高特异性检测NDM-1基因的引物组合物及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102181558 A (43)申请公布日 2011.09.14 CN 102181558 A *CN102181558A* (21)申请号 201110108513.0 (22)申请日 2011.04.28 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 9/80(2006.01) (71)申请人 中国科学院微生物研究所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所 A222 (72)发明人 朱宝利 武娜 张苑怡 王志云 (74)专利代理机构 北京纪凯。

2、知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 高特异性检测 NDM-1 基因的引物组合物及其 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种高特异性检测 NDM-1 基因 的引物组合物及其应用。本发明提供了辅助检测 NDM-1 蛋白的编码基因的专用引物， 由序列表的 序列 1、 序列 2、 序列 3、 序列 4、 序列 5 和序列 6 所 示DNA组成 ； NDM-1蛋白是由序列7所示的氨基酸 序列组成的蛋白质。 应用所述专用引物检测， 具有 灵敏度高、 速度快、 特异性强、 简便、 安全等特点， 其广泛应用将大大提高低仪器配置地区的病原微 生物检测能力， 对病原微生物的早期、。

3、 准确诊断有 着重大意义。 本发明不仅可指导临床合理用药， 以 免延误病情和增加治疗费用， 而且有利于控制其 传播， 防止暴发流行， 这对提高治疗效果和控制医 院内感染均有重要意义。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 9 页 序列表 8 页 附图 3 页 CN 102181561 A1/2 页 2 1. 辅助检测 NDM-1 蛋白的编码基因的专用引物， 由序列表的序列 1 所示 DNA、 序列表的 序列 2 所示 DNA、 序列表的序列 3 所示 DNA、 序列表的序列 4 所示 DNA、 序列表的序列 5 所示 D。

4、NA 和序列表的序列 6 所示 DNA 组成 ； 所述 NDM-1 蛋白是如下 (a) 或 (b) 的蛋白质 ： (a) 由序列表中序列 7 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列 7 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加 且具有相同功能的由序列 7 衍生的蛋白质。 2. 一种辅助检测 NDM-1 蛋白的编码基因的试剂盒， 包括权利要求 1 所述的专用引物 ； 所述 NDM-1 蛋白是如下 (a) 或 (b) 的蛋白质 ： (a) 由序列表中序列 7 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列 7 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 。

5、/ 或缺失和 / 或添加 且具有相同功能的由序列 7 衍生的蛋白质。 3. 权利要求 1 所述专用引物在制备辅助检测 NDM-1 蛋白的编码基因的试剂盒中的应 用 ； 所述 NDM-1 蛋白是如下 (a) 或 (b) 的蛋白质 ： (a) 由序列表中序列 7 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列 7 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加 且具有相同功能的由序列 7 衍生的蛋白质。 4.权利要求1所述专用引物或权利要求2所述试剂盒在辅助检测NDM-1蛋白的编码基 因中的应用 ； 所述 NDM-1 蛋白是如下 (a) 或 (b) 的蛋白质 ： (a) 。

6、由序列表中序列 7 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列 7 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加 且具有相同功能的由序列 7 衍生的蛋白质。 5.权利要求1所述专用引物或权利要求2所述试剂盒在辅助鉴定含有NDM-1蛋白的编 码基因的生物样本中的应用 ； 所述 NDM-1 蛋白是如下 (a) 或 (b) 的蛋白质 ： (a) 由序列表中序列 7 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列 7 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加 且具有相同功能的由序列 7 衍生的蛋白质。 6.如权利要求1所述的专用引物， 如。

7、权利要求2所述的试剂盒， 或如权利要求3至5中 任一所述的应用， 其特征在于 ： 所述 NDM-1 蛋白的编码基因为如下 (1) 或 (2) 或 (3) 或 (4) 所述的 DNA 分子 ： (1) 序列表中序列 8 所示的 DNA 分子 ； (2) 序列表的序列 8 自 5 末端第 14 至 826 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； (3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子 ； (4) 与 (1) 或 (2) 限定的 DNA 序列至少具有 90以上同源性且编码相同功能蛋白的 DNA 分子。 7. 一种辅助鉴定待测生物样本是否含有 NDM-1 蛋白的。

