(一)技术领域
本发明涉及一种制备单个卵裂球染色体的方法，属于染色体病植入前 遗传学诊断领域。
(二)背景技术
染色体病是一大类严重遗传病，严重者在胚胎早期夭折并引起自发性 流产，少数症状较轻者即使存活出生，也往往伴有先天性多发畸形以及生 长、智力、性发育异常或生育异常。染色体病对人类危害极大，但又无治 疗良策，目前主要通过遗传咨询和产前诊断予以预防。但遗传咨询仅以健 康宣教为主，缺乏针对性手段，而产前诊断均为创伤性的手段，且一旦确 诊，需采取非意愿性流产终止妊娠，给母亲带来身心痛苦，同时也涉及伦 理方面的争议。植入前遗传学诊断技术(Preimplantation genetic diagnosis， PGD)是在不影响植入母体的胚胎发育的情况下，吸取该胚胎的一个卵裂 球细胞进行遗传学诊断，再根据诊断结果剔除异常胚胎，选择无遗传性问 题的胚胎移植回母体子宫并出生正常子代的技术，理论上说可以从源头上 控制遗传性疾病的发生，因此已经成为一种新的出生缺陷干预方法而日益 受到关注。
目前染色体病的PGD主要依赖于间期核荧光原位杂交技术(FISH)， 但该技术仅能提供有限的染色体区域信息，不能检出所有的染色体异常类 型，因此在诊断的敏感性、准确性方面存在一定的缺陷，并制约着这一技 术成为出生缺陷源头控制的常规手段。获取胚胎细胞的中期分裂相，进行 胚胎细胞的全染色体组分析，可克服间期核FISH的局限性，理论上可以 检出所有的染色体异常类型。
但用常规细胞遗传学方法制备单个胚胎细胞染色体的效率低下，获得 的分裂相也因质量低下难以进行后续PGD分析。核移植表明，动物卵子 中存在着一种控制外来核行为的胞浆因子，当处于有丝分裂各时期的细胞 核移入去核的卵子后，外来核均发生一系列的形态变化(即核修饰)，包括 移入核的核膜崩解，染色质凝聚和早熟染色体凝集(Premature chromosome condensation，PCC)等过程。
(三)发明内容
本发明即是为了提供一种所得染色体效率高、质量好的单个卵裂球染 色体的制备方法。
为了达到发明目的本发明采用的技术方案是：
一种制备单个卵裂球染色体的方法，所述的方法如下：将正常的原核 期受精卵去除卵丘、进行去核操作，获取胞质体，另选取经活检的单个人 卵裂球，将所述卵裂球与胞质体进行电融合，得到异核体，所述电融合步 骤中所用电融合液组成终浓度为：山梨醇0.28M，硫酸镁0.1mM，牛血 清白蛋白(BSA)0.3％，余量为水；将所得异核体置于含秋水仙胺0.05～ 0.1μg/mL的人输卵管液中培养6～13小时，再用含0.1～0.2μg/mL细胞 松弛素D、1.5～2.0μM花萼海绵诱癌素的人输卵管液处理，诱导早熟染 色体凝集形成，再将诱导后的异核体置于含2％牛血清白蛋白的0.1％枸 椽酸钠溶液中低渗15～20分钟，然后对异核体进行固定和染色，即可得 到所述的单个卵裂球染色体。所述染色为吉姆萨染色或DAPI染色，本发 明中所用百分比浓度均为质量百分比浓度。所述胞质体即为人卵裂球染色 体的胞浆受体，通常使用小鼠原核期受精卵作为胞浆受体，也可以使用人 异常受精的原核期卵作为胞浆受体。
电融合液中通常选用甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖或麦芽糖作为调 节剂，起到稳定渗透压的作用，经进一步研究发现，用甘露醇配置的电融 合液易形成白色结晶且表面张力大，卵母细胞在其中易贴在底部难以吹 吸，在移卵过程中容易丢失，而用山梨醇配置的电融合液则无此现象。另 外，在0.1％的枸椽酸钠溶液中添加BSA可起到防止异核体细胞膜破裂的 作用，并能使去掉透明带的异核体不容易粘在容器底部，在操作中异核体 不丢失，这样更有利于提高获得染色体的效率和质量。
