一种检测病毒的引物组合及应用、试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710754362.3 (22)申请日 2017.08.28 (71)申请人 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司 地址 158100 黑龙江省鸡西市虎林市虎林 镇红星街72号 申请人 哈尔滨珍宝制药有限公司 (72)发明人 方同华许照芹项彦华席桂才 代喜国 (74)专利代理机构 北京超凡志成知识产权代理 事务所(普通合伙) 11371 代理人 齐海迪 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006。

2、.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种检测病毒的引物组合及应用、 试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种检测病毒的引物组合及 应用、 试剂盒， 属于医药领域。 本发明提供的检测 病毒的引物组合针对性强、 特异性高以及较好的 灵敏度； 将上述检测病毒的引物组合在检测注射 用骨肽中口蹄疫病毒、 轮状病毒、 乙脑病毒、 猪蓝 耳病毒、 猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒检测结果更为 准确可靠； 上述引物组合应用于制备检测病毒的 试剂盒， 能更利于方便快捷的检测病毒， 将更有 利于试剂盒的应用推广， 具有较高的试剂应用价 值和推广价值。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图。

3、9页 CN 107385115 A 2017.11.24 CN 107385115 A 1.一种检测病毒的引物组合， 其特征在于， 所述引物组合包括检测口蹄疫病毒的第1引 物对、 检测轮状病毒的第2引物对、 检测乙脑病毒的第3引物对、 检测猪蓝耳病毒的第4引物 对、 检测猪伪狂犬病毒的第5引物对以及检测猪瘟病毒的第6引物对中的至少一种； 所述第 1-6引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-12所示。 2.如权利要求1所述的检测病毒的引物组合在检测注射用骨肽中口蹄疫病毒、 轮状病 毒、 乙脑病毒、 猪蓝耳病病毒、 猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特征在。

4、于， 包括以待检样本为模板进行PCR反应； 所述 第1-6引物对的退火温度为58-63。 4.如权利要求1所述检测病毒的引物组合在制备病毒检测试剂盒中的应用。 5.一种检测病毒的检测试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒包括如权利要求1所述的 检测病毒的引物组合。 6.根据权利要求5所述的检测试剂盒， 其特征在于， 还包括PCR反应缓冲液、 Taq DNA聚 合酶、 dNTPs、 2Super Real PreMix、 荧光试剂、 目的片段标准品和Mg2+中的至少一种。 7.根据权利要求6所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述荧光试剂包括SYBR GreenI或 者SYBR Green。 8.。

5、根据权利要求5所述的检测试剂盒， 其特征在于， 还包括反转录试剂。 9.根据权利要求8所述的检测试剂盒， 其特征在于， 所述反转录试剂包括dNTPs、 random primer、 5MLV-RT缓冲液、 RNase抑制剂和MLVRT反转录酶中的至少一种。 10.如权利要求5-9任一项所述的检测试剂盒在检测病毒中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107385115 A 2 一种检测病毒的引物组合及应用、 试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及医药领域， 具体而言， 涉及一种检测病毒的引物组合及应用、 试剂盒。 背景技术 0002 骨肽在临床上的应用非常广泛， 具有较好的疗效。 研究表。

6、明， 骨肽中含有多种促进 骨代谢的活性肽类及钙、 磷、 铁等无机元素， 具有调节骨代谢、 刺激成骨细胞增殖、 促进新骨 形成、 以及调节钙磷代谢作用； 具有明显增强骨钙代谢沉积， 防止骨质疏松的作用； 具有明 显的抗炎、 镇痛的作用， 在骨组织的修复和形成过程中起着重要的调控作用。 包括骨形成发 生蛋白(BMP)、 转化生长因子-(TGF- )、 成纤维细胞生长因子(FGF)、 胰岛素样生长因子 (IGF)、 血小板衍生生长因子(PDGF)、 表皮细胞生长因子(EGF)等， 其中BMP是已知效用最强 的骨生长因子。 0003 到达作用靶位， 产生药理作用或诱导基因表达内源性骨生长因子产生药理作。