8、编码基因的方法， 包括如下步 权 利 要 求 书 CN 102181558 A CN 102181561 A2/2 页 3 骤 ： (1) 提取所述待测生物样本的基因组 DNA ； (2)以步骤(1)的基因组DNA为模板， 用权利要求1所述的专用引物进行环介导恒温扩 增 ； (3) 根据步骤 (2) 的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有 NDM-1 蛋白的编码基 因 ； 所述 NDM-1 蛋白是如下 (a) 或 (b) 的蛋白质 ： (a) 由序列表中序列 7 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； (b) 将序列 7 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加 且具有。

9、相同功能的由序列 7 衍生的蛋白质。 8. 如权利要求 7 所述的方法， 其特征在于 ： 所述 NDM-1 蛋白的编码基因为如下 (1) 或 (2) 或 (3) 或 (4) 所述的 DNA 分子 ： (1) 序列表中序列 8 所示的 DNA 分子 ； (2) 序列表的序列 8 自 5 末端第 14 至 826 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； (3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子 ； (4) 与 (1) 或 (2) 限定的 DNA 序列至少具有 90以上同源性且编码相同功能蛋白的 DNA 分子。 9. 如权利要求 7 或 8 所述的方法， 其特征。

10、在于 ： 所述环介导恒温扩增的反应程序为 ： 65 1 小时， 80 5 分钟。 10. 如权利要求 7 或 8 或 9 所述的方法， 其特征在于 ： 所述环介导恒温扩增的反应体系 中， 序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA的浓度均为0.2mol/L， 序列表的 序列 3 所示 DNA 和序列表的序列 4 所示 DNA 的浓度均为 1.6mol/L， 序列表的序列 5 所示 DNA 和序列表的序列 6 所示 DNA 的浓度均为 0.8mol/L。 权 利 要 求 书 CN 102181558 A CN 102181561 A1/9 页 4 高特异性检测 NDM-1 基因的引物组合。

11、物及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种高特异性检测 NDM-1 基因的引物组合物及其应用。 背景技术 0002 早在人类诞生之前， 细菌便开启了自己的生命历程， 二战期间细菌严重威胁了人 类的生命。1929 年， 弗莱明偶然间发现了青霉素 (Penicillin)， 随着抗生素药物的问世， 细 菌的耐药性在一些国家得到一定的控制。 1961年， 后英国学者Jevons首次发现了耐甲氧西 林的金黄色葡萄球菌 (Methicillin-resitant Staphylococcus aureus， MRSA)， MRSA 能分 泌一种酚可溶性调控蛋白(Phenol-soluble modu。

12、lin， PSM)破坏人类的嗜中性粒细胞， 形成 严重感染第一任 “超级细菌” 就此诞生。近年来抗生素滥用及抗生素累积的双重因素， 使得细菌中的耐药基因不断积累， 从而产生了多重抗药性。 0003 据 2010 年 8 月 11 日出版的英国 The Lancet Infectious Diseases期刊报 道， 目前有一种新的耐药基因在一些国家流行， 一些西方医学家称其为 NDM-1 基因。NDM-1 基因编码的蛋白被命名为 “新德里金属 - 内酰胺酶 1(New Metallo-Lactamase-1)。 新德里金属 - 内酰胺酶 1 由 269 个氨基酸残基组成， 与现有的其它金属 -。

13、 内酰胺酶 (Metallo-Lactamase) 的一致性不足 33， 且在酶活性位点附近经常有其独特的氨基 酸残基及插入序列， 并能与碳青霉烯类抗生素紧密结合。 NDM-1基因目前已发现于克雷伯式 杆菌的 180kb 的质粒和大肠杆菌的 140kb 的质粒上。在 NDM-1 基因上游的 2 个区域中还存 在能够抵抗链霉素、 红霉素、 氯霉素、 利福平等抗生素的基因以及消毒剂和磺胺药物的多种 耐药基因。由于含有 NDM-1 基因的质粒即能在菌株之间穿梭传递， 又可以在转移中发生重 组， 且通过携带 NDM-1 基因的质粒的传递， 还可使对抗生素敏感的细菌获得多重耐药性， 大 大增加临床抗生素。

