技术领域
本发明属于生物发酵及酶的分离提纯技术领域，涉及一种制备类胡萝卜素裂解酶的方法。
背景技术
类胡萝卜素是一种广泛存在于自然界中的红色、黄色或橘色的色素，作为前体物质可以生成多种在生物体中具有重要功能的衍生物，如类维生素A、植物激素、色素及芳香类化合物等。类胡萝卜素裂解酶是一种存在于动植物及微生物中的生物酶，能够催化降解类胡萝卜素产生芳香物质，具有改善产品风味等实际应用价值，广泛应用于食品、饮料、果酒等加工领域。
目前，国内外关于类胡萝卜素裂解酶的研究主要集中在类胡萝卜素裂解酶的克隆表达上，有关葡萄球菌产生的天然类胡萝卜素裂解酶及其分离纯化方法的研究并不多，主要采用离子交换色谱法。例如，Scheibner等利用Q-Sepharose阴离子交换柱和Superdex 200 HR分子筛柱进行β-胡萝卜素裂解酶的纯化；Lanfermann等利用Phenyl Sepharose疏水层析、Q-Sepharose阴离子交换层析和Superdex 75分子筛层析进行类胡萝卜素裂解酶的纯化；朱明明等采用强阴离子交换柱、高效制备液相和多肽分子筛从巴氏葡萄球菌TS-82中制备类胡萝卜素裂解酶，并对得到的液相级纯酶进行了酶学特性研究。尽管使用离子交换色谱法能够得到纯度较高的类胡萝卜素裂解酶，但是该方法步骤繁琐，容易造成蛋白构象的改变，影响类胡萝卜素裂解酶的活性。
CN 104628794 B公开了一种对微生物发酵法生产的N-乙酰神经氨酸进行分离提纯的方法，该方法以大肠杆菌发酵生产的N-乙酰神经氨酸的发酵液为原料，首先通过过滤离心去除发酵液中的菌体，然后通过调节pH和加热处理去除杂蛋白，最后通过减压蒸发浓缩干燥获得N-乙酰神经氨酸。然而在该方法中，大肠杆菌在发酵生产过程中并不是始终处于最佳产酶期，生产的N-乙酰神经氨酸混合的杂质较多，因此在分离提纯过程中还需要进行去除杂质、脱色、除盐等操作，生产方法较复杂，生产成本较高。
因此，提供一种工艺简单、易于操作、成本较低的类胡萝卜素裂解酶的制备方法，对食品加工领域具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种制备类胡萝卜素裂解酶的方法，以克服现有技术工艺复杂、成本较高，制备的类胡萝卜素裂解酶纯度低、活性差等缺点。
第一方面，本发明提供一种制备类胡萝卜素裂解酶的方法，包括如下步骤：
(1)去除菌体：对巴氏葡萄球菌菌悬液进行离心和过滤，去除菌体，获得除菌发酵液；
(2)去除杂蛋白：对步骤(1)所述除菌发酵液进行加热处理和pH值调节，离心后去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
(3)产物浓缩：对步骤(2)所述除蛋白发酵液进行浓缩，获得类胡萝卜素裂解酶。
本发明采用处于最佳生长条件的巴氏葡萄球菌菌悬液为原料，利用加热、调节pH的方法去除杂蛋白，经离心、浓缩获得纯度较高、酶活性好的类胡萝卜素裂解酶，可作为食品增香添加剂应用于食品加工领域。
优选地，步骤(1)所述离心的速度为5000-20000r/min，例如可以是5000r/min、6000r/min、7000r/min、8000r/min、9000r/min、10000r/min、11000r/min、12000r/min、13000r/min、14000r/min、15000r/min、16000r/min、17000r/min、18000r/min、19000r/min或20000r/min，优选为10000r/min。
优选地，步骤(1)所述离心的时间为1-10min，例如可以是1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min，优选为5-6min。
优选地，步骤(1)所述过滤采用过滤膜进行过滤。
优选地，所述过滤膜的孔径为0.1-0.5μm，例如可以是0.1μm、0.12μm、0.15μm、0.18μm、0.2μm、0.22μm、0.25μm、0.28μm、0.3μm、0.32μm、0.35μm、0.38μm、0.4μm、0.42μm、0.45μm、0.48μm或0.5μm，优选为0.22μm。
优选地，步骤(2)所述加热处理过高或过低都会直接影响后续类胡萝卜素裂解酶的纯度和酶活，发明人发现，所述加热的温度为50-70℃，其制备的胡萝卜素裂解酶的纯度高，酶活高，所述加热温度例如可以是50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃，优选为52-65℃。
优选地，步骤(2)所述加热处理的时间过长或过短也会直接影响后续类胡萝卜素裂解酶的性能，本发明采用加热处理的时间为50-100min，例如可以是50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、85min、90min、95min或100min，优选为60-70min。