7、用。 该药品用药方便， 疗效肯定， 是各类骨科病人期用药的理想选择。 0004 但是， 动物源的骨肽可能含有一些病毒等不安全因素， 因此需要对动物源的注射 用骨肽进行安全检测， 然后现在还很少有针对骨肽的安全检测。 发明内容 0005 本发明的第一目的在于提供一种检测病毒的引物组合， 该引物组合能快速方便的 检测口蹄疫病毒、 轮状病毒、 乙脑病毒、 猪蓝耳病毒、 猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒， 使检测高效 快速。 0006 本发明的第二目的在于提供上述的检测病毒的引物组合在检测注射用骨肽中口 蹄疫病毒、 轮状病毒、 乙脑病毒、 猪蓝耳病毒、 猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒中的应用。 0007 本发明的第三目。

8、的在于提供上述检测病毒的引物组合在制备病毒检测试剂盒中 的应用。 0008 本发明的第四目的在于提一种检测病毒的检测试剂盒， 通过该试剂盒可以方便于 检测。 0009 本发明的第五目的在于提供上述的检测试剂盒在检测病毒中的应用。 0010 为了实现本发明的上述目的， 采用以下技术方案： 0011 一种检测病毒的引物组合， 引物组合包括检测口蹄疫病毒的第1引物对、 检测轮状 病毒的第2引物对、 检测乙脑病毒的第3引物对、 检测猪蓝耳病毒的第4引物对、 检测猪伪狂 犬病毒的第5引物对以及检测猪瘟病毒的第6引物对中的至少一种； 第1-6引物对的碱基序 列分别如SEQ ID No.1-12所示。 00。

9、12 上述的检测病毒的引物组合在检测注射用骨肽中口蹄疫病毒、 轮状病毒、 乙脑病 毒、 猪蓝耳病毒、 猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒中的应用。 0013 上述检测病毒的引物组合在制备病毒检测试剂盒中的应用。 0014 一种检测病毒的检测试剂盒， 检测试剂盒包括上述的检测病毒的引物组合。 说明书 1/8 页 3 CN 107385115 A 3 0015 上述的检测试剂盒在检测病毒中的应用。 0016 本发明的有益效果为： 本发明提供的检测病毒的引物组合针对性强、 特异性高以 及比较好的灵敏度； 将上述检测病毒的引物组合在检测注射用骨肽中口蹄疫病毒、 轮状病 毒、 乙脑病毒、 猪蓝耳病毒、 猪伪狂犬病毒。

10、和猪瘟病毒检测结果更为准确可靠； 上述引物组 合应用于制备检测病毒的试剂盒， 能更利于方便快捷的检测病毒， 将更有利于试剂盒的应 用推广， 具有较高的试剂应用价值和推广价值。 附图说明 0017 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍， 应当理解， 以下附图仅示出了本发明的某些实施例， 因此不应被看作是对 范围的限定， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这 些附图获得其他相关的附图。 0018 图1为本发明实施例6提供的口蹄疫病毒熔解温度曲线图； 0019 图2为本发明实施例6提供的轮状病毒熔解温度曲线图； 。

11、0020 图3为本发明实施例6提供的乙脑病毒熔解温度曲线图； 0021 图4为本发明实施例6提供的猪蓝耳病病毒熔解温度曲线图； 0022 图5为本发明实施例6提供的猪伪狂犬病毒熔解曲线图； 0023 图6为本发明实施例6提供的猪瘟病毒熔解温度曲线图； 0024 图7为本发明实验例6提供的口蹄疫病毒标准曲线图； 0025 图8为本发明实验例6提供的轮状病毒熔解曲线图； 0026 图9为本发明实验例6提供的乙脑病毒熔解温度曲线图； 0027 图10为本发明实验例6提供的猪蓝耳病毒标准曲线图； 0028 图11为本发明实验例6提供的猪伪狂犬病毒标准曲线图； 0029 图12为本发明实验例6提供的猪瘟。

