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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710696599.0 (22)申请日 2017.08.15 (71)申请人 湖北麦克森生物技术有限公司 地址 437000 湖北省咸宁市咸安区温泉开 发区工业园 (72)发明人 陈飞王少敏吴华兰徐斌 陈路斌 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 徐绍新 (51)Int.Cl. C12P 21/00(2006.01) A61K 38/01(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A23L 33/18(2016.01) C1。
2、2R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种纳豆多肽的制备方法及其在制备降血 脂药物中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种纳豆多肽的制备方法， 包 括大豆皮清洗除杂、 浸泡， 沥干、 配料、 灭菌、 接 种、 固态发酵、 加水打浆、 二次液态发酵、 活性炭 吸附、 超滤纯化、 调pH、 纳滤浓缩和喷雾干燥等工 序。 本发明在未使用外源性蛋白酶的条件下， 通 过固态和液态二步发酵， 通过分步控制发酵条件 调节菌体发酵代谢流， 积累了高活性的纳豆多 肽， 并通过多步纯化工艺制备了高纯度的纳豆多 肽产品。 药效试验结果表明， 本发明制备的纳豆 多肽具有较好的降低血脂的功效， 而且无任何。
3、毒 副作用， 可广泛应用于药物和保健食品中。 权利要求书1页 说明书5页 CN 107384995 A 2017.11.24 CN 107384995 A 1.一种纳豆多肽的制备方法， 其特征在于包括以下步骤： (1)将大豆皮清洗除杂， 加水浸泡3-8h， 沥干后按大豆皮重量的2-10加入大豆蛋白 粉， 搅拌均匀后热压灭菌， 冷却后再按大豆皮重量的0.2-1接种纳豆芽孢杆菌种子液， 在 温度35-40、 湿度60-90的条件下固态发酵20-50h； (2)向固态发酵后的物料中按大豆皮重量的5-20倍加水进行打浆， 随后将打浆液转入 液态发酵罐中， 按大豆皮重量加入0.5-2的蔗糖、 0.6-6。
4、的氨基酸， 控制温度35-40、 转 速100-300r/min、 通气量1-2.5VVM， 液态发酵3-6h后再向发酵罐中一次性补加占大豆皮重 量0.1-1的氯化钙， 保持发酵条件不变， 继续发酵5-10h； (3)将发酵液的pH调至3-5， 加入占发酵液重量0.2-1的活性炭， 40-60搅拌0.5-2h 后进行离心， 取上清液进行超滤， 滤液调pH至6-8， 再进行纳滤， 将滤液喷雾干燥， 即得成品。 2.如权利要求1所述的纳豆多肽制备方法， 其特征在于： 所述热压灭菌的温度为115- 121。 3.如权利要求1所述的纳豆多肽制备方法， 其特征在于： 所述纳豆芽孢杆菌种子液的有 效活菌数。
5、为107-109cfu/ml。 4.如权利要求1所述的纳豆多肽制备方法， 其特征在于： 所述氨基酸为脯氨酸和酪氨 酸， 二者为任意比例。 5.如权利要求1所述的纳豆多肽制备方法， 其特征在于： 所述超滤采用的是截留分子量 为4000-8000Dal的陶瓷膜。 6.如权利要求1所述的纳豆多肽制备方法， 其特征在于： 所述纳滤采用的是截留分子量 为100-500Dal的有机膜。 7.纳豆多肽在制备降血脂药物或保健食品中的应用， 其特征在于： 所述纳豆多肽按权 利要求1-6任何一项所述的方法制备。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107384995 A 2 一种纳豆多肽的制备方法及其在制备降血脂药。
