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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710418299.6 (22)申请日 2017.06.06 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 12998 2016.10.26 (71)申请人 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 地址 150069 黑龙江省哈尔滨市香坊区哈 平路678号 (72)发明人 韩凌霞廉传江赵丽丽张圆圆 陈洪岩 (74)专利代理机构 北京思元知识产权代理事务 所(普通合伙) 11598 代理人 余光军张瑞雪 (51)Int.Cl. C12N 5/20(2006.01) C07K 16/18(。
2、2006.01) G01N 33/68(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (54)发明名称 Blec蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了Blec蛋白单克隆抗体及其制 备方法和应用。 本发明以原核表达的Blec蛋白为 免疫原免疫鼠， 将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融 合， 经过多次筛选和亚克隆， 获得特异性的单克 隆细胞株blec-3D3以及由其分泌的单抗blec- 3D3。 利用单抗blec-3D3对鸡外周血淋巴细胞进 行流式细胞术检测， 结果表明blec蛋白主要表达 于CD3+和CD4+细胞； 免疫组化检测结果表明， 单 抗blec-3D3能在鸡。
3、黏膜免疫相关组织检测到特 异性信号。 本发明提供的blec单抗可作为检测抗 体检测动物组织或细胞内的Blec蛋白的分布、 表 达或生物学功能。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 107446893 A 2017.12.08 CN 107446893 A 1.一株稳定分泌Blec蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株， 其特征在于， 其微生物保藏编 号为： CGMCC No.12998。 2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的Blec蛋白单克隆抗体。 3.权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备检测Blec蛋白在动物组织或细胞内表达或组织 学分布试剂中的应用。 4.权利要求2所述blec蛋白。
4、单克隆抗体在制备检测Blec蛋白在动物组织或细胞内表达 或组织学分布试剂中的应用。 5.检测Blec蛋白在动物组织或细胞中表达或组织学分布的抗体检测试剂盒， 包括检测 抗体， 其特征在于： 所述的检测抗体是权利要求2所述的Blec蛋白单克隆抗体。 6.检测Blec蛋白在动物组织中表达或组织学分布的免疫组化检测试剂盒， 包括检测抗 体， 其特征在于： 所述的检测抗体是权利要求2所述的Blec蛋白单克隆抗体。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107446893 A 2 Blec蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及鸡C-型凝集素样受体蛋白Blec单克隆抗体以及分泌该单克。
5、隆抗体的 杂交瘤细胞株， 本发明进一步涉及它们在检测blec蛋白的组织学分布、 体内和体外表达中 的应用， 属于鸡凝集素样受体蛋白Blec单克隆抗体的制备和应用领域。 背景技术 0002 鸡blec基因位于主要组织相容性复合体(Major histocompability complex, MHC)的核心区域， 在不同单倍型之间保守性较强。 根据编码蛋白的推导氨基酸序列分析， 为 C-型凝集素样结构， 可能与鸡的自然杀伤细胞非MHC I类分子介导的细胞杀伤功能有关。 但 至今blec蛋白的结构、 在鸡体内的组织学分布尚未见明确报道。 0003 利用Blec蛋白特异性单克隆抗体， 可通过免疫组织。
6、化学技术分析鸡体内blec蛋白 的组织学分布， 这对于研究blec蛋白的结构、 生物学功能以及在鸡体内的组织学分布具有 重要的价值。 发明内容 0004 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株稳定分泌Blec蛋白特异性单克隆 抗体的杂交瘤细胞株； 0005 本发明所要解决的第二个技术问题是将该杂交瘤细胞株分泌的Blec蛋白单克隆 抗体应用于检测鸡体内的Blec蛋白的表达或分布。 0006 为解决上述技术问题， 本发明所采取的技术方案是： 0007 本发明为获得MHC单倍型鸡保守的blec蛋白特异性单抗， 并适合于blec蛋白功能 研究， 本发明根据网上公布的所有不同单倍型鸡Blec基因序列，。
