGCGAACACCATGACG ； 内引物 A ： TGCGACACCGGCACGAGTGT ； B 。
4、： CGGTGGTGACGCCGAGTGC ； c、 PCR 反应程序 94 3 min ； 20 循环 ： 94 30 s， 67 58 30 s， 每 2 个循环降 1， 72 1 min ； 10 循环 ： 94 30 s， 58 30 s， 72 1 min ； 72 5 min ； d、 扩增产物的电泳检测 ： 取10 L PCR扩增产物， 在1%g/mL的琼脂糖凝胶上进行电泳， 紫外光下检测 ： 存在长度 分别约为 200 bp 和 150 bp 大小的两条带， 说明个体为抗性纯合子 ； 存在长度分别约为 200 bp 和80 bp 大小的两条带， 说明个体为敏感纯合子 ； 同时存。
5、在长度分别约为200 bp 、 150 bp 和 80 bp 大小的三条带， 说明个体为杂合子。 权 利 要 求 书 CN 102154461 A CN 102154462 A1/6 页 3 褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性分子检测方法 0001 （一） 、 方法领域 本发明基于伽马氨基丁酸受体突变的褐飞虱抗药性分子检测方法， 属于生物方法领 域， 专用于褐飞虱对作用于昆虫 - 氨基丁酸受体 （-GABA receptor） 杀虫剂 （包括狄氏 剂、 氟虫腈和丁烯氟虫腈） 抗性靶标变异的高灵敏快速检测。 0002 （二） 、 背景方法 我国是世界上农林生物灾害发生最严重的国家之一， 生物灾害发生。
6、频繁， 为害严重， 损 失巨大。目前全国范围内农作物有害生物发生种类高达 1700 多种， 可造成严重危害的有 100 多种， 2009 年我国农作物有害生物发生面积达 70 亿亩次。有害生物抗药性快速增长， 目前至少有 30 种农作物害虫对 40 种杀虫剂、 20 多种病原菌对各类现代选择性杀菌剂产生 了不同程度的抗药性。病虫抗药性的暴发往往导致防治失败， 如果补救防治不及时或不到 位， 将造成严重的经济损失， 抗药性的产生同时导致更多的化学农药投入田间， 对环境造成 严重污染， 对有益生物造成毁灭性的杀伤。我国每年因使用农药引起的中毒人数超过 9 万 人 ； 发生作物药害的面积约300万亩。
7、。 由于化学农药过度和不当使用， 不仅造成严重的生态 环境污染 （高达80%的农药漂移或流失到非靶标生物、 土壤和水域中） ， 而且成为农产品质量 安全的隐患。农药残留和重金属污染超标是当前农产品质量安全的突出问题， 已经成为国 际市场对我国农产品设置绿色贸易壁垒的主要依据。 0003 水稻是我国第一大粮食作物， 常年播种面积 4.77 亿亩左右， 占粮食播种面积的 30， 总产量约 2 亿吨， 产量占粮食总产的 40左右。水稻主要害虫， 褐飞虱、 二化螟等， 成 为威胁水稻产量的主要因素之一 ； 抗药性的上升及由此导致的大量化学农药的使用， 同时 威胁着水稻品质和农业生产安全。随着 2005。
8、-2006 年褐飞虱对吡虫啉高抗性的产生， 氟虫 腈随着大量应用 ； 2009 年 10 月 1 日氟虫腈被禁止在稻田使用， 丁烯氟虫腈作为替代品种 被广泛使用。室内筛选和田间监测都发现， 褐飞虱对氟虫腈和丁烯氟虫腈都产生了一定水 平的抗性， 尤其是室内筛选品系抗性达到 200 倍以上。 0004 目前关于褐飞虱抗药性的监测大都局限于生物测定， 除了本实验室 2006 年报道 了褐飞虱对吡虫啉的分子检测方法外， 还未见其他快速检测方法报道。生物测定本身的局 限性是的这种常规的检测方法不能检测早期抗性和低频率抗性等位基因。 目前用于监测褐 飞虱抗药性的生物测定方法主要有点滴法、 浸苗法、 浸茎法。
