霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物新工艺.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102174630 A (43)申请公布日 2011.09.07 CN 102174630 A *CN102174630A* (21)申请号 201110031709.4 (22)申请日 2011.01.30 C12P 33/20(2006.01) C12R 1/845(2006.01) (71)申请人 天津太平洋化学制药有限公司 地址 300350 天津市津南区开发区宝源路 27 号 (72)发明人 刘彩田 赵有杰 (54) 发明名称 霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物新工艺 (57) 摘要 本发明属于一种甾体激素类药物霉菌发酵工 艺， 尤其涉及到霉菌发酵生物合成制备霉。

2、菌氧化 物新工艺， 在 264搅拌反应， 并在生物发酵过 程中进行通气， 经 24-72h 氧化反应， 再经板框压 滤脱水、 吹干， 将底物沃氏氧化物转化为含有霉菌 氧化物的菌丝体， 再经丙酮提取得到霉菌氧化物 粗品， 经甲苯、 氯仿混合溶剂精制得到霉菌氧化物 精品。 该工艺采用有机氮源， 其配方更加适合生物 发酵工艺要求， 收率可达 87以上， 产品质量稳 定， 产量高、 转化率、 收率相关指标高， 经济效益可 观， 适用于产业化。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 102174634 A1/1 页 。

3、2 1. 一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺， 其特征在于 ： 它是以碳源、 氮源和 消沫剂为主要原料， 碳源 ： 葡萄糖 60 85kg ； 氮源 ： 玉米浆 60 85kg ； 蚕蛹粉 10 20kg ； 硫酸铵 5 10kg ； 消沫剂 ： 聚醚 1000 2000ml ； 搅拌反应， 并在生物发酵过程中通入空气， 经氧化反应、 压滤脱水、 吹干， 将底物沃氏氧化物转化为含有霉菌氧化物的菌丝体， 再经丙 酮提取得到霉菌氧化物粗品， 经甲苯、 氯仿混合溶媒精制得到霉菌氧化物精品。 2. 一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺， 其特征在于 ： 它包括以下步骤 ： (1) 菌丝制备 。

4、： A、 将碳源 ： 葡萄糖6085kg ； 氮源 ： 玉米浆6085kg ； 蚕蛹粉1020kg ； 硫酸铵5 10kg ； 消沫剂 ： 聚醚 1000 2000ml 一次投入到一级发酵罐内， 加入 1-4 吨水， 调整 PH 值至 2-5， 蒸汽灭菌， 降温至 264时， 接入黑根霉的孢子悬浮液 3-50 升， 孢子悬浮液浓度为 10-300 万 /ml， 通入空气， 搅拌 12-36h， 后移入二级发酵罐 ； B、 按与一级发酵罐同样的物料配比投 5-10 倍物料， 经灭菌， 降温至 264， 移入 A 步 骤所制全部液体， 通入空气、 搅拌 18-36h， 投入 340kg 底物沃氏氧。

5、化物， 于 25 30进行生 物氧化， 取样镜检， 及色谱测试， 底物转化比例达到 50-60后， 提高温度至 30-60， 下口 罐放料 ； C、 将菌丝液体压入板框压混机， 滤掉发酵液， 将菌丝体空气吹干， 再将菌丝体粉碎 ； (2)霉菌氧化物粗品的制备 ： 将粉碎后的菌丝体投入提取罐内， 加入菌丝体重量510 倍丙酮， 提取 2-8 次， 将提取液浓缩结晶， 得霉菌氧化物粗品 ； (3) 霉菌氧化物精制 ： 将霉菌氧化物粗品投入精制罐内， 加入霉菌氧化物粗品重量 1015倍体积的甲苯、 氯仿混合溶媒， 全溶浓缩， 反复精制3-9次， 取样测试， 霉菌氧化物含 量大于 97后， 下口罐放料。

6、、 滤干， 精品入烤箱干燥， 取样送检， 霉菌氧化物含量大于 97 为霉菌氧化物。 3. 如权利要求 2 所述的一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺， 其特征在于 ： 所说的搅拌温度为 264。 4. 如权利要求 2 所述的一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺， 其特征在于 ： 所说的通入空气为空气和反应液的体积比为 0.21-0.28 倍体积 /min。 5. 如权利要求 2 所述的一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺， 其特征在于 ： 所说的氧化反应时间为 24-72 小时。 6. 如权利要求 2 所述的一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺， 其特征在于 ： 所说的甲苯、 。