7、 比对推导氨基酸序列结果， 发现存在5个变异位点， 为了获得适用于表面配体功能分析的单抗， 本发明最终确定选择 Ala59-Leu176区域进行表达。 选择最保守的B21单倍型鸡为实验材料， 参考标准序列设计引 物， 扩增blec胞外区(Ala59-Leu176)基因， 构建pET-Blec21重组质粒， 以保证获得型通用型 单抗。 IPTG诱导pET-blec21原核表达重组菌， 超声波破碎， 用盐酸胍处理， 获得包涵体； 在复 性液中复性， 浓缩， 凝胶过滤层析柱中纯化蛋白， 获得纯化的Blec蛋白。 0008 取7周龄无特定病原体BALB/c雌性小鼠， 用纯化的blec蛋白进行免疫， 5。
8、0 g/小鼠， 腹腔注射。 每隔2周免疫一次， 第3次免疫后一周采集免疫鼠血， 37放置1h， 4离心10min 分离血清。 将血清倍比稀释， 用间接ELISA检测血清效价， 选择血清效价最高的小鼠于融合 前3天加强免疫。 将免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合， 经过3次筛选和3次亚克隆， 获得特异性 强、 稳定性好的单克隆细胞株blec-3D3。 0009 本发明对单克隆细胞株blec-3D3进行亚类鉴定， 鉴定结果显示， blec-3D3的重链 是IgM， 轻链为Kappa链。 0010 Western blot鉴定结果表明， blec-3D3能特异性检测到鸡体内黏膜免疫相关组织 中的Ble。
9、c蛋白。 说明书 1/4 页 3 CN 107446893 A 3 0011 本发明将分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株blec-3D3提交专利认可的机构进行保 藏， 其微生物保藏编号为： CGMCC No.12998； 分类命名为： BALB/c小鼠杂交瘤细胞。 保藏单 位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心； 保藏时间是2016年10月26日； 保藏地 址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 0012 流式细胞术检测结果表明， 应用本发明的Blec单抗可用于检测鸡外周血中表面表 达blec蛋白的细胞种类。 0013 免疫组化检测结果表明， 应用本发明的Blec单抗可用于检测鸡体内ble。
10、c蛋白的组 织学分布。 附图说明 0014 图1为鸡blec基因胞外区与人和小鼠C-型凝集素受体家族2型(CLEC2)的氨基酸序 列同源性比较结果。 0015 图2为BlecHiload 16/60SuperdexTM75pre gradeglobal纯化结果。 0016 图3为blec-3D3细胞上清对原核表达产物的Western blot鉴定结果： 1： pET-30a载 体转化菌； 2： pET-Blec重组质粒转化菌。 0017 图4为应用本发明Blec单抗采用流式细胞术检测鸡外周血淋巴细胞表面blec蛋白 的表达结果。 0018 图5为应用本发明Blec单抗进行免疫组化检测鸡blec。
11、蛋白组织分布的结果。 具体实施方式 0019 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。 但是应理解所述实施例仅是范例性的， 不对本发明的范围构成任何限制。 本领域 技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和 形式进行修改或替换， 但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。 0020 实施例1 MHC B单倍型鸡C 型凝集素样受体蛋白blec单抗细胞株的构建和鉴定 0021 1.免疫原blec蛋白型保守区域的选择 0022 为获得MHC单倍型鸡保守的blec蛋白特异性单抗， 并适合于blec蛋白功能研究， 本 发明根。
12、据网上公布的所有不同单倍型鸡Blec基因序列， 比对推导氨基酸序列结果， 存在5个 变异位点(下表中加粗下划线表示)。 选择最保守的B21单倍型鸡为实验材料， 参考序列设计 引物， 扩增blec基因， 构建pET-Blec21重组质粒， 以保证获得型通用型单抗。 0023 表1 鸡不同单倍型Blec基因推导氨基酸的突变位点 0024 MHC B单倍型 氨基酸位点 0025 0026 对Blec蛋白胞外区C型凝集素样结构域序列的进化分析结果表明， 其与结构已解 说明书 2/4 页 4 CN 107446893 A 4 析的人和小鼠C-型凝集素样结构域第2亚群(CLEC2)家族相似度较高(图1)。。