9、等。 生物测定方法普片存在的缺 点有 ：（1） 灵敏度低 ： 生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性等位基因， 尤其是抗性等位 基因是隐性或不完全隐性时 ；（2） 周期长 ： 生物测定结果一般需要24 h以上， 对特殊作用方 式杀虫剂需要更长的时间， 如内吸性杀虫剂、 生长调节剂、 取食阻断剂等 ；（3） 对试虫数量 要求大 ： 测定一个标准曲线至少需要500头标准化试虫， 对昆虫饲养的要求高。 在褐飞虱对 杀虫剂抗性日益上升之际， 一种快速抗性检测方法变得十分重要， 而普通的生物测定方法 根本不能满足这些要求。 0005 说 明 书 CN 102154461 A CN 102154462 A2。
10、/6 页 4 （三） 、 发明内容 发明目的 本发明的目的是针对现有方法中褐飞虱抗药性检测方法灵敏度低、 周期长、 材料要求 高、 人力要求高等问题， 提供褐飞虱对作用于 - 氨基丁酸受体杀虫剂狄氏剂、 氟虫腈和丁 烯氟虫腈抗性的分子检测方法， 到达准确性高、 周期短、 灵敏度高的目的。 0006 技术方案 褐飞虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性分子检测方法 a、 单头褐飞虱 2-3 龄若虫基因组 DNA 的提取 （1） 配制提取液 A ： 1% （g/mL） SDS, 50 mmol/L Tris HCl, 25 mmol/L NaCl, 25 mmol/ L EDTA， 溶剂为超纯水 ； 提取液 。
11、B ： 3 mol/L KAC, PH 7.2， 溶剂为超纯水。 0007 （2） 将试虫置于 1.0 mL 离心管中， 液氮冰冻后用灭菌牙签捣碎， 然后加入 60 L 提取液 A， 并用另外 60 L A 液清洗牙签 ； （3） 65 水浴 45 min， 每隔 15 min 混匀一次 ； （4） 加入 120 L 提取液 B， 混匀后冰浴 1 2 h ； （5） 10000g 离心 15 min， 将上清液转移到另一个灭菌离心管中 ； （6） 加入 480L 预冷的无水乙醇， 混匀， 20放置 1 2h ； （7） 10000g 离心 15 min， 倾尽上清液， 收集沉淀， 用 70（m。
12、L/mL） 乙醇清洗 1 次 ； （8） 重复步骤 (7)， 37 晾干或冷冻干燥沉淀， 获得单头褐飞虱基因组 DNA， 加入 50 L 双蒸水溶解沉淀， -20 保存备用 ； b、 PCR 反应体系 25 L 2.5 L 10Buffer， 1.25 U Ex-Taq DNA polymerase， 2.5 L 单头褐飞虱基因 组 DNA， 终浓度 0.2 mmol/L 的 dNTPs、 1 mmol/L 的 MgCl2， 1 mol/L 的内外引物， 加 双蒸水至反应总体积为 25 L ； 其中所述的外引物 P ： GGCTGATCGTCATCATATCGTGG ； Q ： GCAACGA。
13、CGCGAACACCATGACG ； 内引物 A ： TGCGACACCGGCACGAGTGT ； B ： CGGTGGTGACGCCGAGTGC ； c、 PCR 反应程序 94 3 min ； 20 循环 ： 94 30 s， 67 58 30 s， 每 2 个循环降 1， 72 1 min ； 10 循环 ： 94 30 s， 58 30 s， 72 1 min ； 72 5 min。 0008 、 扩增产物的电泳检测 ： 取 10 L PCR 扩增产物， 在 1%（g/mL） 的琼脂糖凝胶上进行电泳， 稳流 80 mA， 1.5 h 后 在紫外光下检测 ： 如果存在长度分别约为200 。
14、bp (PQ) 和 150 bp (AQ) 大小的两条带， 说 明个体为抗性纯合子 ； 如果存在长度分别约为200 bp (PQ) 和80 bp (PB) 大小的两条带， 说明个体为敏感纯合子 ； 如果同时存在长度分别约为200 bp (PQ)、 150 bp (PB) 和 80 bp (AQ) 大小的三条带， 说明个体为杂合子。 0009 有益效果 本发明与现有的生物测定方法相比， 其优点和积极效果表现为 ： 1、 本发明经过多年的筛选与纯化， 获得了褐飞虱对氟虫腈 / 丁烯氟虫腈 / 狄氏剂的 抗性和敏感品系， 并发现了杀虫剂作用靶标伽马氨基丁酸受体上抗性相关突变 （Rdl 突变， A30。
