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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510357985.8 (22)申请日 2015.06.25 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105037503 A (43)申请公布日 2015.11.11 (73)专利权人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路88号 (72)发明人 叶建强田晓彦施洋洋邵红霞 秦爱建谢泉夏驰超周晓祥 范中雷 (74)专利代理机构 南京钟山专利代理有限公司 32252 代理人 戴朝荣 (51)Int.Cl. C07K 14/01(2006.01) C12N 1。
2、5/70(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (56)对比文件 Eliana Ottati Nogueira-Dantas等 .Cloning and expression of chicken anemia virus VP3 protein in Escherichia coli. Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases .2007, 傅文斌， 等.凋亡蛋白质的原核表达与纯化. 食品与药品 .2008, 曲栗， 等.利用SUMO表达系统高效可溶性表 达鸡。
3、传染性法氏囊病病毒VP3基因. 中国预防兽 医学报 .2011, 审查员 杨振宇 (54)发明名称 一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其制 备方法 (57)摘要 本发明公开了一种AGV2型环形病毒VP3可溶 性蛋白及其制备方法。 是利用pGEX-6p-1线性化 载体以及AGV2病毒VP3基因片段的引物， 利用重 组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应， 直接在体 外快速重组克隆VP3， 转化大肠杆菌， 经IPTG诱导 表达、 实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表 达， 并获得纯化的VP3可溶性蛋白。 本发明获得的 AGV2病毒VP3可溶性表达及纯化的蛋白， 可直接 提供VP3。
4、可容性蛋白作为AGV2诊断抗原； 作为免 疫原获得抗VP3多克隆抗体； 为开展AGV2血清学 流行病学调查及VP3功能研究提供有效免疫学试 剂， 填补国内外空白； 并为进一步探究VP3生物学 功能具有重要意义。 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 CN 105037503 B 2016.12.21 CN 105037503 B 1.一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白， 其特征在于， 利用pGEX-6p-1线性化载体以及 AGV2病毒VP3基因片段的引物， 利用重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应， 直接在体外快 速重组克隆VP3， 转化大肠杆菌， 经IPTG诱导表达、。
5、 实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性 表达， 并获得纯化的VP3可溶性蛋白： 所述pGEX-6p-1线性化载体是利用下述引物， 以pGEX- 6p-1质粒为模板， PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体； 上游引物： 5 -TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3 ； 下游引物： 5 -CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3 ； 所述AGV2病毒VP3基因片段是利用下述引物， 以pcAGV2-VP1-3质粒为模板， PCR扩增出 VP3基因片段； 上游引物： 5 -GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3 ；。
6、 下游引物： 5 -GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3 。 2.一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)利用下述引物， 以pGEX-6p-1质粒为模板， PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体； 上 游引物： 5 -TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3 ； 下游引物： 5 -CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3 ； 。 2)利用下述引物， 以pcAGV2-VP1-3质粒为模板， PCR扩增出VP3基因； 上游引物： 5 -GTTCCAGGGGCCCATGCAGA。
7、CCCCCCGCTC-3 ； 下游引物： 5 -GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3 ； 3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物在体外进行快速重组克隆 VP3， 阳性克隆经IPTG诱导表达， 实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达， 并获得纯化 的VP3可溶性蛋白。 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， PCR扩增反应体系为： 40 l水， 5 l10倍缓冲液， 1 l 10mM dNTP， 1 l10 mol上游引物， 1 l 10 mol下游引物,1 l10ng/ l的pGEX-6p-1质粒或pcAGV2-VP。
8、1-3质粒， 1 l商品化的Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶。 4.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， PCR扩增反应循环参数为： 95变性3 分钟,随后进行30个循环， 所述循环为95变性10秒,57退火30秒， 72延伸3分钟； 最后 72延伸10分钟。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105037503 B 2 一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种可溶性蛋白， 具体涉及一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其 制备方法。 背景技术 0002 鸡的传染性贫血病毒(CAV)一直被认为是环形病毒属中唯一成员。