12、病毒标准曲线图； 0030 图13为本发明实验例1提供的口蹄疫病毒扩增曲线图； 0031 图14为本发明实验例1提供的轮状病毒扩增曲线图； 0032 图15为本发明实验例1提供的乙脑病毒扩增曲线图； 0033 图16为本发明实验例1提供的猪蓝耳病毒扩增曲线图； 0034 图17为本发明实验例1提供的猪伪狂犬病毒扩增曲线图； 0035 图18为本发明实验例1提供的猪瘟病毒扩增曲线图。 具体实施方式 0036 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述， 但是本领域技术人员将会 理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不应视为限制本发明的范围。 实施例中未注明具体 条件者， 按照常规条件或制造。

13、商建议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为 可以通过市售购买获得的常规产品。 0037 下面对本发明实施例的一种检测病毒的引物组合及应用、 试剂盒进行具体说明。 0038 口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus， FMDV)属于小RNA病毒科， 口蹄疫病毒 属； 感染的偶蹄动物引起急性、 热性、 接触性传染病， 最易感染的动物是黄牛、 水牛、 猪、 骆 说明书 2/8 页 4 CN 107385115 A 4 驼、 羊、 鹿等； 黄羊、 麝、 野猪、 野牛等野生动物也易感染此病。 0039 轮状病毒(Rotavirus， 简称RV)是一种双链核糖核酸病毒，。

14、 属于呼肠孤病毒科。 经 由粪口途径传染的。 它会感染与小肠连结的肠黏膜细胞(enterocyte)并且产生肠毒素 (enterotoxin)， 肠毒素会引起肠胃炎， 导致严重的腹泻， 有时候甚至会因为脱水而导致死 亡。 0040 流行性乙脑病毒临床上表现为高烧、 意识障碍、 抽搐、 颅内压升高以及脑膜刺激 症。 重症患者可能死于呼吸循环衰竭， 部分患者病后遗留失语、 强直性痉挛、 精神失常等后 遗症。 0041 猪蓝耳病毒感染猪群， 猪群突然发病， 初期发病猪表现为发烧， 体温41左右， 以 40.5的体温为最多。 精神沉郁， 不吃； 眼结膜炎、 眼睑水肿； 咳嗽、 气喘， 呼吸困难， 鼻孔。

15、流 出泡沫或浓鼻涕等分泌物； 皮肤发红， 耳部发紫， 腹下和四肢末梢等处皮肤呈紫红色斑块状 或丘疹样； 部分病猪出现后躯无力、 不能站立或共济失调等神经症状。 0042 猪伪狂犬病病毒在病原分类上属疱疹病毒科， 伪狂犬病是一种以多种家畜和野生 动物发热， 奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的急性传染病。 猪是伪狂犬病的唯一自然 宿主， 对其危害大。 可致妊娠母猪流产， 产死胎及胎儿干尸化。 对初生仔猪则引起神经症状， 出现运动失调， 麻痹， 衰竭死亡， 病死率100。 成年猪多呈隐性感染， 但可引起呼吸道症状。 0043 猪瘟病毒(Hogcholera virus,Swine fever vi。

16、rus)是猪瘟的病原， 危害猪和野 猪， 其他动物不发病。 猪瘟是一种急性、 热性、 高度接触性传染病， 主要特征是高温、 微血管 变性而引起全身出血、 坏死、 梗塞。 猪瘟对猪危害极为严重， 会造成养猪业重大损失。 0044 一种检测病毒的引物组合， 引物组合包括检测口蹄疫病毒的第1引物对、 检测轮状 病毒的第2引物对、 检测乙脑病毒的第3引物对、 检测猪蓝耳病毒的第4引物对、 检测猪伪狂 犬病毒的第5引物对以及检测猪瘟病毒的第6引物对中的至少一种； 第1-6引物对的碱基序 列分别如SEQ ID No.1-12所示。 0045 上述的检测病毒的引物组合在检测注射用骨肽中口蹄疫病毒、 轮状病毒。