14、使用的困难。 0004 目前， 携带有 NDM-1 基因的超级细菌正在全球蔓延， 印度、 美国、 英国、 澳大利亚、 加拿大、 法国、 荷兰等多个国家已经出现了疑似病例。面对 “超级细菌” 的跨国传播趋势， 寻 找一种简便、 快速、 准确的耐药基因检测方法成为许多科研工作者的重大课题， 也是临床实 践检验中急切解决的问题。建立快速、 简便、 可靠的检测方法对 NDM-1 基因进行检测， 对于 指导临床的早期治疗和有效的控制超级细菌的传播具有重大意义。 0005 LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 法是 2000 年由 Notomi 等发 明。

15、的一种新颖的恒温核酸扩增方法。 该方法采用特异地识别靶序列上六个区域的四条引物 ( 两条外引物， 两条内引物 ) 及具有链置换活性的 Bst DNA 聚合酶， 在 65左右进行核酸的 指数级扩增， 其扩增效率可达到 109-1010个拷贝数量级。整个反应仅需 1 小时， 在扩增反应 中副产物焦磷酸镁沉淀与钙黄绿素结合， 产生黄绿色荧光， 不需要借助其他仪器便可辨别 实验结果。LAMP 技术具有简便、 快速、 准确、 廉价、 易检测等特点。目前， 国内外尚未见 LAMP 方法检测 NDM-1 基因的报道。 发明内容 说 明 书 CN 102181558 A CN 102181561 A2/9 页。

16、 5 0006 本发明的目的是提供一种高特异性检测 NDM-1 基因的引物组合物及其应用。 0007 本发明提供的辅助检测 NDM-1 蛋白 ( 新德里金属 - 内酰胺酶 1) 的编码基因的 专用引物， 由序列表的序列1所示DNA、 序列表的序列2所示DNA、 序列表的序列3所示DNA、 序列表的序列 4 所示 DNA、 序列表的序列 5 所示 DNA 和序列表的序列 6 所示 DNA 组成。 0008 本发明还保护一种辅助检测 NDM-1 蛋白的编码基因的试剂盒， 包括所述的专用引 物。 0009 所述专用引物可用于制备辅助检测 NDM-1 蛋白的编码基因的试剂盒。 0010 所述专用引物或。

17、所述试剂盒可用于辅助检测 NDM-1 蛋白的编码基因。 0011 所述专用引物或所述试剂盒可用于辅助鉴定含有 NDM-1 蛋白的编码基因的生物 样本。 0012 所述 NDM-1 蛋白是如下 (a) 或 (b) 的蛋白质 ： 0013 (a) 由序列表中序列 7 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 0014 (b) 将序列 7 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或 添加且具有相同功能的由序列 7 衍生的蛋白质。 0015 所述 NDM-1 蛋白的编码基因为如下 (1) 或 (2) 或 (3) 或 (4) 所述的 DNA 分子 ： 0016 (1) 序列表中序列 8 。

18、所示的 DNA 分子 ； 0017 (2) 序列表的序列 8 自 5 末端第 14 至 826 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 0018 (3) 在严格条件下与 (1) 或 (2) 限定的 DNA 序列杂交且编码相同功能蛋白的 DNA 分子 ； 0019 (4) 与 (1) 或 (2) 限定的 DNA 序列至少具有 90以上同源性且编码相同功能蛋白 的 DNA 分子。 0020 本发明还保护一种辅助鉴定待测生物样本是否含有 NDM-1 蛋白的编码基因的方 法， 包括如下步骤 ： 0021 (1) 提取所述待测生物样本的基因组 DNA ； 0022 (2) 以步骤 (1) 的基因组 DNA 为。