6、物中的应用 技术领域 0001 本发明涉及纳豆多肽的制备方法及其在制备降血脂药物中的应用。 背景技术 0002 纳豆是日本的一种传统食品， 在日本有1000年以上的食用历史， 将大豆煮熟后接 入纳豆菌(Bacillus subtilis natto)发酵后即可得到。 纳豆含有众多生理活性物质， 如纳 豆激酶、 纳豆多肽、 -聚谷氨酸、 纳豆芽孢杆菌等。 这些成分有众多的生理活性， 如溶血栓、 降血压、 改善动脉粥样硬化、 降血脂、 抗癌、 调节肠胃、 补钙等。 0003 自1980发现纳豆中的纳豆激酶具有溶栓作用以来， 世界范围内的科研人员对纳豆 进行了全方位的研究。 研究发现， 常吃纳豆的人。
7、群血脂能得到有效控制， 但中国台湾的 Nae-Cherng Yang博士对纳豆激酶进行的人体实验却发现， 服用纳豆激酶6个月对血脂没有 影响， 说明纳豆中降血脂的成分并不是纳豆激酶， 而是其它成分。 0004 纳豆多肽是纳豆芽孢杆菌在发酵过程中代谢产生的一类多肽物质， 与其它传统采 用酶制剂制备的食源性多肽相比， 最大的区别就是纳豆多肽是纳豆芽孢杆菌发酵分泌的肽 类物质， 纳豆中具有降血脂作用的活性物质可能就是纳豆多肽。 0005 传统工艺生产的纳豆中就含有纳豆多肽， 其含量在5-6。 CN1545910A公开了一种 纳豆多肽含量和纳豆激酶活性均比较高的纳豆多肽营养粉， 采用木瓜蛋白酶和菠萝蛋。
8、白酶 对纳豆进行多肽化， 制备的纳豆多肽营养粉中纳豆多肽含量15， 其含量总体偏低。 所以 目前纳豆多肽的制备技术还处于起步阶段， 特别是在生产过程中不添加外源性的酶制剂， 仅依靠纳豆芽孢杆菌发酵代谢产生的高含量、 高活性的纳豆多肽生产技术， 在国内外都没 有取得突破性的进展。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种纳豆多肽的制备方法， 该方法结合了固态发酵、 液态发 酵、 脱色脱味、 膜分离等先进工艺， 制备的纳豆多肽不仅纯度高、 分子量大小均匀， 而且还具 有较好的降血脂作用。 0007 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 0008 一种纳豆多肽的制备方法， 包括以下步骤： 000。
9、9 (1)将大豆皮清洗除杂， 加水浸泡3-8h， 沥干后按大豆皮重量的2-10加入大豆蛋 白粉， 搅拌均匀后热压灭菌， 冷却后再按大豆皮重量的0.2-1接种纳豆芽孢杆菌种子液， 在温度35-40、 湿度60-90的条件下固态发酵20-50h； 0010 (2)向固态发酵后的物料中按大豆皮重量的5-20倍加水进行打浆， 随后将打浆液 转入液态发酵罐中， 按大豆皮重量加入0.5-2的蔗糖、 0.6-6的氨基酸， 控制温度35-40 、 转速100-300r/min、 通气量1-2.5VVM， 液态发酵3-6h后再向发酵罐中一次性补加占大豆 皮重量0.1-1的氯化钙， 保持发酵条件不变， 继续发酵5。
