一株产石杉碱甲和石杉碱乙的单胞菌SXZN10菌株及用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710923780.0 (22)申请日 2017.09.30 (83)生物保藏信息 CCTCC NO： M2017512 2017.09.14 (71)申请人 中南民族大学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区民族大 道708号 (72)发明人 张鹏张学智宋发军刘盼 裴婷吴新广耿红 (74)专利代理机构 武汉华旭知识产权事务所 42214 代理人 刘天钰 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 17/12(2006.01) C12P 17/。

2、18(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一株产石杉碱甲和石杉碱乙的单胞菌SXZ- N10菌株及用途 (57)摘要 本发明提供了一株产石杉碱甲和石杉碱乙 的单胞菌SXZ-N10菌株， 该菌株可产石杉碱甲和 石杉碱乙。 该菌株被命名为SXZ-N10， 属一种单胞 菌， 该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心， 地 址： 中国， 武汉， 武汉大学； 邮编430072， 保藏日期 为2017年9月14日， 保藏编号为： CCTCCNO： M2017512； 该菌株的16SrDNA序列如SEQID NO.1所示。 上述单胞菌SXZ-N10菌株能够用于发 酵制备石杉碱甲。

3、和石杉碱乙。 微生物发酵条件包 括： 发酵培养基组成： 酵母粉8g/L， 蛋白胨5g/L， 氯化钠5g/L， 葡萄糖10g/L， pH6.0； 培养条件为： 27， 200rpm， 发酵培养7天。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图3页 CN 107488619 A 2017.12.19 CN 107488619 A 1.一株产石杉碱甲和石杉碱乙的单胞菌(Brevundimonas sp.)SXZ-N10菌株， 该菌株保 藏于中国典型培养物保藏中心， 地址： 中国， 武汉， 武汉大学； 邮编430072， 保藏日期为2017 年9月14日， 保藏编号为： CCTCC NO： M201。

4、7512， 该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。 2.权利要求1所述单胞菌SXZ-N10菌株的用途， 其特征在于： 用于发酵制备石杉碱甲和 石杉碱乙。 3.根据权利要求2所述的用途， 其特征在于： 微生物发酵条件为： 发酵培养基组成： 酵母 粉8g/L， 蛋白胨5g/L， 氯化钠5g/L， 葡萄糖10g/L， pH 6.0； 培养条件为： 27， 200r/min， 发酵 培养7天。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107488619 A 2 一株产石杉碱甲和石杉碱乙的单胞菌SXZ-N10菌株及用途 技术领域 0001 本发明涉及一种单胞菌菌株， 该菌株可产石杉碱甲和石。

5、杉碱乙， 属于微生物技术 领域。 背景技术 0002 目前植物内生菌研究逐渐受到重视， 不同植物的各种内生菌相继被发现。 内生菌 种类的多样性也赋予了其代谢产物的多样性， 这也预示着利用微生物代谢发掘生物、 化学、 医药等新资源具有巨大的潜力。 大量研究表明， 植物内生菌可产生与宿主植物相同或相似 的活性物质及前体， 这一发现直接推动了植物内生菌尤其是药用植物内生菌研究的广泛展 开。 随着人们对药用植物内生菌的逐步研究， 利用能够代谢产生相应活性成分的内生菌来 生产新型、 高效、 低成本的活性药物， 解决珍稀中药植物资源紧缺的现状， 必将成为将来药 用植物内生菌研究的重点。 0003 蛇足石杉。

6、中的药用活性成分石杉碱甲(Huperzine A， HupA)和石杉碱乙 (Huperzine B， HupB)是一种低毒、 高效抑制乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase， AChE) 的药物， 其中石杉碱甲是临床上用来治疗 “阿尔茨海默症(老年痴呆症)” (Alzaheimer disease， AD) 的主要药物。 然而， 由于蛇足石杉植物资源匮乏且生长缓慢、 石杉碱甲含量很 低等原因， 仅依靠从蛇足石杉提取石杉碱甲无法满足市场需求。 而化学合成的石杉碱甲的 活性远低于天然石杉碱甲， 且得到高光学活性的石杉碱甲成本较高。 目前本领域中有一些 利用蛇足石杉内生菌进行微生物。

7、发酵从而生产石杉碱甲的相关报道， 但是这些菌株的种类 以及产量还是无法满足市场对于石杉碱甲的需求。 发明内容 0004 本发明解决了背景技术中的问题， 提供了一株产石杉碱甲和石杉碱乙的单胞菌 SXZ-N10菌株， 该菌株可产石杉碱甲和石杉碱乙。 0005 本发明人筛选到一株新型菌株， 该菌株被命名为SXZ-N10， 属一种单胞菌 (Brevundimonas sp.)， 该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址： 中国， 武汉， 武汉大 学； 邮编430072， 保藏日期为2017年9月14日， 保藏编号为： CCTCC NO： M2017512； 该菌株的 16S rDNA序列如SEQ I。

8、D NO.1所示。 0006 上述单胞菌SXZ-N10菌株能够用于发酵制备石杉碱甲和石杉碱乙。 微生物发酵条 件包括： 发酵培养基组成： 酵母粉8g/L， 蛋白胨5g/L， 氯化钠5g/L， 葡萄糖10g/L， pH 6.0； 培 养条件为： 27， 200rpm， 发酵培养7天。 0007 与现有技术相比， 本发明具有以下优点： 本发明所提供的单胞菌SXZ-N10菌株能够 代谢产生石杉碱甲和石杉碱乙。 本发明提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养， 且 发酵成本较低， 又不受时域、 季节等条件限制， 因此能够通过微生物发酵的途径解决石杉碱 甲成本较高、 市场需求缺口大的现状。 同时本发明中。