19、模板， 用所述的专用引物进行环介导恒温扩增 ； 0023 (3) 根据步骤 (2) 的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有所述 NDM-1 蛋白的 编码基因。 0024 所述环介导恒温扩增的反应程序可为 ： 65 1 小时， 80 5 分钟。 0025 所述环介导恒温扩增的反应体系中， 序列表的序列 1 所示 DNA 和序列表的序列 2 所示 DNA 的浓度均可为 0.2mol/L， 序列表的序列 3 所示 DNA 和序列表的序列 4 所示 DNA 的浓度均可为 1.6mol/L， 序列表的序列 5 所示 DNA 和序列表的序列 6 所示 DNA 的浓度均 可为 0.8mol/L。 0026 。

20、所述待测生物样本可为大肠杆菌 (Escherichia coli)、 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、 肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae) 或肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)。 0027 所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌 DH5、 所述金黄色葡萄球菌具体可为金黄色葡 萄球菌 ATCC25923、 所述肺炎克雷伯氏菌具体可为肺炎克雷伯氏菌 EL-2 株、 所述肺炎链球 菌具体可为肺炎链球菌 R6。 0028 所述环介导恒温扩增的反应体系中含有钙黄绿素时， 可通过荧光显色进行结果判 说 明 书 CN 10218。

21、1558 A CN 102181561 A3/9 页 6 读， 如果环介导等温扩增体系显示为绿色， 待测生物样本中含有所述 NDM-1 蛋白的编码基 因， 如果环介导等温扩增体系显示为橙色， 待测生物样本中不含有所述 NDM-1 蛋白的编码 基因。 0029 还可通过观察沉淀进行结果判读， 如果环介导等温扩增体系中生成白色沉淀， 待 测生物样本中含有所述 NDM-1 蛋白的编码基因， 如果环介导等温扩增体系中没有生成白色 沉淀， 待测生物样本中不含有所述 NDM-1 蛋白的编码基因。 0030 还可通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判读， 如果反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示梯 状条带， 待测生物样本中含。

22、有所述 NDM-1 蛋白的编码基因， 如果反应产物的琼脂糖凝胶电 泳不显示梯状条带， 待测生物样本中不含有所述 NDM-1 蛋白的编码基因。 0031 还可通过浊度仪进行结果判读， 从反应开始时刻即通过 Loopamp 浊度仪检测反应 液， 如果生成浊度变化曲线待测生物样本中含有所述 NDM-1 蛋白的编码基因， 如果没有生 成浊度变化曲线待测生物样本中不含有所述 NDM-1 蛋白的编码基因。 0032 应用所述专用引物可以通过 LAMP( 环介导恒温扩增 ) 技术从分子水平上直接快 速、 准确检测 NDM-1 耐药基因， 具有如下优点 ： (1) 在恒温条件下即可发生反应， 摆脱了了对 于仪。

23、器的依赖 ； (2) 反应时间短 ； 在 1h 内即可完成 ； (3) 灵敏度高 ； 比传统 PCR 扩增技术提 高了两个数量级， 最低检测限为 60copies/ 反应 ； (4) 特异性强 ； 应用 6 个靶基因位点， 内 引物及外引物在 6 个区域特异性结合方可进行扩增 ； (5) 鉴定简便 ； 在核酸大量合成时， 从 dNTP 解离出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合， 产生副产物 - 焦磷酸镁沉淀 ； 如果 在反应体系中加入结合了 Mn2+的钙黄绿素， Mg2+则替换掉钙黄绿素中结合的 Mn2+， 是钙黄绿 素发出黄绿色荧光 ； 以上两种方法均不需要借助其他仪器便可肉眼观察实。

24、验结果， 实现了 结果可视化 ； 也可通过 Loopamp 浊度仪检测的方式进行结果判读 ； (6) 步骤简单 ； 先将 DNA 模板在 96， 预变性 3min。再将所有配制在一起的试剂， 一步添加进去， 实现一步核酸扩 增， 免开盖操作， 可保证临床检验人员自身安全， 进而亦避免了 “超级细菌” 的传播。 0033 应用本发明提供的专用引物检测 NDM-1 蛋白的编码基因， 解决了其他检测技术对 于临床实际应用需求的针对性不强的技术弊端， 并且解决了其他检测技术耗时长、 操作复 杂、 检测仪器昂贵、 灵敏度及特异性差等技术问题， 具有灵敏度高、 速度快、 特异性强、 简便、 安全等特点， 。