7、氯仿体积比为 ： 1 2 2 1。 权 利 要 求 书 CN 102174630 A CN 102174634 A1/4 页 3 霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物新工艺 技术领域 0001 本发明属于一种甾体激素类药物霉菌发酵工艺， 尤其涉及到霉菌发酵生物合成制 备霉菌氧化物新工艺。 背景技术 0002 六十年代初， 我国引进激素类药物产品， 激素类药物是人或动物的肾皮质所分泌 的一类激素， 它是维持和调节机体正常生理功能所不可缺少的甾体化合物。该类药物生产 过程中， 霉菌氧化物 (C21H28O4， 中文名， 11a- 羟基 -16， 17a- 环氧孕酮 ) 是制备激素类药物重 要的中间体。它。

8、是通过生物合成技术， 使用 “黑根霉 (Rhizopus nigricans)” 将底物 “沃氏 氧化物” 转化为 “霉菌氧化物” 的生物合成过程。该过程存在氮源中蛋白质含量偏低， 氨基 酸组合配伍不够合理， 尤其是铁离子含量低及存在可溶性磷离子等诸多缺陷， 虽多年来工 艺不断改进， 各项指标有所提高， 但其转化率、 收率、 指标并无大的突破。近年来， 随着激素 类药物不断研制、 开发， 一些高效、 低毒产品不断推向市场，“霉菌氧化物” 这个重要的中间 体， 更加显现出他的重要地位。 因此， 在稳定产品质量前提下， 改变突破现有工艺， 达到转化 率、 收率的高指标， 产品的高产率由显重要。经过。

9、近六年的技术探索、 实验、 生产， 最终成功 的确定了霉菌发酵生物合成新工艺， 达到了双高低耗， 产品的高产率， 创造了可观的经济效 益。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物新工艺， 它是针对现 有技术不足的一种改进， 它是采用新型氮源弥补蛋白质含量偏低， 氨基酸配不够合理等缺 陷的生物发酵工艺 ； 它在保证现有产品质量前提下， 大幅度提高产品转化率、 收率指标的重 大突破， 这是多年来各种改进所不能达到的。 0004 本发明技术方案是 ： 一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的工艺， 其特征在于 ： 它是以碳源、 氮源和消沫剂为主要原料， 碳源 ： 葡萄糖。

10、 60 85kg ； 氮源 ： 玉米浆 60 85kg ； 蚕蛹粉 10 20kg ； 硫酸铵 5 10kg ； 消沫剂 ： 聚醚 1000 2000ml ； 搅拌反应， 并在生物发 酵过程中通入空气， 经氧化反应、 压滤脱水、 吹干， 将底物沃氏氧化物转化为含有霉菌氧化 物的菌丝体， 再经丙酮提取得到霉菌氧化物粗品， 经甲苯、 氯仿混合溶媒精制得到霉菌氧化 物精品。 0005 一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的新工艺， 其特征在于 ： 它包括以下步 骤 ： 0006 (1) 菌丝制备 ： 0007 A、 将碳源 ： 葡萄糖 60 85kg ； 氮源 ： 玉米浆 60 85kg ； 蚕蛹粉 。

11、10 20kg ； 硫酸 铵 5 10kg ； 消沫剂 ： 聚醚 1000 2000ml 一次投入到一级发酵罐内， 加入 1-4 吨水， 调整 PH值至2-5， 蒸汽灭菌， 降温至264时， 接入黑根霉的孢子悬浮液3-50升， 孢子悬浮液浓 度为 10-300 万 /ml， 通入空气， 搅拌 12-36h， 后移入二级发酵罐 ； 说 明 书 CN 102174630 A CN 102174634 A2/4 页 4 0008 B、 按与一级发酵罐同样的物料配比投 5-10 倍物料， 经灭菌， 降温至 264， 移入 A 步骤所制全部液体， 通入空气、 搅拌 18-36h， 投入 340kg 底物。

12、沃氏氧化物， 于 25 30进 行生物氧化， 取样镜检， 及色谱测试， 底物转化比例达到 50-60后， 提高温度至 30-60， 下口罐放料 ； 0009 C、 将菌丝液体压入板框压混机， 滤掉发酵液， 将菌丝体空气吹干， 再将菌丝体粉 碎 ； 0010 (2) 霉菌氧化物粗品的制备 ： 将粉碎后的菌丝体投入提取罐内， 加入菌丝体重量 5 10 倍丙酮， 提取 2-8 次， 将提取液浓缩结晶， 得霉菌氧化物粗品 ； 0011 (3) 霉菌氧化物精制 ： 将霉菌氧化物粗品投入精制罐内， 加入霉菌氧化物粗品重 量 10 15 倍体积的甲苯、 氯仿混合溶媒， 全溶浓缩， 反复精制 3-9 次， 取。