10、-10h； 0011 (3)将发酵液的pH调至3-5， 加入占发酵液重量0.2-1的活性炭， 40-60搅拌 说明书 1/5 页 3 CN 107384995 A 3 0.5-2h后进行离心， 取上清液进行超滤， 滤液调pH至6-8， 再进行纳滤， 将滤液喷雾干燥， 即 得成品。 0012 作为优选方案， 所述热压灭菌的温度为115-121。 0013 作为优选方案， 所述纳豆芽孢杆菌种子液的有效活菌数为107-109cfu/ml。 0014 作为优选方案， 所述氨基酸为脯氨酸和酪氨酸， 二者为任意比例。 0015 作为优选方案， 所述超滤采用的是截留分子量为4000-8000Dal的陶瓷膜。。
11、 0016 作为优选方案， 所述纳滤采用的是截留分子量为100-500Dal的有机膜。 0017 作为最佳方案， 本发明提供的制备方法包括以下步骤： 0018 (1)将大豆皮清洗除杂， 加水浸泡5h， 沥干后按大豆皮重量的5加入大豆蛋白粉， 搅拌均匀后热压灭菌， 冷却后再按大豆皮重量的0.5接种纳豆芽孢杆菌种子液(有效活菌 数为108cfu/ml)， 在温度37、 湿度80的条件下固态发酵36h； 0019 (2)向固态发酵后的物料中按大豆皮重量的10倍加水进行打浆， 随后将打浆液转 入液态发酵罐中， 按大豆皮重量加入1的蔗糖、 0.45的脯氨酸和0.5的酪氨酸， 控制温 度37、 转速200。
12、r/min、 通气量1.5VVM， 液态发酵4h后再向发酵罐中一次性补加占大豆皮重 量0.45的氯化钙， 保持发酵条件不变， 继续发酵6h； 0020 (3)将发酵液的pH调至4.5， 加入占发酵液重量0.5的活性炭， 50搅拌1h后进行 离心， 取上清液用截留分子量为5000Dal的陶瓷膜进行超滤， 滤液调pH至7， 再用截留分子量 为300Dal的有机膜纳滤至料液含固量为25， 将浓缩液喷雾干燥， 即得成品。 0021 本发明以大豆皮和大豆蛋白粉为原料， 采用固态和液态二步发酵法， 分步控制发 酵条件， 并且在未添加外源性的蛋白酶的条件下， 通过调节菌体发酵流， 积累了高含量、 高 活性的。
13、纳豆多肽， 本发明制备的产品中， 纳豆多肽含量在80以上， 且分子量介于 500- 5000Dal的多肽占多肽总量的90以上， 药效试验结果表明， 本发明制备的纳豆多肽能降低 高胆固醇血症大鼠模型的体重； 降低高胆固醇血症大鼠模型的TC、 TG、 LDL-C 水平， 升高 HDL-C水平， 因此具有较好的降低血脂的功效， 同时无任何毒副作用。 具体实施方式 0022 以下通过实施例形式对本发明降血脂纳豆多肽及其制备方法再作进一步的详细 说明， 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例， 凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的保护范围。 0023 实施例1 0024 (1。
14、)将大豆皮清洗除杂， 按重量加入5倍水浸泡8h， 沥干后按大豆皮重量的2加入 大豆蛋白粉， 搅拌均匀后115热压灭菌30min， 冷却后再按大豆皮重量的0.2接种纳豆芽 孢杆菌种子液(有效活菌数为109cfu/ml)， 在温度35、 湿度60的条件下固态发酵50h； 0025 (2)向固态发酵后的物料中按大豆皮重量的20倍加水进行打浆， 随后将打浆液转 入液态发酵罐中， 按大豆皮重量加入2的蔗糖、 3的脯氨酸和3的酪氨酸， 控制温度35 、 转速300r/min、 通气量2.5VVM， 液态发酵6h后再向发酵罐中一次性补加占大豆皮重量 1的氯化钙， 保持发酵条件不变， 继续发酵10h； 002。