15、2S） 。A302S 突变在很多种昆虫均有发现， 如德国蜚蠊、 果蝇、 家蝇等， 并发现该突变时昆 说 明 书 CN 102154461 A CN 102154462 A3/6 页 5 虫对环戊二烯类杀虫剂产生抗性的主要机理， 并且该突变对氟虫腈也表现出一定的交互抗 性， 在不同种类昆虫中抗性程度不一致 （Ffrench-Constant et al., 1993 ; Cole et al., 1995 ; Scott and Wen, 1997 ; Wen and Scott, 1999 ; Kristensen et al., 2005） 。 由 于果蝇是模式昆虫物种， 因此该突变均以果蝇。
16、的 GABA 受体 RDL 蛋白位置来确定， 即该突变 导致了果蝇 302 位氨基酸的替换， 故命名为 A302S （Ffrench-Constant et al., 1993） 。该 突变发生在昆虫伽马氨基丁酸 （GABA） 门控的氯离子通道上， 由于在果蝇中发现的 A302S 突 变导致了昆虫对狄氏剂的抗性， 因此将该通道基因命名为 RDL（resistance to dieldrin） （Ffrench-Constant et al., 1993） 。杀虫剂靶标突变是昆虫抗药性产生高抗性的主要机 理之一， 如害虫对有机磷类杀虫剂抗性相关的乙酰胆碱酯酶突变、 害虫对新烟碱类杀虫剂 抗性相关。
17、的烟碱型乙酰胆碱受体突变和昆虫对环戊二烯类杀虫剂抗性相关的 RDL 突变， 这 些突变大多为单碱基点突变， 因此可以利用检测单碱基变异的技术来检测该点突变是否存 在， 如本实验室已经建立的褐飞虱对吡虫啉突变 Y151S 的 Bi-PASA 方法， 该方法灵敏度高、 准确性高、 周期短、 需求材料少 （Liu et al., 2005; 专利， ZL200310118523.8） 。在本实验 室筛选的高抗氟虫腈和丁烯氟虫腈的褐飞虱品系中， 发现了与果蝇同源的 A302S 变异， 核 苷酸序列如下 （加粗字体标注单核苷酸变异） 。 0010 标注变异的核苷酸序列 ： GGGCTGATCGTCATC。
18、ATATCGTGGGTCTCGTTCTGGCTGAACCGGAATGCGACACCGGCACGAGTGG/TCACT CGGCGTCACCACCGTGTTGACCATGACCACGCTCATGTCATCCACCAACGCCGCTCTGCCCAAGATCAGCTACGTCA AGTCGATTGACGTCTACCTGGGAACCTGTTTCGTCATGGTGTTCGCGTCGTTGCTC（见 Seq NO.1） 2、 灵敏度搞 ： 低频率抗性纯合子或杂合子的存在和一定的筛选压力， 是高水平抗性 产生的关键因子。而生物测定监测方法是一种粗放的检测方法， 不能检测早期抗性或低 频率抗性纯合子或杂合子，。
19、 所以， 生物测定方法很难进行抗药性产生的风险预测。本发明 根据褐飞虱对几种 （类） 杀虫剂抗性的靶标变异， 设计适合于双向 PCR 扩增特异等位基因 （Bi-PASA） 的特异引物， 经过 PCR 扩增和凝胶检测， 可以直接判断个体的基因型。通过一定 数量个体的检测， 可以初步确定某个种群中抗性纯合子、 杂合子和敏感纯合子的频率， 为抗 药性预测、 抗药性治理和害虫综合治理提供直接的证据。 0011 3、 准确性高 ： 生物测定方法要求试虫标准化， 虫体之间的差异对结果影响很大， 造 成结果的不稳定性。操作者的操作误差也加大了这种不稳定性。而本发明基于 PCR 扩增的 检测方法， 由于 PC。
20、R 方法的日益成熟和智能化发展迅速， 在一定程度上减少了这种不稳定 性， 使得检测结果可以作为褐飞虱防治策略制定的理想材料。 0012 4、 周期短 ： 生物测定方法至少需要 24 h 的观测时间， 而本发明中的 PCR 扩增和电 泳检测只需要不到 5 h 的时间， 就可以得出理想的结果。 0013 5、 材料要求少 ： 生物测定方法中测定一条标准曲线至少需要 500 头标准试虫， 这 些试虫的饲养需要花费一定的人力、 物力。而本发明对一个种群的检测只需要 100 头作用 的使用， 而且试虫对虫龄、 长短翅的要求不高。如果抗性基因频率别地， 如 1% 作用， 也只需 要 300 头左右的试虫，。