9、。 直到2011年， Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列， 即环形病毒属中第二个成 员， 命名为AGV2。 同年， Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个新型人源环形病 毒HGyV序列。 序列分析惊人发现， HGyV与AGV2的基因组序列同源性高达96。 最近， Maggi以 及Biagini等人在健康人， 器官移植病人以及HIV阳性病人血清样品中也检测到HGyV/AGV2 的DNA序列。 在国内， 叶建强等检测并首次报道了活禽市场鸡群及人血样中AGV2的存在。 这 些表明AGV2具有潜在的公共卫生意义。 然而目前所有的国内外对AGV2的检测均依赖于对 。
10、AGV2的病毒基因组DNA的PCR扩增， 目前尚无检测AGV2蛋白抗原及其抗体的血清学方法。 对 该病毒的组织嗜性、 病毒蛋白表达及感染宿主中AGV2抗体水平等尚无报道。 0003 因此， 对AGV2病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆， 构建VP3表达载体， 实现 可溶性表达， 将为深入开展AGV2抗原及其抗体检测、 血清学调查， 明确AGV2在鸡群以及人群 中的感染复制情况提供有效诊断试剂； 并为探究VP3生物学功能具有重要意义。 在传统表达 载体的构建中， 往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点， 通过酶切、 连接的方法构建载 体， 实现外源基因的表达。 但有时由于找不到合适的酶切位点。
11、， 往往导致克隆过程繁琐， 效 率低下。 发明内容 0004 本发明的目的是在于提供一种AGV2型环形病毒VP3蛋白及其制备方法。 0005 本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX-6p-1线性化载体以 及AGV2病毒VP3基因片段的引物， 利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应， 直 接在体外快速重组克隆VP3， 转化大肠杆菌， 经IPTG诱导表达、 实现AGV2的VP3蛋白与GST的 融合可溶性表达， 并获得纯化的VP3融合蛋白。 0006 实现本发明的技术方案是： 0007 一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白， 利用pGEX-6p-1线性化载体以及。
12、AGV2病毒 VP3基因片段的引物， 利用重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应， 直接在体外快速重组克 隆VP3， 转化大肠杆菌， 经IPTG诱导表达、 实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达， 并获 得纯化的VP3可溶性蛋白。 0008 进一步， 所述pGEX-6p-1线性化载体是利用下述引物， 以pGEX-6p-1质粒为模板， PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体； 0009 上游引物： 5 -TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3 ； 0010 下游引物： 5 -CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3 。 说明书 。
13、1/4 页 3 CN 105037503 B 3 0011 进一步， 所述AGV2病毒VP3基因片段是利用下述引物， 以pcAGV2-VP1-3质粒为模 板， PCR扩增出VP3基因片段； 0012 上游引物： 5 -GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3 ； 0013 下游引物： 5 -GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3 。 0014 本发明还提供了上述AGV2型环形病毒VP3蛋白的制备方法， 具体包括以下步骤： 0015 1)利用下述引物， 以pGEX-6p-1质粒为模板， PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载 体； 0016 。
14、上游引物： 5 -TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3 ； 0017 下游引物： 5 -CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3 ； 。 0018 2)利用下述引物， 以pcAGV2-VP1-3质粒为模板， PCR扩增出VP3基因； 0019 上游引物： 5 -GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3 ； 0020 下游引物： 5 -GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGCTTTT-3 。 0021 3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物在体外进行快速重组克 隆VP3， 阳性克隆经。
15、IPTG诱导表达， 实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达， 并获得纯 化的VP3可溶性蛋白。 0022 本发明所述的AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白可作为AGV2诊断抗原； 以及作为免 疫原获得抗VP3多克隆抗体。 0023 本发明与现有技术相比， 其显著优点是： 0024 1、 本发明中将利用不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTM II体外 重组技术克隆AGV2病毒VP3基因， 简化克隆过程， 实现VP3基因快速克隆表达。 0025 2、 本发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTM II的克隆方法， 可快速构建AGV2病 毒VP3基因的原核可溶性表达载体。 0。