15、6 (3)将发酵液的pH调至3， 加入占发酵液重量1的活性炭， 60搅拌0.5h后进行离 心， 取上清液用截留分子量为4000Dal的陶瓷膜进行超滤， 滤液调pH至6， 再用截留分子量为 说明书 2/5 页 4 CN 107384995 A 4 500Dal的有机膜进行纳滤， 滤液喷雾干燥， 即得成品。 0027 成品中， 纳豆多肽含量为81.2， 其中分子量介于500-5000Dal的多肽占多肽总量 的90.5。 0028 实施例2 0029 (1)将大豆皮清洗除杂， 按重量加入15倍水浸泡3h， 沥干后按大豆皮重量的10加 入大豆蛋白粉， 搅拌均匀后121热压灭菌30min， 冷却后再按大。
16、豆皮重量的1接种纳豆芽 孢杆菌种子液(有效活菌数为107cfu/ml)， 在温度40、 湿度90的条件下固态发酵20h； 0030 (2)向固态发酵后的物料中按大豆皮重量的5倍加水进行打浆， 随后将打浆液转入 液态发酵罐中， 按大豆皮重量加入0.5的蔗糖、 0.3的脯氨酸和0.3的酪氨酸， 控制温 度40、 转速100r/min、 通气量1VVM， 液态发酵3h后再向发酵罐中一次性补加占大豆皮重量 0.1的氯化钙， 保持发酵条件不变， 继续发酵5h； 0031 (3)将发酵液的pH调至5， 加入占发酵液重量0.2的活性炭， 40搅拌2h后进行离 心， 取上清液用截留分子量为8000Dal的陶瓷。
17、膜进行超滤， 滤液调pH至8， 再用截留分子量为 100Dal的有机膜进行纳滤， 滤液喷雾干燥， 即得成品。 0032 成品中， 纳豆多肽含量为80.8， 其中分子量介于500-5000Dal的多肽占多肽总量 的91.3。 0033 实施例3 0034 (1)将1Kg大豆皮清洗除杂， 加入10Kg水浸泡5h， 沥干后加入50g大豆蛋白粉， 搅拌 均匀后121热压灭菌30min， 冷却后再接种5g纳豆芽孢杆菌种子液(含有效活菌数为 108cfu/ml)， 在温度37、 湿度80的条件下固态发酵36h； 0035 (2)向固态发酵后的物料中加10Kg水进行打浆， 随后将打浆液转入液态发酵罐中， 加。
18、入10g蔗糖、 4.5g脯氨酸和5g酪氨酸， 控制温度37、 转速200r/min、 通气量1.5VVM， 液态 发酵4h后再向发酵罐中一次性补加4.5g氯化钙， 保持发酵条件不变， 继续发酵6h； 0036 (3)用稀盐酸将发酵液的pH调至4.5， 加入占发酵液重量0.5的活性炭， 50搅拌 1h后进行离心， 取上清液用截留分子量为5000Dal的陶瓷膜进行超滤， 滤液调pH至 7， 再用 截留分子量为300Dal的有机膜纳滤至滤液含固量为25(重量)， 将滤液喷雾干燥， 即得成 品。 0037 成品中， 纳豆多肽含量为84.6， 其中分子量介于500-5000Dal的多肽占多肽总量 的93。
19、.8。 0038 实施例4 0039 (1)将大豆皮清洗除杂， 按重量加入8倍水浸泡6h， 沥干后按大豆皮重量的6加入 大豆蛋白粉， 搅拌均匀后115热压灭菌30min， 冷却后再按大豆皮重量的0.7接种纳豆芽 孢杆菌种子液(含有效活菌数为108cfu/ml)， 在温度37、 湿度70的条件下固态发酵48h； 0040 (2)向固态发酵后的物料中按大豆皮重量的15倍加水进行打浆， 随后将打浆液转 入液态发酵罐中， 按大豆皮重量加入0.8的蔗糖、 2的脯氨酸和1的酪氨酸， 控制温度 37、 转速300r/min、 通气量2VVM， 液态发酵5h后再向发酵罐中一次性补加占大豆皮重量 0.6的氯化钙。
20、， 保持发酵条件不变， 继续发酵8h； 0041 (3)将发酵液的pH调至4， 加入占发酵液重量0.6的活性炭， 50搅拌1h后进行离 心， 取上清液用截留分子量为5000Dal的陶瓷膜进行超滤， 滤液调pH至7.5， 再用截留分子量 说明书 3/5 页 5 CN 107384995 A 5 为300Dal的有机膜纳滤至滤液含固量为20， 滤液喷雾干燥， 即得成品。 0042 成品中， 纳豆多肽含量为82.7， 其中分子量介于500-5000Dal的多肽占多肽总量 的91.7。 0043 实施例5纳豆多肽降血脂功能验证 0044 受试动物： 清洁级Wistar大鼠， 体重170-190g， 雄。