17、、 乙脑病 毒、 猪蓝耳病毒、 猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒中的应用。 0046 进一步地， 上述的应用， 包括以待检样本为模板进行PCR反应； 第1-6引物对的退火 温度为58-63。 0047 选择58-63的退火温度， 能扩增出较好的目的条带， 避免扩增出非特异的条带干 扰实验结果， 将微量的模板放大， 利于检测。 0048 上述检测病毒的引物组合在制备病毒检测试剂盒中的应用。 0049 一种检测病毒的检测试剂盒， 检测试剂盒包括上述的检测病毒的引物组合。 0050 进一步地， 还包括PCR反应缓冲液、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 2Super Real PreMix、 荧光试剂、 。

18、目的片段标准品和Mg2+中的至少一种。 0051 试剂盒中， 包括进行普通PCR的试剂， 可以对病毒样本进行先期的定性分析； 同时， 试剂盒中还包括进行荧光定量PCR的试剂， 选用荧光定量PCR的试剂可以对病毒样本进行定 量分析； 另外， 试剂盒中还包括目的片段标准品， 可在检测待检样本的时候， 作为阳性对照。 0052 进一步地， 荧光试剂包括SYBR Green I或者SYBR Green。 0053 SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染 料。 在游离状态下， SYBR Green I发出微弱的荧光， 但一旦与双链DNA结合后， 荧光大大增。

19、 说明书 3/8 页 5 CN 107385115 A 5 强。 因此， SYBR GreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关， 可以根据荧光信号检测出 PCR体系存在的双链DNA数量。 SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm， 发射波长最大约为 520nm。 0054 SYBR Green II染料是一种高敏感的核酸染色试剂， 可以对RNA或者是单链的DNA 进行染色。 0055 进一步地， 检测试剂盒， 还包括反转录试剂。 0056 进一步地， 反转录试剂包括dNTPs、 random primer、 5MLV-RT缓冲液、 RNase抑制 剂和MLV RT反转录酶中的。

20、至少一种。 0057 由于病毒大多都是单链RNA病毒， 因此需要对病毒RNA进行反转录扩增， 通过反转 录获得相应的cDNA序列， 方便后续的荧光定量PCR反应。 0058 上述的检测试剂盒在检测病毒中的应用。 0059 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。 0060 实施例1 0061 本实施例提供一种检测病毒的引物组合， 引物组合包括检测口蹄疫病毒的第1引 物对、 检测轮状病毒的第2引物对、 检测乙脑病毒的第3引物对、 检测猪蓝耳病毒的第4引物 对、 检测猪伪狂犬病毒的第5引物对以及检测猪瘟病毒的第6引物对中的至少一种； 第1-6引 物对的碱基序列分别如SEQ ID No。

21、.1-12所示。 0062 实施例2 0063 本实施例提供一种检测病毒的检测试剂盒， 该检测试剂盒包括实施例1提供的检 测病毒的引物组合。 0064 实施例3 0065 本实施例提供一种检测病毒的检测试剂盒， 该检测试剂盒包括实施例1提供的检 测病毒的引物组合。 0066 当然， 本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂， 包括PCR反应缓冲液、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 2Super Real PreMix、 2SYBR green I和Mg2+中的至少一种。 0067 实施例4 0068 本实施例提供一种检测病毒的检测试剂盒， 该检测试剂盒包括实施例1提供的检 测病毒的引物。

22、组合。 0069 当然， 本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂， 包括PCR反应缓冲液、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 2Super Real PreMix、 2SYBR green II和Mg2+中的至少一种。 0070 实施例5 0071 本实施例提供一种检测病毒的检测试剂盒， 该检测试剂盒包括实施例1提供的检 测病毒的引物组合。 0072 当然， 本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂， 包括PCR反应缓冲液、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 2Super Real PreMix、 2SYBR green I和Mg2+中的至少一种。 0073 当然， 本试剂盒还包。