所述的异核体的固定步骤如下：先将异核体在固定液I中预固定3～ 5分钟，再将异核体转移至玻片并滴加1滴固定液II固定3～5分钟，最 后转移至固定液III中固定1分钟，所述固定液I为甲醇、乙酸、水体积比 5∶1∶4的混合液，所述固定液II为甲醇、乙酸体积比3∶1的混合液，所述 固定液III为甲醇、乙酸、水体积比3∶3∶1的混合液。通常所用异核体的固 定为两步固定，本发明中采用三步固定法，通过第三步固定，可使固定的 异核体背景更为清晰，并使染色体分散理想。这样，使得固定方法比较温 和，操作性强，制备的染色体背景清晰，既可避免因细胞质消化不完全而 引起的染色体分散不良现象，又能减少因过度分散而引起的部分染色体丢 失现象。
所述电融合步骤中电融合为：单一脉冲电压0.8～0.9KV/cm，作用 10～20微秒。
所述原核期受精卵实验过程中以小鼠为例，由如下步骤得到：给正常 3～5周龄的雌性小鼠腹腔注射孕马血清7.5～10国际单位/只，48小时后 注射绒毛膜促性腺激素7.5～10国际单位/只，与有正常生殖能力的雄鼠 合笼，在注射绒毛膜促性腺激素24～26小时后处死雌鼠，分离出输卵管， 用牛血清白蛋白质量含量10％的人输卵管液冲出原核期受精卵，并用 80IU/mL的透明质酸去除受精卵卵丘，得所述原核期受精卵。
所述胞质体由如下步骤得到：将原核期受精卵置于含终浓度0.2～ 0.4M蔗糖、0.8～1.0μg/mL细胞松弛素D、0.1～0.3μg/mL秋水仙胺的 人输卵管液中处理5～10分钟后，再利用显微镜操作进行去核，获取胞质 体。
具体的，所述方法步骤如下：
(1)给正常3～5周龄的雌性小鼠腹腔注射孕马血清7.5～10国际单 位/只，48小时后注射绒毛膜促性腺激素7.5～10国际单位/只， 与有正常生殖能力的雄鼠合笼，在注射绒毛膜促性腺激素24～ 26小时后处死雌鼠，分离出输卵管，用含牛血清白蛋白10％的 人输卵管液冲出原核期受精卵，并用80IU/mL的透明质酸去除 受精卵卵丘，得所述原核期受精卵；
(2)将步骤(1)所得原核期受精卵置于含终浓度为0.2～0.4M蔗糖、 0.8～1.0μg/mL细胞松弛素D、0.1～0.3μg/mL秋水仙胺的人输 卵管液中处理5～10分钟后，再利用显微镜操作进行去核，获 取胞质体；
(3)选取经活检的单个人卵裂球，将卵裂球和胞质体移入含植物凝 聚素300μg/mL的人输卵管液中，对胞质体、卵裂球进行排列， 使成对聚集；
(4)将成对的胞质体、卵裂球移入含终浓度山梨醇0.28M，硫酸镁 0.1mM，牛血清白蛋白0.3％的电融合液平衡，再进行电融合， 得异核体；电融合程序为：单一脉冲电压0.8～0.9KV/cm，作用 10～20微秒；
(5)将所得异核体置于含秋水仙胺0.05～0.1μg/mL的人输卵管液中 培养6～13小时，再用含0.1～0.2μg/mL细胞松弛素D、1.5～ 2.0μM花萼海绵诱癌素的人输卵管液处理，诱导早熟染色体凝 集形成；通常采用冈田酸进行早熟染色体凝集的诱导，有研究 发现花萼海绵诱癌素在淋巴细胞早熟染色体的诱导效率是冈田 酸的20倍，本发明采用1.5～2.0μM花萼海绵诱导卵裂球的早 熟染色体，发现有诱导效率的改善现象。
(6)再将诱导后的异核体置于含2％牛血清白蛋白的0.1％枸椽酸钠 溶液中低渗15～20分钟，然后先将异核体在固定液I中预固定 3～5分钟，待异核体细胞质透明后，将异核体转移至玻片并滴 加1滴固定液II，待固定液II几乎干燥、异核体显现时滴加固 定液II 2～3滴，最后将玻片转移至固定液III固定1分钟，玻片 干燥后，再用10％的吉姆萨染色5分钟，即可得到所述的单个 卵裂球染色体；所述固定液I为甲醇、乙酸、水体积比5∶1∶4的 混合液，所述固定液II为甲醇、乙酸体积比3∶1的混合液，所述 固定液III为甲醇、乙酸、水体积比3∶3∶1的混合液。