21、性， 共计60只。 0045 大鼠高胆固醇模型的建立、 分组及给药： 制作高胆固醇血症大鼠模型时所用的高 脂饲料组成为:20.0蔗糖、 15猪油、 1.2胆固醇、 0.2胆酸钠和63.6的普通饲料。 0046 将实验动物适应性饲养一周后， 按体重随机分成2组， 10只动物给予维持饲料作为 空白对照组， 50只给予模型饲料作为模型对照组， 模型对照组给予模型饲料2周， 每周称量 体重1次， 空白对照组和模型对照组动物不禁食尾部取血， 测定血清总胆固醇(TC)、 总甘油 三酯(TG)、 低密度脂蛋白(LDL-C)、 高密度脂蛋白(HDL-C)水平。 根据TC 水平将模型对照组 随机分成5组， 分组。
22、后空白对照组和模型对照组比较TC、 TG、 LDL-C、 HDL-C差异均无显著性 (P0.05)。 0047 实验组分别是实施例1组、 实施例2组、 实施例3组、 实施例4组、 四个实施例组每天 经口给予受试样品500mg/kg剂量1mL， 空白对照组和模型对照组同时给予同体积的相应溶 剂， 连续给药4周。 空白对照组继续给予维持饲料， 模型对照组及四个实施例组继续给予模 型饲料， 并定期称量体重， 于实验结束时不禁食采血， 采血后尽快分离血清， 测定血清TC、 TG、 LDL-C、 HDL-C水平。 0048 表1建模两周后高脂组与对照组大鼠血脂情况 0049 组别 动物数(只) TC(m。
23、mol/L) TG(mmol/L) HDL-C(mmol/L) LDL-C(mmol/L) 高脂组 60 4.591.05 2.080.37 1.490.41 2.680.54 对照组 10 1.620.14 0.970.25 1.770.15 1.130.19 0050 60只实验大鼠经过2周高胆固醇血症的诱导后， 血清总胆固醇(TC)、 甘油三酯 (TG)、 低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)升高， 明显高于对照组， 因此判定建模成功。 0051 表2受试物对大鼠体重的影响 0052 0053 0054 表2结果显示， 正常对照组、 实施例1组、 实施例2组、 实施例3组、 实施例4组试验结。
24、 束时大鼠体重明显低于高胆固醇对照组； 四个实施例组试验结束时大鼠体重与空白对照组 说明书 4/5 页 6 CN 107384995 A 6 体重接近， 未达到显著水平。 0055 表3受试物对大鼠血清TC、 TG、 LDL-C、 HDL-C含量的影响 0056 0057 表3结果显示， 四个实施例组试验后大鼠血清TC、 TG、 LDL-C明显低于高胆固醇对照 组； 四个实施例组HDL-C明显高于高胆固醇对照组， 因此可以判定四个实施例样品具有降低 动物血脂的功能。 0058 实施例6纳豆多肽的毒性试验研究 0059 取实施例1-4制备的纳豆多肽， 按照 保健食品检验与评价技术规范 ， 以昆明小鼠 为实验动物， 雌雄各半， 采用最大灌胃量法(MTD)进行实验， 剂量设计为10.0g/kg.bw， 24h 内灌胃3次， 连续观察两周， 五个实施例组小鼠均无死亡， 毛色光泽， 体重有所增长， 与空白 对照组比不具有显著性差异。 固本发明降血脂纳豆多肽属于实际无毒物质。 说明书 5/5 页 7 CN 107384995 A 7 。