13、样测试， 霉菌氧化 物含量大于 97后， 下口罐放料、 滤干， 精品入烤箱干燥， 取样送检， 霉菌氧化物含量大于 97为霉菌氧化物。 0012 所说的搅拌温度为 264。 0013 所说的通入空气为空气和反应液的体积比为 0.21-0.28 倍体积 /min。 0014 所说的氧化反应时间为 24-72 小时。 0015 所说的甲苯、 氯仿体积比为 ： 1 2 2 1。 0016 本发明的化学反应式是 ： 0017 0018 沃氏氧化物 霉菌氧化物 0019 本发明的有益效果是 ： 该工艺采用有机氮源， 弥补原工艺氮源中蛋白质含量偏低， 氨基酸组合配伍不够合理的缺陷， 尤其是铁离子含量低及可溶。

14、性磷离子的存在等诸多因 素， 其配方更加适合生物发酵工艺要求， 通过上述工艺所制备的霉菌氧化物精品， 其霉菌氧 化物精品质量稳定， 含量高， 总收率由现行水平的 80提高到 87， 产率高， 经济效益可 观， 适用于产业化。 具体实施方式 0020 本发明提供的一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物， 它是以碳源、 氮源和消沫 剂为主要原料， 碳源 ： 葡萄糖 60 85kg ； 氮源 ： 玉米浆 60 85kg ； 蚕蛹粉 10 20kg ； 硫酸 铵 5 10kg ； 消沫剂 ： 聚醚 1000 2000ml ； 搅拌反应， 并在生物发酵过程中通入空气， 经氧 化反应、 压滤脱水、 吹干， 将。

15、底物沃氏氧化物转化为含有霉菌氧化物的菌丝体， 再经丙酮提 取得到霉菌氧化物粗品， 经甲苯、 氯仿混合溶媒精制得到霉菌氧化物精品。 0021 实施例 1 ： 一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的新工艺， 它包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 102174630 A CN 102174634 A3/4 页 5 0022 1、 菌丝培养 ： 0023 (1) 将葡萄糖 60kg、 玉米浆 60kg ； 蚕蛹粉 10kg ； 硫酸铵 5kg、 聚醚 1000ml 一次投入 一级发酵罐内， 加入 1.5 吨水， 调整 PH 值 2， 蒸汽灭菌， 降温至 264时， 接入黑根霉的孢 子悬浮液(中国药品生物。

16、制品检定所菌种库购进)3升， 浓度为10万/ml， 通入0.21倍体积 /min 空气， 搅拌培养 24h， 镜检， 发现菌丝成长成熟后， 移入二级发酵罐 ； 0024 (2) 将葡萄糖 600kg、 玉米浆 600kg ； 蚕蛹粉 100kg ； 硫酸铵 50kg、 聚醚 10000ml 配 比将物料投入二级发酵罐内， 经灭菌， 降温至 264， 移入 (1) 步骤所制全部液体， 通入 0.21 倍体积 /min 空气、 搅拌、 培养 24h， 镜检， 菌丝成长成熟后， 投入 340 公斤沃氏氧化物， 于 26进行生物氧化至 30h， 取样镜检， 及色谱测试， 底物转化比例达到 50后， 提。

17、高温度 30， 得到菌丝为 1500 公斤， 霉菌氧化物转化率 51， 下罐口放料 ； 0025 (3) 将菌丝液体压入板框压混机， 滤掉发酵液， 将菌丝体空气吹干， 再将菌转体粉 碎 ； 0026 2、 霉菌氧化物粗品的提取制备 ： 将粉碎后的菌丝体投入提取罐内， 加入菌丝重量 5 倍丙酮， 提取 5 次， 将提取液浓缩结晶， 滤液压入浓缩罐浓缩， 得霉菌氧化物粗品， 粗品率 96.3 ； 0027 3、 霉菌氧化物精制 ： 将霉菌氧化物粗品投入精制罐内， 加入霉菌氧化物粗品重量 10 倍甲苯、 氯仿混合溶媒， 甲苯、 氯仿体积比为 ： 1 1， 搅拌溶清， 全溶浓缩， 反复精制 5 次， 。

18、取样测试， 霉菌氧化物含量大于 97后， 下口罐放料、 滤干， 精品入烤箱干燥， 取样送检， 霉 菌氧化物含量大于 97为霉菌氧化物精品， 精制率 97.1。 0028 实施例 2 ： 一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的新工艺， 它包括以下步骤 ： 0029 1、 菌丝培养 ： 0030 (1) 将葡萄糖 85kg、 玉米浆 85kg ； 蚕蛹粉 20kg ； 硫酸铵 10kg、 聚醚 2000ml 一次投 入一级发酵罐内， 加入一吨水， 调整 PH 值 3.5， 蒸汽灭菌， 降温至 264时， 接入黑根霉的 孢子悬浮液(中国药品生物制品检定所菌种库购进)28升， 浓度为150万/ml， 通。