9、还提供了优化后的微生物发酵条件以 及培养基的配方， 石杉碱甲和石杉碱乙的产量较高。 说明书 1/3 页 3 CN 107488619 A 3 附图说明 0008 图1为单胞菌SXZ-N10菌株的石杉碱甲和石杉碱乙的第一次HPLC检测图； 0009 图2为单胞菌SXZ-N10菌株的石杉碱甲和石杉碱乙的第二次HPLC检测图； 0010 图3为单胞菌SXZ-N10菌株的石杉碱甲的MS检测图； 0011 图4为单胞菌SXZ-N10菌株的石杉碱乙的MS检测图。 具体实施方式 0012 下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明， 但是本发明的保护范围并不局 限于以下实施例。 0013 菌株的分离、 培养。

10、 0014 本实施例中将蛇足石杉材料用清水冲洗干净后， 再用清水超声10min， 分离其叶、 茎并切割成约4cm小段， 依次在0.1升汞浸泡4min、 70乙醇中浸泡2分钟， 5次氯酸钠浸 泡5分钟， 之后用无菌水多次冲洗， 无菌条件下将其研磨成匀浆， 在每个不含抗生素的PDA平 板上取200 l匀浆涂布， 30静置培养1-2d。 培养过程中根据细菌生长情况随机挑取20处菌 落， 接至新的LA培养基， 并经过多次平板划线法分离传代获得各单克隆， 编号并保种。 0015 将平板上纯化完成的细菌挑取至装有600 L LB液体培养基的1.5mL EP管中， 封口 膜封口， 然后于37恒温摇床中190。

11、r/min摇床培养1d后， 加入等体积的50的甘油， 混匀后 于-80超低温冰箱中保存， 每个菌株至少保存3份。 0016 将保存的菌种取10 L接种到5mL LB液体培养基中， 于37恒温摇床150r/min 活 化培养， 24h后取3mL活化的菌种至三角瓶中的LB液体培养基中进行发酵， 装液量60mL/ 100mL， 37、 150r/min摇床培养7d。 经过以上发酵培养后， 收集发酵液。 菌株的筛选 0017 本实施例中将上述收集得到的菌株通过高效液相色谱法(HPLC)初筛和复筛检测 各个内生细菌的发酵提取物后， 利用质谱法(Mass Spectrometry， MS)进一步确认。 分。

12、离得 到了一株能够产石杉碱甲和石杉碱乙的菌株， 将其命名为： SXZ-N10菌株。 0018 HPLC初筛： 色谱仪为ultimate-3000色谱系统， ODS-C18反相柱(4.6mm150mm， 5 m， Agilent)， 流动相为甲醇： 水65:35； 标准品浓度为100 g/mL， 流速为0.5mL/min， 紫外波 长设定为310nm， 柱温为20， 检测结果如图1所示。 0019 HPLC复筛： 改变流动相为甲醇： 水55:45， 其它条件不变。 检测结果如图2所示。 0020 质谱分析在中南民族大学化材学院测试分析中心采用液相色谱-质谱联用分析 仪/ Agilent LC-Q。

13、-TOF-MS 6520系统完成。 其中单胞菌SXZ-N10菌株的石杉碱甲的MS检测 如图3所示； 单胞菌SXZ-N10菌株的石杉碱乙的MS检测如图4所示。 0021 测序及序列比对、 分析 0022 将该菌株送某生物技术有限公司测序， 该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所 示。 测序结果在GenBank核酸数据库中进行Blast相似性分析， 经Blast序列比对及进化树分 析， 确定其为单胞菌(Brevundimonas sp.)的细菌。 0023 菌株的保藏： 0024 将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址： 中国， 武汉， 武汉大学； 邮编 430072， 保藏。

14、日期为2017年9月14日， 保藏编号为： CCTCC NO： M2017512。 说明书 2/3 页 4 CN 107488619 A 4 0025 发酵条件的优化 0026 微生物的发酵培养基组分必须能够满足菌株快速生长繁殖的需要， 同时最适的发 酵培养条件又能够保证其次生代谢物的大量积累。 本发明初步优化了SXZ-N10菌株的发酵 培养基成分以及培养条件， 优化后的培养基配方为： 酵母粉8g/L， 蛋白胨5g/L， 氯化钠5g/L， 葡萄糖10g/L， 初始pH值6.0； 培养条件为： 培养温度27， 摇床转速 200r/min， 发酵时间7 天。 说明书 3/3 页 5 CN 1074。

15、88619 A 5 序列表 中南民族大学 一株产石杉碱甲和石杉碱乙的单胞菌SXZ-N10菌株及用途 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 1425 DNA 单胞菌(Brevundimonas sp.) 1 agagtttgat catggctcag agcgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac 60 ggacccttcg gggttagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggaacgtgc ctttaggttc 120 ggaatagctc ctggaaacgg gtggtaatgc cgaatgtgcc cttcg。

16、gggga aagatttatc 180 gcctttagag cggcccgcgt ctgattagct agttggtgag gtaatggctc accaaggcga 240 cgatcagtag ctggtctgag aggatgacca gccacattgg gactgagaca cggcccaaac 300 tcctacggga ggcagcagtg gggaatcttg cgcaatgggc gaaagcctga cgcagccatg 360 ccgcgtgaat gatgaaggtc ttaggattgt aaaattcttt caccggggac gataatgacg 420。

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