25、为快速、 准确的检测 NDM-1 耐药基因打下坚实的基础， 其广泛应用将大大提高 低仪器配置地区的病原微生物检测能力， 对病原微生物的早期、 准确诊断有着重大意义。 本 发明不仅可指导临床合理用药， 以免延误病情和增加治疗费用， 而且有利于控制其传播， 防 止暴发流行， 这对提高治疗效果和控制医院内感染均有重要意义。 附图说明 0034 图 1 为实施例 2 中通过检测浊度变化判读结果。 0035 图 2 为实施例 3 中通过琼脂糖凝胶电泳判读结果。 0036 图 3 为实施例 4 中 NDM-1 基因语同源序列的 BLAST 比对结果。 0037 图 4 为对比例中的琼脂糖凝胶电泳图。 具体。

26、实施方式 0038 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 说 明 书 CN 102181558 A CN 102181561 A4/9 页 7 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 0039 大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 ： 公众可以从中国科学院微生物研究所获得 ； 参考文献 ： 韩俊， 陈岚， 段淑敏等， 金属催化剂有效快速裂解 SARS 冠状病毒和其他微生物， 中国实验动物学报， 2006 年 9 月， 第 14 卷， 第 3 期， 199-212。

27、 页。 0040 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923 ： 公众可以从中国科学院微 生物研究所获得 ； 参考文献 ： 王坚， 吴梅， 陆炜方等， 48 株金黄色葡萄球菌检测耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌及药敏分析， 中国煤炭工业医学杂志， 2009 年 1 月第 12 卷第 1 期， 93-94。 0041 肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)EL-2 株 ： 公众可以从中国科学院微生 物研究所获得 ； 参考文献 ： 孔庆娟， 刘马峰， 白建等， 大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的药 敏试验， 畜禽业， 2005 年第 1 期总第 1。

28、77 期， 64-66。 0042 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)R6 ： 公众可以从中国科学院微生物研究 所获得 ； 参考文献 ： 张巧， 林科雄， 马千里等， 肺炎链球菌溶菌酶作为肺炎链球菌多价核酸 疫苗候选抗原的保护效能评价， 重庆医科大学学报， 2010 年第 35 卷第 5 期。 0043 实施例 1、 专用引物的设计和制备 0044 设计并合成表 1 所示的各条引物 (FOP、 BOP、 FIP、 BIP、 FLP 和 BLP)。 0045 表 1 所示的六条引物组成专用引物， 用于实施例 2。 0046 表 1 引物的核苷酸序列 0047 引物序列。

29、 (5 -3 ) 引物长度 FOP( 序列表的序列 1) TCGATACCGCCTGGACC 17bp BOP( 序列表的序列 2) CGCAACCATCCCCTCTTG 18bp FIP( 序列表的序列 3) GCGACCGGCAGGTTGATCTGATGACCAGACCGCCCAG 37bp BIP( 序列表的序列 4) GTGGTGACTCACGCGCATCAGGACGCATTGGCATAAGTCGCA 42bp FLP( 序列表的序列 5) CCTGCTTGATCCAGTTGAGGAT 22bp BLP( 序列表的序列 6) ACAAGATGGGCGGTATGGA 19bp 0048 。

30、NDM-1蛋白的氨基酸序列如序列表的序列7所示， 其编码基因如序列表的序列8所 示， 开放阅读框为序列表的序列 8 自 5 末端第 14 至 826 位核苷酸。 0049 实施例 2、 应用专用引物检测 NDM-1 基因 0050 一、 模板的制备 0051 合成序列表的序列11所示的DNA(模板)， 为了使靶序列的核苷酸序列不能翻译成 为具有活性的功能蛋白， 将所述靶序列中的个别核苷酸进行了替换， 为了便于与其它模板 区分， 将序列 11 所示的 DNA 也称为 NDM-1 基因。 0052 二、 应用专用引物检测 NDM-1 基因 说 明 书 CN 102181558 A CN 10218。