21、 这是生物测定方法无论用多少头试虫也不能检测的。 0014 6、 双向PCR扩增特异等位基因 （Bi-PASA） 是建立在PCR ( 聚合酶链反应) 基础之 上的遗传标记技术， 是一种快速、 方便和费用低的 SNP 检测方法， 具有两对特异引物 ： 一对 具等位基因特异性的内引物 （A 和B） ， 一对外引物 （P和Q） 。 A和B各自与一等位基因互补， 说 明 书 CN 102154461 A CN 102154462 A4/6 页 6 P 和 Q 在距突变碱基距离不等处与模板配对， 以便在电泳凝胶上区分突变位点上游和下游 的 PASA 片段。Bi-PASA 方法可用于证实不同虫种或种群中存。
22、在的抗性等位基因， 或用来测 定等位基因频率， 该技术操作简单， 具备常规 PCR 技术人员即可完成 ； 检测周期短， 成本低， 只需要进行一轮 PCR 和一个普通的琼脂糖电泳， 即能判断检测昆虫的抗性变异情况。双向 PCR 扩增特异等位基因是一种快速、 有效的基因单碱基突变检测方法， 可以识别个体基因型 的差异， 进行低频率点突变抗性等位基因的检测， 准确性高、 周期短、 灵敏度搞， 满足了早期 抗性和低频率抗性等位基因检测的要求。 0015 （四） 、 说明书附图 图 1 不同品系个体双向 PCR 扩增特异等位基因结果 ； 1-5 泳道为抗性纯合子 （试虫来自于抗性品系 BPH-FR） ，。
23、 6-10 泳道为敏感纯合子 （试虫 来自于抗性品系BPH-FSR） ， 11-15泳道为杂合子 （试虫来自于抗感品系杂交F2子代BPH-FR/ S-f2） ； M 泳道为分子量 marker， 从上到下分别为 200 bp、 150 bp 和 100 bp 的 3 条带。 0016 图 2 不同筛选世代和杂交 F2 代个体双向 PCR 扩增特异等位基因结果 ； 1-5 泳道的试虫来自于 BPH-SX-13 世代， 6-10 泳道的试虫来自于 BPH-SX-25 世代， 11-16泳道的试虫来自于抗感品系杂交F2子代BPH-FR/S-f2 ； M泳道为分子量marker， 从上 到下分别为 2。
24、00 bp、 150 bp 和 100 bp 的 3 条带。 0017 五、 具体实施方案 双向 PCR 扩增特异等位基因 （Bi-PASA） 的特异引物有 ： 外引物 P ： GGCTGATCGTCATCATATCGTGG（见 Seq NO.2） Q ： GCAACGACGCGAACACCATGACG（见 Seq NO.3） 内引物 A ： TGCGACACCGGCACGAGTGT（见 Seq NO.4） B ： CGGTGGTGACGCCGAGTGC（见 Seq NO.5） 单头褐飞虱 2-3 龄若虫基因组 DNA 的提取 （1） 取单头 2-3 龄褐飞虱 100 只， 在双蒸水中漂洗 3。
25、 次， 用吸水纸吸干 ；（2） 将单头试虫 置于1.0 mL离心管中， 液氮冰冻后用与离心管配套的塑料匀浆棒碾碎， 然后加入60 L提 取液 A （1% SDS, 50 mmol/L Tris HCl, 25 mmol/L NaCl, 25 mmol/L EDTA） ， 并用另外的 60 L 提取液 A 清洗塑料匀浆棒 ；（3） 65 水浴 45 min， 每隔 15 min 混匀一次 ；（4） 加入 120 L 提取液 B（3 mol/L KAC, PH 7.2） ， 混匀后冰浴 1 h 以上 ；（5） 10 000g 离心 15 min， 将上清液转移到另一个灭菌离心管中 ；（6） 10 。
26、000g 离心 10 min， 加入 480 L 预冷 的无水乙醇， 混匀， 20放置 1-2h ；（7） 10 000g 离心 15 min， 倾尽上清液， 收集沉淀， 用 70（mL/mL） 乙醇清洗 1 次 ；（8） 重复步骤 (7)， 37 晾干或冷冻干燥沉淀， 获得单头褐 飞虱基因组 DNA， 加入 50 L 双蒸水溶解沉淀， -20 保存备用 ； 反应体系 （25 L） 2.5 L 10Buffer， 1.25 U Ex-Taq DNA polymerase， 2.5 L 单头褐飞虱基因组 DNA， 终浓度0.2 mmol/L的dNTPs、 1 mmol/L的 MgCl2， 1 m。