优选地，步骤(2)所述pH值采用盐酸溶液进行调节。
优选地，所述盐酸溶液的浓度为0.05-0.5M，例如可以是0.05M、0.08M、0.1M、0.12M、0.15M、0.18M、0.2M、0.22M、0.25M、0.28M、0.3M、0.32M、0.35M、0.38M、0.4M、0.42M、0.45M、0.48M或0.5M，优选为0.1M。
优选地，步骤(2)所述pH值直接影响后续类胡萝卜素裂解酶的纯度和活性，本发明的pH值调节为1-4，例如可以是1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8或4，优选为2-3.5。
优选地，步骤(2)所述离心的速度为5000-20000r/min，例如可以是5000r/min、6000r/min、7000r/min、8000r/min、9000r/min、10000r/min、11000r/min、12000r/min、13000r/min、14000r/min、15000r/min、16000r/min、17000r/min、18000r/min、19000r/min或20000r/min，优选为10000r/min。
优选地，步骤(2)所述离心的时间为2-20min，例如可以是2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，优选为8-15min。
优选地，步骤(3)所述浓缩采用吸收法、减压加温蒸发浓缩法、冰冻法或超滤法中的任意一种或至少两种的组合，优选为吸收法。
优选地，所述吸收法的吸收剂为聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖或凝胶中的任意一种或至少两种的组合，优选为聚乙二醇。
优选地，所述吸收剂的分子量为1000-5000，例如可以是1000、1200、1500、1800、2000、2200、2500、2800、3000、3200、3500、3800、4000、4200、4500、4800或5000，优选为2000。
优选地，步骤(3)所述浓缩采用透析膜进行浓缩。
优选地，所述透析膜的截留分子量为100-1000D，例如可以是100D、200D、300D、400D、500D、600D、700D、800D、900D或1000D，优选为500D。
优选地，步骤(3)所述类胡萝卜素裂解酶的体积与步骤(1)所述菌悬液的总体积的体积比为1:(1-10)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:5。
优选地，在步骤(1)之前还包括细菌培养的步骤。
优选地，所述细菌培养具体包括：将活化的巴氏葡萄球菌接种于液体培养基中，培养后获得菌悬液。
优选地，所述巴氏葡萄球菌的接种浓度为0.01-1％，例如可以是0.01％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％或1％，优选为0.1-0.5％。
优选地，所述液体培养基为查氏培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基、SOC培养基或SOB培养基中的任意一种或至少两种的组合，优选为查氏培养基。
优选地，所述液体培养基的pH值为4-8，例如可以是4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8优选为5-7。
优选地，所述培养的温度为20-40℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为25-35℃。
优选地，所述培养的时间为50-70h，例如可以是50h、51h、52h、53h、54h、55h、56h、57h、58h、59h、60h、61h、62h、63h、64h、65h、66h、67h、68h、69h或70h，优选为52-65h。
优选地，在步骤(4)之后还包括酶活力测定的步骤。
优选地，所述酶活力测定采用连续检测法。
作为优选技术方案，所述制备类胡萝卜素裂解酶的方法，包括如下步骤：
(1)细菌培养：将活化的巴氏葡萄球菌以接种浓度为0.01-1％接种于pH值为4-8的液体培养基中，在20-40℃下培养50-70h后获得菌悬液；
(2)去除菌体：对步骤(1)所述菌悬液在5000-20000r/min下离心1-10min，然后使用孔径为0.1-0.5μm的过滤膜进行过滤，去除菌体，获得除菌发酵液；