31、1561 A5/9 页 8 0053 1、 通过观察荧光颜色变化判读结果 ( 荧光显色法 ) 0054 采用步骤一合成的模板 ( 浓度为 2.9ng/l) 进行 LAMP( 环介导恒温扩增 )， LAMP 反应体系见表 2。 0055 表 2LAMP 反应体系 (25L) 0056 组分 在反应体系中的终浓度 FIP 1.6mol/L BIP 1.6mol/L FOP 0.2mol/L BOP 0.2mol/L FLP 0.8mol/L BLP 0.8mol/L dNTPS 1.4mmol/L 甜菜碱 (Betaine) 0.8mmol/L Tris-HCl(pH8.8) 20mmol/L K。

32、Cl 10mmol/L (NH4)2SO4 10mmol/L MgSO4 8mmol/L Tween20 0.1 ( 体积百分含量 ) Bst DNA Polymerase 8U 模板 2L 钙黄绿素 1l 双蒸水 定容 0057 以 2L 双蒸水作为模板的空白对照。 0058 将表 2 中除模板以外的试剂混匀备用 ； 将模板在 96预变性 3min ； 然后将模板与 混匀好的其它试剂混合， 即为完整的 LAMP 反应体系。 0059 LAMP 反应程序 ： 65 1 小时， 80 5 分钟， 4保存。 0060 反应完成后观察反应溶液的颜色变化 ( 反应前溶液均显示浅橙色荧光， 如果反应 说。

33、 明 书 CN 102181558 A CN 102181561 A6/9 页 9 结果为阳性， 反应后溶液应显示绿色荧光 )。结果表明 ： 以 NDM-1 基因为模板， 反应后的反 应液显示绿色荧光 ； 空白对照中， 反应后的反应液显示浅橙色荧光。 0061 进行三次重复实验， 结果一致。 0062 2、 通过观察白色沉淀判读结果 0063 采用步骤一合成的模板 ( 浓度为 2.9ng/l) 进行 LAMP( 环介导恒温扩增 )， LAMP 反应体系见表 3。 0064 表 3LAMP 反应体系 (25L) 0065 组分 在反应体系中的终浓度 FIP 1.6mol/L BIP 1.6mol。

34、/L FOP 0.2mol/L BOP 0.2mol/L FLP 0.8mol/L BLP 0.8mol/L dNTPS 1.4mmol/L 甜菜碱 (Betaine) 0.8mmol/L Tris-HCl(pH8.8) 20mmol/L KCl 10mmol/L (NH4)2SO4 10mmol/L MgSO4 8mmol/L Tween20 0.1 ( 体积百分含量 ) Bst DNA Polymerase 8U 模板 2L 双蒸水 定容 0066 0067 以 2L 双蒸水作为模板的空白对照。 0068 将表 3 中除模板以外的试剂混匀备用 ； 将模板在 96预变性 3min ； 然后将。

35、模板与 混匀好的其它试剂混合， 即为完整的 LAMP 反应体系。 说 明 书 CN 102181558 A CN 102181561 A7/9 页 10 0069 LAMP 反应程序 ： 65 1 小时， 80 5 分钟， 4保存。 0070 反应完成后肉眼直接观察反应液。 结果表明 ： 以NDM-1基因为模板， 反应后的反应 液中出现白色浑浊沉淀物 ( 焦磷酸镁 ) ； 空白对照中， 反应后的反应液仍为无色透明状态。 0071 进行三次重复实验， 结果一致。 0072 3、 通过检测浊度变化判读结果 0073 采用步骤一合成的模板 ( 浓度为 2.9ng/l) 进行 LAMP( 环介导恒温扩。

36、增 )， LAMP 反应体系见表 3。 0074 以 2L 双蒸水作为模板的空白对照。 0075 将表 3 中除模板以外的试剂混匀备用 ； 将模板在 96预变性 3min ； 然后将模板与 混匀好的其它试剂混合， 即为完整的 LAMP 反应体系。 0076 反应温度为 65， 从反应开始时刻即通过 Loopamp 浊度仪 ( 厂家 ： 日本荣研化学 株式会 ； 型号 ： LA-320C ； 参数 ： 光源为 ED( 波长 650mm)， 检出器为光电二极管， 温度调节范 围为区域 (55-70 )、 光罩 (65-90 )， 测定间隔为 6 秒 ) 检测反应液， 实时检测 60 分钟。 007。