16、026 3、 本发明获得的AGV2病毒VP3可溶性表达及纯化的蛋白， 可直接提供VP3可容性蛋 白作为AGV2诊断抗原； 作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体； 为开展AGV2血清学流行病学调查 及VP3功能研究提供有效免疫学试剂， 填补国内外空白； 并为进一步探究VP3生物学功能具 有重要意义。 附图说明 0027 图1是本发明AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法流程图。 0028 图2本发明PCR扩增产物的电泳分析图(泳道M表示对照品DNAMarker的电泳分析 图， 泳道1、 2分别代表线性化载体pGEX-6p-1以及AGV2病毒VP3片段PCR扩增产物的电泳分析 图)。 0029 。
17、图3是本发明AGV2病毒VP3基因的可溶性表达鉴定图(A是SDS-PAGE分析VP3蛋白的 可溶性表达： 泳道1、 2、 3分别代表IPTG诱导的VP3超声裂解样品上清， 纯化后蛋白及超声裂 解样品沉淀； 泳道M为预染的蛋白分子量； B为抗GST单抗分析VP3蛋白表达： 泳道1为IPTG诱 导的VP3超声裂解样品； 泳道2为IPTG诱导的GST超声裂解样品)。 0030 图4是本发明间接免疫荧光鉴定抗VP3蛋白多克隆抗体图(A为转染pcAGV2-VP1-3 的293T细胞的间接免疫荧光结果； B为转染pcDNA3.1载体的293T细胞的间接免疫荧光结 果)。 说明书 2/4 页 4 CN 10。
18、5037503 B 4 具体实施方式 0031 为更好的理解本发明的内容， 以下实施方式结合附图给出了AGV2新型环形病毒 VP3可溶性蛋白制备的示例。 0032 实施例1 0033 1)设计扩增pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段引物： 扩增pGEX-6p- 1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1022-1047位； 且在5 端带有额外TAA碱基； 扩增 pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-941位； 且在5 端带有额外CAT碱 基。 扩增AGV2病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基， 且在5 端。
19、带 有15个与pGEX-6p-1线性化载体下游引物反向互补的额外碱基； 扩增AGV2病毒VP3基因下游 引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基， 且在5 端带有15个与pGEX-6p-1线性化载 体上游引物反向互补的额外碱基。 具体引物序列见附表1。 0034 2)pGEX-6p-1线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段PCR扩增： 以pGEX-6p-1质粒以 及pcAGV2-VP1-3质粒为模版， 表1所述引物为引物进行PCR扩增。 如图1中的步骤1。 PCR扩增 反应体系为： 40 l水， 5 l 10倍缓冲液， 1 l10mM dNTP， 1 l 10 mol上游引物， 1 。
20、l 10 mol下 游引物,1 l 10ng/ l的pGEX-6p-1质粒或pcAGV2-VP1-3质粒， 1 l商品化的Phanta Super- Fidelity DNA聚合酶。 PCR扩增反应循环参数为： 95变性3分钟,随后进行30个循环(95 变性10秒,57退火30秒， 72延伸3分钟),最后72延伸10分钟。 PCR结束后， PCR产物在 1的琼脂糖凝胶中进行电泳。 如图2所示， 其中泳道M表示对照品DNAMarker的电泳分析图， 其中泳道1、 2分别代表线性化载体pGEX-6p-1以及AGV2病毒VP3片段PCR扩增产物的电泳分 析图。 0035 3)AGV2病毒VP3片段快。
21、速克隆进pGEX-6p-1载体： 将以上纯化的表达线性化载体 pGEX-6p-1以及AGV2病毒VP3片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM II的作用下进行重组 克隆。 如图1中的步骤2。 具体重组反应体系如下： 纯化的AGV2病毒VP3片段产物50-100ng， 纯 化的pGEX-6p-1表达线性化载体50ng， 2 l商品化的ExnaseTM II酶， 4 l 5倍的缓冲液， 其它 补加水至20 l。 反应物于37作用30分钟后， 置冰上5分钟。 随后将20 l反应物转化到常规 感受态细菌， 涂LB板。 次日挑取细菌克隆进行质粒制备， 阳性克隆鉴定。 0036 4)AGV2病毒VP。
22、3可溶性蛋白诱导表达及其纯化:将获得的含AGV2病毒VP3基因的阳 性克隆(命名为pGEX-VP3)转化BL21细菌， 按1:100转接种到含有AMP+的LB培养基中， 摇菌3h 后， 加入IPTG(1mmol/ml)诱导5h后收集细菌， 进行超声40hz， 40min破碎。 将超声破碎样品离 心1000r/min,10min后,将超声破碎样品离心后分上清与沉淀进行SDS-PAGE(5的浓缩胶， 10的分离胶)以及Western blot分析(以抗鼠源的GST单抗为一抗， 羊抗鼠HRP标记的IgG 为二抗)鉴定表达及其可溶性。 在图3A中， 我们VP3蛋白可在超声破碎样品上清中以可溶性 形式存。
23、在。 Western blot分析(图3B)则进一步证明了VP3融合蛋白的表达。 在确定VP3的可 溶性表达基础上， 将超声破碎样品上清通过GST纯化柱进行了VP3蛋白的纯化。 图3A中泳道2 是VP3蛋白纯化后SDS-PAGE分析结果， 蛋白浓度测定发现纯化后的蛋白浓度为1.0mg/ml。 0037 为进一步测定纯化后蛋白的抗原性， 评价其能否作为免疫原及诊断用抗原， 将纯 化的VP3蛋白免疫小鼠， 并通过间接免疫荧光以及ELISA方法测定小鼠血清中抗VP3抗体水 平。 以转染pcAGV2-VP1-3质粒的293T细胞为抗原进行的间接免疫荧光试验发现， 二免疫后 说明书 3/4 页 5 CN。
24、 105037503 B 5 小鼠就能产生针对VP3蛋白的特异性抗体(图4A)。 以纯化的VP3蛋白作为包被抗原进行的 ELISA实验发现， 二免疫后小鼠血清抗VP3抗体效价达1万以上。 这些结果表明本发明表达的 VP3蛋白具有很好的反应性及免疫原性， 在AGV2血清学诊断中将具有良好的应用前景。 0038 表1 扩增pGEX-6p-1线性化载体和AGV2病毒VP3片段引物设计PCR产物 0039 说明书 4/4 页 6 CN 105037503 B 6 0001 序列表 1/2 页 7 CN 105037503 B 7 0002 序列表 2/2 页 8 CN 105037503 B 8 图1 图2 说明书附图 1/2 页 9 CN 105037503 B 9 图3 图4 说明书附图 2/2 页 10 CN 105037503 B 10 。