本发明所述制备单个卵裂球染色体的方法的有益效果主要体现在：通 过对电融合掖、染色体诱导液、低渗液，以及固定步骤的进一步改进和完 善，获得了效率高、质量好的单个卵裂球染色体的制备方法，制得染色体 形态清晰、质量高，结合G-显带或全染色体涂抹探针的FISH技术，可克 服现有间期核FISH技术存在的不足，使PGD的诊断范围扩大至整个染 色体组。
(四)说明书附图
图1为DAPI染色的单个人卵裂球染色体；
图2为吉姆萨染色的单个人卵裂球染色体；
图3为单个人卵裂球染色体的核型分析图；
图4为单个人卵裂球染色体的核型分析图；
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：
实施例1：以小鼠原核期受精卵作为胞浆受体时人卵裂球染色体的获得
先给4周龄的雌性小鼠注射9.0国际单位的孕马血清，48小时后注射 9.0国际单位绒毛膜促性腺激素(HCG)，与有生殖能力的雄鼠合笼。在 注射HCG24小时后处死雌鼠，分离出输卵管，用含10％牛血清白蛋白 (BSA)的人输卵管液(mHTF)冲出原核期受精卵，并用80IU/ml的透 明质酸酶去除受精卵的卵丘。
受精卵先置于含0.3M蔗糖、0.9μg/mL细胞松弛素D和0.2μg/mL秋 水仙胺的mHTF中处理8分钟后，再利用显微操作系统进行原核期受精 卵的去核。卵细胞以内径120μm的持卵针固定，用激光透明带打孔仪在 3点钟位置打一个孔，再用内径15μm的斜口针去核。去核的受精卵用0.3 ％的链霉蛋白酶溶解透明带，用拉细的巴斯德吸管去除极体，获取胞质体。
挑选第3天分裂至6-8细胞期的待测胚胎进行卵裂球活检。胚胎先 在无钙镁的培养液中孵育5分钟后，利用显微操作系统进行透明带开孔和 卵裂球活检。胚胎以内径120μm的持卵针固定，用激光透明带打孔仪在 3点钟位置开孔，再用内径35μm的平口取出一个卵裂球，活检后的胚胎 继续进行培养。
将卵裂球和去核的胞质体移入含300μg/mL植物凝聚素(PHA)的 mHTF中，用拉细的巴斯德吸管对胞质体、卵裂球进行排列，使两者成对 聚集。
将卵裂球-胞质体对移入电融合液中，电融合液的组成为：山梨醇 0.28M，硫酸镁0.1mM，牛血清白蛋白质量浓度0.3％。卵裂球-胞质体对 在电融合液中平衡片刻后，在ECM 830细胞融合电子操作仪进行电融合 操作，电融合的程序为：单一脉冲电压0.8～0.9KV/cm，作用10-20微秒。
融合而成的异核体在含0.8μg/mL秋水仙胺的人输卵管液(HTF)中培 养10小时，再用含1.8μM花萼海绵诱癌素和0.2μg/mL细胞松弛素D的 HTF处理1小时，诱导PCC的形成。
将诱导完毕的异核体置于含2％BSA的0.1％枸椽酸钠溶液中低渗20 分钟，在固定液I(甲醇∶乙酸∶水(体积比)＝5∶1∶4)中预固定3分钟， 待异核体的细胞质变透明后，再将异核体转移至玻片并滴加1滴固定液II (甲醇∶乙酸(体积比)＝3∶1)，待固定液II几乎干燥，异核体显现时再 滴3滴固定液II，最后将玻片转移至固定液III(甲醇∶乙酸∶水(体积比) ＝3∶3∶1)中固定1分钟，待玻片在湿度温箱中缓慢干燥后，再用质量浓 度10％的吉姆萨染色5分钟，即获得本发明的卵裂球染色体。
实施例2：以异常受精的人原核期受精卵作为胞浆受体时单个人卵裂球染 色体的获得
收集人类辅助生育实验室丢弃的人异常受精卵，包括单原核及三原核 以上的多原核卵，进行去核操作后，运用实施例1所述方法，制备单个人 卵裂球染色体。运用DAPI染色(DAPI含量0.5μg/mL，染色5分钟)获 得单个人卵裂球染色体见图1，运用吉萨姆染色(5％吉萨姆染色5分钟) 获得单个人卵裂球染色体见图2，获得单个人卵裂球染色体核型分布图见 图3、图4。
由图1～4可以看出，运用本发明方法，所得的单个人卵裂球染色体 形态十分清晰，质量较高，可通过G-显带及全染色体涂抹探针的FISH技 术检测植入前胚胎的全染色体组成，能应用于各种数目异常、结构异常染 色体病的PGD中，可在源头上控制染色体病的发生，具有重要的优生优 育意义。