37、7 扩增曲线见图 1(1 表示阳性反应， 2 表示空白对照 )。结果表明 ： 以 NDM-1 基因为 模板可以得到扩增曲线 ； 空白对照中， 没有发生扩增曲线。 0078 进行三次重复实验， 结果一致。 0079 4、 通过琼脂糖凝胶电泳判读结果 0080 采用步骤一合成的模板 ( 浓度为 2.9ng/l) 进行 LAMP( 环介导恒温扩增 )， LAMP 反应体系见表 3。 0081 以 2L 双蒸水作为模板的空白对照。 0082 将表 3 中除模板以外的试剂混匀备用 ； 将模板在 96预变性 3min ； 然后将模板与 混匀好的其它试剂混合， 即为完整的 LAMP 反应体系。 0083 L。

38、AMP 反应程序 ： 65 1 小时， 80 5 分钟， 4保存。 0084 将反应液进行 1.5琼脂糖凝胶电泳。结果表明 ： 以 NDM-1 基因为模板， 反应后反 应液电泳显示 LAMP 扩增特异带型 ( 连续的梯状条带 ) ； 空白对照中， 反应后反应液未显示 有扩增条带。 0085 进行三次重复实验， 结果一致。 0086 实施例 3、 专用引物的灵敏性测定 0087 一、 制备模板 0088 合成序列表的序列 11 所示的 NDM-1 基因， 进行梯度稀释后作为模板。模板的浓度 分别如下 ： 2.910-6ng/l、 2.910-7ng/l、 2.910-8ng/l。 0089 二、。

39、 电泳检测的灵敏度 0090 分别采用步骤一合成的模板进行 LAMP( 环介导恒温扩增 )， LAMP 反应体系见表 3。 0091 以 2L 双蒸水作为模板的空白对照， 以 2L 肺炎克雷伯氏菌的基因组 DNA(82.8ng/l) 为阴性对照 1， 以 2L 大肠埃希氏菌的基因组 DNA(52.4ng/l) 为阴性 对照 2。 0092 将表 3 中除模板以外的试剂混匀备用 ； 将模板在 96预变性 3min ； 然后将模板与 混匀好的其它试剂混合， 即为完整的 LAMP 反应体系。 0093 LAMP 反应程序 ： 65 1 小时， 80 5 分钟， 4保存。 说 明 书 CN 10218。

40、1558 A CN 102181561 A8/9 页 11 0094 反应结束后取反应液进行 1.5琼脂糖凝胶电泳。结果见图 2( 泳道 1 为浓度为 2.910-6ng/l 的 NDM-1 基因作为模板， 泳道 2 为浓度为 2.910-7ng/l 的 NDM-1 基因 作为模板， 泳道 3 为浓度为 2.910-8ng/l 的 NDM-1 基因作为模板， 泳道 4 为阴性对照 1 作为模板 )。阴性对照 1 不显示 LAMP 扩增特异带型 ( 连续的梯状条带 )， NDM-1 基因作为 模板反应后的反应液均显示 LAMP 扩增特异带型 ( 连续的梯状条带 )， NDM-1 基因的最低检 测。

41、灵敏度为 2.910-8ng/l(60copies/ 反应 )。 0095 进行三次重复实验， 结果一致。 0096 实施例 4、 专用引物的特异性测定 0097 一、 序列比对分析 0098 将 NDM-1 基因在 NCBI 中进行 BLAST 比对分析， 未发现与其有同源性很高的序列。 0099 其中同源性较高的序列 (gb|CP000157.1， HTCC2594， 全基因组长度为 3052398bp， 部分序列见序列表的序列9， 编码序列表的序列10所示的蛋白)与NDM-1基因序列的BLAST 比对 (Query Coverage 72， Max ident 67 ) 见图 3。 01。