19、入0.24倍 体积 /min 空气， 搅拌下培养 36h， 镜检， 发现菌丝成长成熟后， 移入二级发酵罐 ； 0031 (2) 将葡萄糖 680kg、 玉米浆 680kg ； 蚕蛹粉 160kg ； 硫酸铵 80kg、 聚醚 160000ml 配比将物料投入二级发酵罐内， 经灭菌， 降温至 264， 移入 (1) 步骤所制全部液体， 通入 0.24 倍体积 /min 空气、 搅拌、 培养 24h， 镜检， 发现菌丝成长成熟后， 投入 340 公斤底物沃氏 氧化物， 于 30进行生物氧化至 72h， 取样镜检， 及色谱测试， 底物转化比例达到 55后， 提 高温度 45， 得到菌丝为 1700 。

20、公斤， 霉菌氧化物转化率 58， 下罐口放料 ； 0032 (3) 将菌丝液体压入板框压混机， 滤掉发酵液， 将菌丝体空气吹干， 再将菌转体粉 碎 ； 0033 2、 霉菌氧化物粗品的制备 ： 将粉碎后的菌丝体投入提取罐内， 加入菌丝重量 8 倍丙酮， 提取 8 次， 将提取液浓缩结晶， 滤液压入浓缩罐浓缩， 得霉菌氧化物粗品， 粗品率 97.2 ； 0034 3、 霉菌氧化物精制 ： 将霉菌氧化物粗品投入精制罐内， 加入霉菌氧化物粗品重量 10 倍甲苯、 氯仿混合溶媒， 甲苯、 氯仿体积比为 ： 2 1， 搅拌溶清， 全溶浓缩， 反复精制 3 次， 取样测试霉菌氧化物含量大于 97后， 下罐。

21、口放料、 滤干， 精品入烤箱干燥， 取样送检， 霉菌 氧化物含量大于 97为霉菌氧化物精品， 精制率 97.9。 说 明 书 CN 102174630 A CN 102174634 A4/4 页 6 0035 实施例 3 ： 一种霉菌发酵生物合成制备霉菌氧化物的新工艺， 其特征在于 ： 它包括 以下步骤 ： 0036 1、 菌丝培养 ： 0037 (1) 将葡萄糖 75kg、 玉米浆 75kg ； 蚕蛹粉 15kg ； 硫酸铵 8kg、 聚醚 1500ml 一次投入 一级种子培养罐内， 加入一吨水， 调整 PH 值 5， 蒸汽灭菌， 降温至 264时， 接入菌种库购 进的黑根霉的孢子悬浮液 (。

22、 中国药品生物制品检定所菌种库购进 )50 升， 浓度为 300 万 / ml， 通入0.28倍体积/min空气， 搅拌下培养24h， 镜检， 发现菌丝成长成熟后， 移入二级发酵 罐 ； 0038 (2)将葡萄糖675kg、 玉米浆675kg ； 蚕蛹粉135kg ； 硫酸铵72kg、 聚醚13500ml配比 将物料投入二级发酵罐内， 经灭菌， 降温至264， 移入(1)步骤所制全部液体， 通入0.28 倍体积 /min 空气、 搅拌、 培养 24h， 镜检， 发现菌丝成长成熟后， 投入 340 公斤底物沃氏氧化 物， 于 34进行生物氧化至 48h， 取样镜检， 及色谱测试， 底物转化比例达。

23、到 60后， 提高温 度 60， 得到菌丝为 1600 公斤， 霉菌氧化物转化率 55， 下罐口放料 ； 0039 (3) 将菌丝液体压入板框压混机， 滤掉发酵液， 将菌丝体空气吹干， 再将菌转体粉 碎 ； 0040 2、 霉菌氧化物粗品的制备 ： 将粉碎后的菌丝体投入提取罐内， 加入菌丝重量 6 倍丙酮， 提取 6 次， 将提取液浓缩结晶， 滤液压入浓缩罐浓缩， 得霉菌氧化物粗品， 粗品率 96.5 ； 0041 3、 霉菌氧化物精制 ： 将霉菌氧化物粗品投入精制罐内， 加入 12 倍甲苯、 氯仿混合 溶媒， 甲苯、 氯仿体积比为 ： 1 2， 搅拌溶清， 全溶浓缩， 反复精制 5 次， 取样测试， 霉菌氧化 物含量大于 97后， 下罐口放料、 滤干， 精品入烤箱干燥， 取样送检， 霉菌氧化物含量大于 97为霉菌氧化物精品， 精制率 97.3。 说 明 书 CN 102174630 A 。