27、ol/L的内外引物， 加双蒸水至 反应总体积为 25 L。 0018 PCR 反应程序 说 明 书 CN 102154461 A CN 102154462 A5/6 页 7 94 3 min ； 20 循环 ： 94 30 s， 67-58 30 s， 每 2 个循环降 1， 72 1 min ； 10 循环 ： 94 30 s， 58 30 s， 72 1 min ； 72 5 min。 0019 PCR 产物分析 将 10 L PCR 扩增产物上样于 1%（g/mL） 的琼脂糖凝胶 （40 mL 凝胶中加溴化乙锭 EB 2 L） ， 缓冲液为 1TAE， 80 mA 稳流电泳 1.5 h。。
28、凝胶在紫外光下观察或凝胶成像。5 小 时内即可获得不同品系个体双向 PCR 扩增特异等位基因结果如图 1 ： 1-5 泳道均具有约为 200 bp(PQ) 和 150 bp (AQ) 大小的两条带， 个体为抗性纯合子， 该泳道试虫是从抗性纯合 品系 BPH-FR 中选取的个体， 已经通过 DNA 测序验证存在纯合的突变 （突变位点附近的核 苷酸序列为 ： ACACCG GCACGAGTGTCACTCGGCGTCACCAC 见 Seq NO.6） ； 6-10 泳道均具有约为 200 bp(PQ) 和 80 bp (PB) 大小的两条带， 个体为敏感纯合子， 该泳道试虫是从敏感纯合品 系 BPH。
29、-FS 中选取的个体， 已经通过 DNA 测序验证不存在突变 （突变位点附近的核苷酸序列 为 ： ACACCGGCACGAGTGGCACTCGGCGTCACCAC 见 Seq NO.7） ； 11-15 泳道均具有 200 bp(PQ)、 150 bp (AQ) 和80 bp (PB)大小的三条带， 个体为杂合子， 该泳道试虫是从BPH-FR()和 BPH-FS( ) 的 F2 代 （BPH-FR/S-f2） 中选取的个体， 该位点变异的杂合特性已经通过测序 验证， 突变位点序列存在杂合核苷酸， 序列为 （已经通过 DNA 测序验证存在纯合的突变 （突 变位点附近的核苷酸序列为 ： ACACC。
30、GGCACGAGTGG/TCACTCGGC GTCACCAC 见 Seq NO.8） ） 。 0020 为了验证本发明对 A302S 突变检测的灵敏度和准确性， 随即从抗性筛选过程中不 同世代 （BPH-SX-13, BPH-SX-25和抗感品系杂交F2子代BPH-FR/S-f2） 的个体， 利用本发明 的 Bi-PASA 方法， 检测个体的突变情况， 然后通过测序检测不同试虫在突变位点附近的核 苷酸序列， 以验证 Bi-PASA 方法的准确性， 结果见图 2 ： 1-5 泳道试虫来自 BPH-SX-13 世代， 出现了 4 个敏感纯合子 （具有 PQ 和 PB 条带） 和 1 个杂合子 （具。
31、有 PQ、 AQ 和 PB 条带） ； 6-10 泳道试虫来自于 BPH-SX-25 世代， 出现了 1 个抗性纯合子 （具有 PQ 和 AQ 条带） 和 4 个杂合 子 （具有 PQ、 AQ 和 PB 条带） ； 11-16 泳道试虫来自于 BPH-FR/S-f2 世代， 出现了 1 个抗性纯 合子 （具有 PQ 和 AQ 条带） 、 2 个敏感纯合子 （具有 PQ 和 PB 条带） 和 3 个杂合子 （具有 PQ、 AQ 和 PB 条带） 。为了验证条带检测的准确性， 所有条带均进行了 DNA 测序验证， 验证结果与通 过条带判断的突变情况抑制， 说明了该 Bi-PASA 方法的准确性。 。
32、0021 通过长期实验室筛选， 获得了高抗氟虫腈、 丁烯氟虫腈等苯基吡唑类杀虫剂高抗 的褐飞虱品系 （BPH-FR） ， 同时实验室长期 （从 1997 年开始室内饲养） 饲养了对绝大多数杀 虫剂敏感的敏感品系， 该品系对氟虫腈、 丁烯氟虫腈等苯基吡唑类杀虫剂敏感。图 1 中， 随 机选取敏感品系 （BPH-FS） 、 抗性品系 （BPH-FR） 和抗感品系杂交 F2 子代 BPH-FR/S-f2 试虫 各 5 头， 经过 Bi-PASA 方法检测后， 为了验证 Bi-PASA 方法检测的准确性， 对每个泳道条 带进行了 DNA 纯化和核苷酸测序， 发现 1-5 泳道 AQ 条带均具有造成 A。