13、 由于哺乳动物 的CLEC2具有自然杀伤细胞(NK细胞)配体的作用， 推测鸡blec蛋白也可能是鸡NK细胞的配 体。 为了获得适用于表面配体功能分析的单抗， 本发明选择Ala59-Leu176区域进行表达。 0027 2.blec基因的扩增与原核表达 0028 根据NCBI公布的MHC-B21单倍型鸡blec序列(NCBI acc.No:AM950195)设计一对引 物： 0029 上游： 5 -CCATATGGCGCAGTGCCCGTTCGATTGGATTG-3 ， 0030 下游： 5 -CCCTCGAGTTACAACGCGGGTTTGGTGCAAACC-3 ， 以无特定病原体(Speci。
14、fic pathogen free， SPF)B21单倍型鸡外周血淋巴细胞总RNA为模板， RT-PCR反应获得blec胞外 区(Ala59-Leu176)cDNA， 克隆入大肠杆菌表达载体pET-30a， 转化E.coli BL21(DE3)感受态 细 胞 ， 构 建 成 功 原 核 表 达 重 组 质粒 p E T - b l e c 2 1 ； 所 表 达 的 氨 基 酸 序 列 为 ： MAQCPFDWIGFGGKCYYFSEDESNWTSSQNNCSALGASLAVFDSAEDLSFTMRHKGSSPHWVGLSREGKEHPWEWVN RSPLSHLFQVQGDGLCAYLGDAG。
15、LSSSHCSARRNWVCTKPAL(SEQ ID No.1)； 0031 3.免疫原形式的筛选 0032 为获得结合力强、 特异性好的单抗， 采用2种途径制备免疫原， 根据被免小鼠的血 清抗体效价， 选择效价高的被免小鼠进一步制备单抗。 0033 3.1 SDS-PAGE凝胶条免疫 0034 大量培养、 诱导表达pET-blec21重组菌， 按照包涵体的提取方式， 进行超声波破 碎、 离心， 与5上样缓冲液混匀、 煮沸后， 进行SDS-PAGE电泳。 采用没有梳齿的上样条， 上 样。 电泳结束后， 常规考马斯亮蓝染液染色30min， 沸水浴30min脱色， 期间多次换水， 直至背 景清亮无。
16、色， 目的带清晰。 根据标准分子量， 用75乙醇擦拭消毒过的刀片， 准确切下目的 条带。 尽量碾碎后， 用PBS重悬， 作为免疫原。 0035 3.2 Blec蛋白纯化产物免疫 0036 IPTG诱导pET-blec21原核表达重组菌， 菌体6000r/min离心20min取沉淀。 超声波 破碎， 用盐酸胍溶液处理， 获得包涵体。 在100mM Tris pH8.0、 400mM L-ArgHCl和2mM EDTA 复性液(加入氧化还原对5mM GSH/1mM GSSG)中复性8h， 浓缩(浓缩buffer1L:20mMTris/ 50mMNaCl)， 凝胶过滤层析柱中纯化蛋白。 选用SUPR。
17、EDEX75BG， 20mM Tris/50mM NaCl pH8.5 条件纯化。 0037 SDS-PAGE实验结果(图2)表明Blec蛋白以包涵体形式表达。 图2中， SDS-PAGE结果 上部分后边泳道的显色条带对应凝胶过滤层析柱图的前面小峰， 图下部前边泳道的显色条 带对应凝胶过滤层析柱图的高峰， 峰值高于2000mAU。 峰图结果显示， 蛋白纯度较高， 浓度为 15mg/ml。 适当稀释， 以50 g/鼠， 进行免疫。 0038 取7周龄的BALB/c雌性小鼠， 分别用上述3.1和3.2制备的免疫原腹腔注射免疫小 鼠， 各免疫3只。 7天后再免， 2免后一周采集、 分离免疫鼠血清。 。
18、以终浓度为200ng/100 L的 blec纯化蛋白包被酶标板， 用间接ELISA法检测OD450值。 结果切胶免疫鼠的OD450值平均为 0.343， 纯化蛋白免疫鼠的OD450值为0.458， 空白对照孔为0.017。 表明利用纯化蛋白进行免 疫， 获得的抗血清效价优于切胶免疫。 之后全部采用纯化蛋白进行免疫， 隔2周免疫一次， 再 免疫2次后， 常规技术融合， 制备单抗。 0039 4.阳性杂交瘤株的筛选 说明书 3/4 页 5 CN 107446893 A 5 0040 将被免疫鼠摘眼球采血致死， 无菌摘取脾脏， 用注射器内芯于300目铜网上分散脾 细胞。 与适量小鼠骨髓瘤细胞SP2/。
19、0细胞混合， 离心后， 分装到含有饲养层细胞的96孔细胞 板培养。 10-12天后， 选择培养液发黄的细胞孔逐个检测。 判定阳性标准为： (样品孔 OD450nm空白对照OD450nm)/(阴性对照孔OD450nm空白对照D450nm)2.1。 0041 多次筛选和亚克隆， 淘汰抗体分泌不稳定、 效价不高的细胞， 最终获得符合要求的 单克隆细胞株blec-3D3。 0042 5.亚型鉴定 0043应用Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit说明书对Blec mAb进行亚 类鉴定。 用Na2CO3/NaCO3包被Blec蛋白， 浓度为200ng/ul。 5脱脂乳封闭。