42、00 二、 特异性测定 0101 分别将如下材料作为模板进行进行 LAMP( 环介导恒温扩增 )， LAMP 反应体系见 表 3 ： 序列表的序列 11 所示的 NDM-1 基因 ( 浓度为 2.9ng/l)、 大肠杆菌 DH5 的基因组 DNA(浓度为52.4ng/l)、 金黄色葡萄球菌ATCC25923的基因组DNA(浓度为20.6ng/l)、 肺炎克雷伯氏菌 EL-2 株的基因组 DNA( 浓度为 82.8ng/l)、 肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae)R6的基因组DNA(浓度为0.8ng/l)、 肠道菌群元基因组DNA(浓度为46.6ng/ l)、 土壤菌。

43、群元基因组 DNA( 浓度为 4.1ng/l)。以 2L 双蒸水作为模板的空白对照。 0102 将表 3 中除模板以外的试剂混匀备用 ； 将模板在 96预变性 3min ； 然后将模板与 混匀好的其它试剂混合， 即为完整的 LAMP 反应体系。 0103 LAMP 反应程序 ： 65 1 小时， 80 5 分钟， 4保存。 0104 反应结束后取反应液进行1.5琼脂糖凝胶电泳。 结果表明， 只有NDM-1基因作模 板电泳显示连续梯状条带， 为阳性结果， 其它模板均显示阴性结果。 0105 进行三次重复实验， 结果一致。 0106 对比例、 0107 合成序列表的序列 11 所示的 NDM-1 。

44、基因， 进行梯度稀释后作为模板。取 (2.910-1ng/l 到 2.910-9ng/l)9 个不同梯度的模板。 0108 上游引物 ： 5 -TGGACCGATGACCAGACCG-3 ； 0109 下游引物 ： 5 -GATCAGGCAGCCACCAAAA-3 。 0110 PCR反应体系 ： 10M上游引物1l、 10M下游引物1l、 2.5mM dNTPs 2l、 5U/ l TaKaRa EX HS酶0.125l、 10buffer 2.5l、 模板2l、 双蒸水定容至25l体系。 以 2L 双蒸水作为模板的空白对照。 0111 PCR 反应条件 ： 预变性 94 5min、 循环 。

45、94 1min、 58 1min、 72 1min30s、 30 个 循环后、 72延伸 10min。 0112 结 果 见 图 4( 泳 道 1 为 浓 度 为 2.910-1ng/l 的 模 板， 泳 道 2 为 浓 度 为 2.910-2ng/l 的 模 板， 泳 道 3 为 浓 度 为 2.910-3ng/l 的 模 板， 泳 道 4 为 浓 度 为 2.910-4ng/l 的模板， 泳道 5 为浓度为 2.910-5ng/l 的模板， 泳道 6 为浓度 说 明 书 CN 102181558 A CN 102181561 A9/9 页 12 为 2.910-6ng/l 的模板， 泳道 。

46、7 为浓度为 2.910-7ng/l 的模板， 泳道 8 为浓度为 2.910-8ng/l 的模板， 泳道 9 为浓度为 2.910-9ng/l 的模板， 泳道 10 为阴性对照 )。 靶序列为 353bp。PCR 方法的检测灵敏度为 2.910-6(6103copies/ 反应 )， 比实施例 3 的 方法低两个数量级。 说 明 书 CN 102181558 A CN 102181561 A1/8 页 13 0001 序 列 表 CN 102181558 A CN 102181561 A2/8 页 14 0002 0003 序 列 表 CN 102181558 A CN 102181561 。

47、A3/8 页 15 0004 序 列 表 CN 102181558 A CN 102181561 A4/8 页 16 0005 序 列 表 CN 102181558 A CN 102181561 A5/8 页 17 0006 序 列 表 CN 102181558 A CN 102181561 A6/8 页 18 0007 序 列 表 CN 102181558 A CN 102181561 A7/8 页 19 0008 序 列 表 CN 102181558 A CN 102181561 A8/8 页 20 序 列 表 CN 102181558 A CN 102181561 A1/3 页 21 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102181558 A CN 102181561 A2/3 页 22 图 3 说 明 书 附 图 CN 102181558 A CN 102181561 A3/3 页 23 图 4 说 明 书 附 图 CN 102181558 A 。