(3)去除杂蛋白：对步骤(2)所述除菌发酵液在50-70℃下加热处理50-100min，使用浓度为0.05-0.5M的盐酸溶液调节pH值至1-4，在5000-20000r/min下离心2-20min，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
(4)产物浓缩：将步骤(3)所述除蛋白发酵液装入截留分子量为100-1000D的透析膜中，外加分子量为1000-5000的吸收剂进行浓缩，获得的类胡萝卜素裂解酶的体积与步骤(1)所述菌悬液的总体积的体积比为1:(1-10)；
(5)酶活力测定：采用连续检测法测定类胡萝卜素裂解酶的酶活力。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的方法制备得到的类胡萝卜素裂解酶。
第三方面，本发明提供了一种如第二方面所述的类胡萝卜素裂解酶应用于食品加工。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的制备类胡萝卜素裂解酶的方法在最佳生长条件下培养巴氏葡萄球菌，在最高酶活期收获发酵液，根据类胡萝卜素裂解酶的耐热、耐酸特性，通过将发酵液的温度加热至50-70℃，pH值调节至1-4，在这两个条件的共同配合下，能够有效去除杂蛋白，使得制备得到的类胡萝卜素裂解酶的纯度高，活力高；
(2)本发明制备得到的类胡萝卜素裂解酶纯度最高为88.09％，酶活力最高达0.71U/L；
(3)本发明制备方法工艺简单，成本较低，具有较强的实用性。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
(1)细菌培养：将活化的巴氏葡萄球菌以接种浓度为0.1％接种于pH值为5的查氏培养基中，在25℃下培养55h后获得菌悬液；
(2)去除菌体：对步骤(1)所述菌悬液在10000r/min下离心5min，然后使用孔径为0.22μm的过滤膜进行过滤，去除菌体，获得除菌发酵液；
(3)去除杂蛋白：对步骤(2)所述除菌发酵液在55℃下加热处理60min，使用浓度为0.1M的盐酸溶液调节pH值至3，在10000r/min下离心10min，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
(4)产物浓缩：将步骤(3)所述除蛋白发酵液装入截留分子量为500D的透析膜中，外加分子量为2000的聚乙二醇进行浓缩，获得的类胡萝卜素裂解酶的体积与步骤(1)所述菌悬液的总体积的体积比为1:5；
(5)酶活力测定：采用连续检测法测定类胡萝卜素裂解酶的酶活力。
实施例2
(1)细菌培养：将活化的巴氏葡萄球菌以接种浓度为0.25％接种于pH值为6的查氏培养基中，在35℃下培养52h后获得菌悬液；
(2)去除菌体：对步骤(1)所述菌悬液在8000r/min下离心6min，然后使用孔径为0.3μm的过滤膜进行过滤，去除菌体，获得除菌发酵液；
(3)去除杂蛋白：对步骤(2)所述除菌发酵液在52℃下加热处理80min，使用浓度为0.2M的盐酸溶液调节pH值至2，在8000r/min下离心15min，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
(4)产物浓缩：将步骤(3)所述除蛋白发酵液装入截留分子量为300D的透析膜中，外加分子量为1500的聚乙二醇进行浓缩，获得的类胡萝卜素裂解酶的体积与步骤(1)所述菌悬液的总体积的体积比为1:8；
(5)酶活力测定：采用连续检测法测定类胡萝卜素裂解酶的酶活力。
实施例3
(1)细菌培养：将活化的巴氏葡萄球菌以接种浓度为0.5％接种于pH值为7的牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃下培养65h后获得菌悬液；
(2)去除菌体：对步骤(1)所述菌悬液在12000r/min下离心3min，然后使用孔径为0.2μm的过滤膜进行过滤，去除菌体，获得除菌发酵液；
(3)去除杂蛋白：对步骤(2)所述除菌发酵液在65℃下加热处理70min，使用浓度为0.05M的盐酸溶液调节pH值至3.5，在12000r/min下离心8min，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
(4)产物浓缩：将步骤(3)所述除蛋白发酵液装入截留分子量为600D的透析膜中，外加分子量为3000的聚乙二醇进行浓缩，获得的类胡萝卜素裂解酶的体积与步骤(1)所述菌悬液的总体积的体积比为1:5；
(5)酶活力测定：采用连续检测法测定类胡萝卜素裂解酶的酶活力。
实施例4
(1)细菌培养：将活化的巴氏葡萄球菌以接种浓度为0.8％接种于pH值为4的LB培养基中，在40℃下培养50h后获得菌悬液；
(2)去除菌体：对步骤(1)所述菌悬液在15000r/min下离心8min，然后使用孔径为0.4μm的过滤膜进行过滤，去除菌体，获得除菌发酵液；