33、302S 变异的点突变 G/T（该突变导致了 A302S 的氨基酸替换， 突变位点附近的核苷酸序列为 ACACCGGCACGAG TGTCACTCGGCGTCACCAC 见 Seq NO.9） ， 6-10 泳道 PB 条带均不具有造成 A302S 变异的点突变 G/T（突变位点附近的核苷酸序列为 ACACCGGCACGAGTGGCACT CGGCGTCACCAC 见 Seq NO.10） ； 在 11-15 泳道中， AQ 条带均具有造成 A302S 变异的点突变 G/T（该突变导致了 A302S 的 氨基酸替换， 突变位点附近的核苷酸序列为 ACACCGGCACGAG TGTCACTCGG。
34、CGTCACCAC 见 Seq NO.11） ， PB 条带均不具有造成 A302S 变异的点突变 G/T（突变位点附近的核苷酸序列为 说 明 书 CN 102154461 A CN 102154462 A6/6 页 8 ACACCGGCACGAGT GGCACT CGGCGTCACCAC见Seq NO.12） 。 图2中， 从不同筛选世代和杂交F2 中随机选取试虫进行测试， 发现 Bi-PASA 条带检测结果和测序结果完全一致， 验证了该方 法的准确性。 说 明 书 CN 102154461 A CN 102154462 A1/3 页 9 SEQUENCE LISTING 南京农业大学 褐飞。
35、虱对苯基吡唑类杀虫剂抗药性分子检测方法 12 PatentIn version 3.3 1 205 DNA 人工序列 1 gggctgatcg tcatcatatc gtgggtctcg ttctggctga accggaatgc gacaccggca 60 cgagtggtca ctcggcgtca ccaccgtgtt gaccatgacc acgctcatgt catccaccaa 120 cgccgctctg cccaagatca gctacgtcaa gtcgattgac gtctacctgg gaacctgttt 180 cgtcatggtg ttcgcgtcgt tgctc 20。
36、5 2 23 DNA 人工序列 2 ggctgatcgt catcatatcg tgg 23 3 23 DNA 人工序列 3 gcaacgacgc gaacaccatg acg 23 4 20 DNA 人工序列 4 tgcgacaccg gcacgagtgt 20 5 19 DNA 人工序列 5 序 列 表 CN 102154461 A CN 102154462 A2/3 页 10 cggtggtgac gccgagtgc 19 6 32 DNA 人工序列 6 acaccggcac gagtgtcact cggcgtcacc ac 32 7 32 DNA 人工序列 7 acaccggcac g。
37、agtggcact cggcgtcacc ac 32 8 33 DNA 人工序列 8 acaccggcac gagtggtcac tcggcgtcac cac 33 9 32 DNA 人工序列 9 acaccggcac gagtgtcact cggcgtcacc ac 32 10 32 DNA 人工序列 10 acaccggcac gagtggcact cggcgtcacc ac 32 11 32 DNA 人工序列 11 acaccggcac gagtgtcact cggcgtcacc ac 32 12 32 序 列 表 CN 102154461 A CN 102154462 A3/3 页 11 DNA 人工序列 12 acaccggcac gagtggcact cggcgtcacc ac 32 序 列 表 CN 102154461 A CN 102154462 A1/1 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102154461 A 。