20、3h后， 加blec-3D3 细胞上清， 37孵育1h,再加试剂盒中的二抗(1:800稀释)， 37孵育30min。 结果显示， blec-3D3的重链是IgM， 轻链为Kappa链。 0044 6.杂交瘤细胞腹水的制备及Western blot鉴定 0045 取8-12周龄BALB/c小鼠腹腔注射石蜡油0.5mL/只， 一周后腹腔注射对数生长期的 杂交瘤细胞， 每只小鼠约106个细胞， 常规技术制备腹水。 对Blec原核表达产物及pET-30a载 体转化菌进行SDS-PAGE电泳， 进行半干转印和脱脂乳封闭。 封闭好的NC膜放入blec-3D3细 胞腹水中， 室温作用1h， PBST洗涤3次。
21、， 5min/次； 以8000倍稀释的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG 为二抗， 室温作用1h， PBST洗涤3次， 5min/次。 红外线扫膜仪显色。 结果显示blec-3D3能特异 性检测到Blec蛋白(图3)。 0046 实验例1 Blec蛋白在外周血淋巴细胞的表达 0047 加5ml鸡淋巴细胞分离液于15ml离心管中， 再缓慢等量加入72周龄SPF鸡翅静脉柠 檬酸钠抗凝血。 2000r/min离心15min， 取中间环状乳白色淋巴细胞层。 用1PBS洗2次， 每次 5min。 将分离到的细胞等体积分成3份， 每份500ul。 其中1份不染色， 做阴性对照设门， 将另 外细胞分别加入适量Bl。
22、ec-3D3腹水及商品化的鸡CD3单抗、 CD4单抗、 CD8单抗和B细胞单抗， 于37避光30min； 1600r/min离心5min， 弃掉上清， 用PBS洗2次， 每次5min； 用PBS重悬细胞， 加入FITC标记的山羊抗鼠IgG(H&L)， 37避光30min， 用1PBS重悬细胞， 300目铜网过滤 后， 用流式细胞仪检测。 结果表明有1的细胞表面表达blec蛋白， 分布在CD3+和CD4+细胞 表面(图4)； 检测结果表明， 应用本发明的Blec单抗可用于检测鸡外周血中表面表达blec蛋 白的细胞种类。 0048 实验例2 免疫组化检测blec蛋白在鸡体组织中的分布 0049 剖。
23、取12周龄SPF鸡的脾脏、 肝脏、 肾脏、 肺脏、 心脏、 法氏囊、 胸腺和盲肠扁桃体， 保 存于装有30mL 10甲醛固定液的50mL离心管中， 固定。 用石蜡包埋并切片。 染色步骤参照 免疫组织化学试剂盒说明书进行， 抗Blec蛋白特异性单抗Blec-3D3稀释度为1 100。 染色完 成后在光学显微镜下观察。 结果在法氏囊上皮、 肺三级支气管的平滑肌细胞、 肾、 小肠平滑 肌、 胸腺哈氏小体和脾髓质中检测到较强的特异性阳性信号， 而在心脏和肝脏未检测到(图 5)； 实验结果表明， 应用本发明的Blec单抗可用于检测鸡体内blec蛋白的组织学分布。 说明书 4/4 页 6 CN 10744。
24、6893 A 6 SEQUENCE LISTING 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 Blec蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用 HLJ-2001-170109A 1 PatentIn version 3.5 1 119 PRT artifical sequence 1 Met Ala Gln Cys Pro Phe Asp Trp Ile Gly Phe Gly Gly Lys Cys Tyr 1 5 10 15 Tyr Phe Ser Glu Asp Glu Ser Asn Trp Thr Ser Ser Gln Asn Asn Cys 20 25 30 Ser Ala Leu Gly Ala。
25、 Ser Leu Ala Val Phe Asp Ser Ala Glu Asp Leu 35 40 45 Ser Phe Thr Met Arg His Lys Gly Ser Ser Pro His Trp Val Gly Leu 50 55 60 Ser Arg Glu Gly Lys Glu His Pro Trp Glu Trp Val Asn Arg Ser Pro 65 70 75 80 Leu Ser His Leu Phe Gln Val Gln Gly Asp Gly Leu Cys Ala Tyr Leu 85 90 95 Gly Asp Ala Gly Leu Ser Ser Ser His Cys Ser Ala Arg Arg Asn Trp 100 105 110 Val Cys Thr Lys Pro Ala Leu 115 序列表 1/1 页 7 CN 107446893 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 8 CN 107446893 A 8 图4 图5 说明书附图 2/2 页 9 CN 107446893 A 9 。