(3)去除杂蛋白：对步骤(2)所述除菌发酵液在50℃下加热处理100min，使用浓度为0.4M的盐酸溶液调节pH值至1，在15000r/min下离心20min，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
(4)产物浓缩：将步骤(3)所述除蛋白发酵液装入截留分子量为100D的透析膜中，外加分子量为1000的聚乙烯吡咯酮进行浓缩，获得的类胡萝卜素裂解酶的体积与步骤(1)所述菌悬液的总体积的体积比为1:10；
(5)酶活力测定：采用连续检测法测定类胡萝卜素裂解酶的酶活力。
实施例5
(1)细菌培养：将活化的巴氏葡萄球菌以接种浓度为1％接种于pH值为7的SOC培养基中，在22℃下培养68h后获得菌悬液；
(2)去除菌体：对步骤(1)所述菌悬液在20000r/min下离心1min，然后使用孔径为0.5μm的过滤膜进行过滤，去除菌体，获得除菌发酵液；
(3)去除杂蛋白：对步骤(2)所述除菌发酵液在68℃下加热处理55min，使用浓度为0.3M的盐酸溶液调节pH值至3.8，在20000r/min下离心5min，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
(4)产物浓缩：将步骤(3)所述除蛋白发酵液装入截留分子量为800D的透析膜中，外加分子量为4000的蔗糖进行浓缩，获得的类胡萝卜素裂解酶的体积与步骤(1)所述菌悬液的总体积的体积比为1:3；
(5)酶活力测定：采用连续检测法测定类胡萝卜素裂解酶的酶活力。
实施例6
(1)细菌培养：将活化的巴氏葡萄球菌以接种浓度为0.01％接种于pH值为8的SOB培养基中，在20℃下培养70h后获得菌悬液；
(2)去除菌体：对步骤(1)所述菌悬液在5000r/min下离心10min，然后使用孔径为0.1μm的过滤膜进行过滤，去除菌体，获得除菌发酵液；
(3)去除杂蛋白：对步骤(2)所述除菌发酵液在70℃下加热处理50min，使用浓度为0.5M的盐酸溶液调节pH值至4，在5000r/min下离心2min，去除杂蛋白沉淀，获得除蛋白发酵液；
(4)产物浓缩：将步骤(3)所述除蛋白发酵液装入截留分子量为1000D的透析膜中，外加分子量为5000的凝胶进行浓缩，获得的类胡萝卜素裂解酶的体积与步骤(1)所述菌悬液的总体积的体积比为1:1；
(5)酶活力测定：采用连续检测法测定类胡萝卜素裂解酶的酶活力。
对比例1
与实施例1相比，除菌发酵液在45℃下进行加热处理，其他制备过程与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，除菌发酵液在75℃下进行加热处理，其他制备过程与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，除菌发酵液的pH调节至0.05，其他制备过程与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，除菌发酵液的pH调节至5，其他制备过程与实施例1相同。
酶活力测定实验
在光程为1.5cm的比色皿中加入1.4mL类胡萝卜素裂解酶酶液和0.1mLβ-胡萝卜素储备液，在波长460nm处测定其吸光值，10min内降解1μmoLβ-胡萝卜素所需类胡萝卜素裂解酶的酶量为1个酶活力单位(U/L)。
实验结果如表1所示。
表1类胡萝卜素裂解酶的纯度与活性
编号 纯度(％) 酶活力(U/L) 实施例1 88.09 0.71 实施例2 85.25 0.52 实施例3 82.42 0.45 实施例4 79.87 0.42 实施例5 77.65 0.40 实施例6 74.32 0.40 对比例1 45.31 0.07 对比例2 41.56 0.04 对比例3 41.08 0.05 对比例4 40.44 0.05
可以看出，实施例1-6制备的类胡萝卜素裂解酶纯度均高于70％，并且具有较高的酶活力，其中，实施例1制备的类胡萝卜素裂解酶纯度最高为88.09％，酶活力达0.71U/L。
与实施例1相比，对比例1-4的加热温度和pH值不是纯化类胡萝卜素裂解酶的最适条件，制备的类胡萝卜素裂解酶含有较多的杂蛋白，纯度低于50％，酶活力极低。
综上所述，本发明提供的制备类胡萝卜素裂解酶的方法在最佳生长条件下培养巴氏葡萄球菌，在最高酶活期收获发酵液，根据类胡萝卜素裂解酶的耐热、耐酸特性，通过调节发酵液的温度和pH值，在这两个条件的共同配合下，能够有效去除杂蛋白，制备的类胡萝卜素裂解酶纯度好、活性高，制备方法工艺简单，成本较低，具有较强的实用性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。