23、括反转录试剂包括dNTPs、 random primer、 5MLV-RT缓冲液、 RNase抑制剂或MLV RT反转录酶中的至少一种。 0074 实施例6 0075 本实施例提供一种检测病毒的检测试剂盒， 该检测试剂盒包括实施例1提供的检 说明书 4/8 页 6 CN 107385115 A 6 测病毒的引物组合。 0076 当然， 本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂， 包括PCR反应缓冲液、 Taq DNA聚合酶、 dNTPs、 2Super Real PreMix、 2SYBR green I、 2SYBR green II和Mg2+中 的至少一种。 0077 当然， 本试剂盒还。

24、包括反转录试剂包括dNTPs、 random primer、 5MLV-RT缓冲液、 RNase抑制剂或MLV RT反转录酶中的至少一种。 0078 本实施例提供的试剂盒的使用方法， 具体如下： 0079 注射用骨肽样本中病毒总RNA的提取(参考宝生物病毒总RNA提取试剂盒： UNIQ-10 柱式总RNA抽提试剂盒) 0080 1.1注射用骨肽样本1支(10mg)加入到200 L的PBS溶液中溶解， 转移到1.5mL的 RNase-free的离心管中， 得到样本溶液； 0081 1.2向步骤1.1中获得的样本溶液中加入350 LRLT溶液， 剧烈震荡， 10000rpm离心 2min， 取上清。

25、至另外一个1.5mL的RNase-free的离心管中； 0082 1.3加入1/2体积的无水乙醇， 混匀， 得到样本混合溶液(即使有沉淀也无需离心)； 0083 1.4将吸附柱放入收集管， 将步骤1.3中的样本混合溶液移至吸附柱中， 静置2min， 8000rpm离心1min， 弃废液； 0084 1.5将吸附柱重新放回收集管， 加入500 L RW Solution， 静置1min， 10000rpm离心 1min， 倒掉收集管中废液； 0085 1.6将吸附柱放回收集管中， 加入500 l RPE Solution， 静置2min， 10000rpm离心 1min， 倒掉收集管中废液， 并。

26、重复本操作一次； 0086 1.7将吸附柱放回收集管中， 10000rpm离心2min； 0087 1.8将吸附柱放入RNase-free的1.5ml离心管中， 在吸附膜中央加入30-50 LDEPC- treated ddH2O， 静置5min， 12000rpm离心2min， 将所得到的RNA溶液置于-70保藏备用。 0088 样本cDNA的合成 0089 2.1以步骤1.8获得总RNA为模板， 在Microtube管中加入Random 6mers(50 M)1 L， dNTP Mixture(10mM each)1 L， 模板RNA Total RNA： 8 L， RNase free 。

27、dH2O加至总体积10 L； 在65条件下保温5min后， 冰上迅速冷却； 进行反转录， 取变性后反应液10 L， 加入5 PrimeScript II Buffer 4 L， RNase Inhibitor(40U/ L)0.5 L(20U)， PrimeScript II RTase(200U/ L)1 L， RNase free dH2O加至总体积20 L， 慢混匀。 0090 2.2在30处理10min， 42处理3060min； 0091 2.3在95条件下孵育5min； 0092 2.4反应结束后， 获得病毒样本基因组cDNA， 取出后置于冰上3-5min， -20保存备 用。 0。

28、093 病毒样本标准曲线的建立 0094 口蹄疫病毒、 轮状病毒、 乙脑病毒、 猪蓝耳病毒、 猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒的阳性 标准品的制备、 检测方法的建立。 0095 3.1以NCBI数据库公布的口蹄疫病毒、 轮状病毒、 乙脑病毒、 猪蓝耳病毒、 猪伪狂犬 病毒和猪瘟病毒的保守序列， 并合成到pUC57载体上； 0096 3.2以步骤2.1中得到的口蹄疫病毒、 轮状病毒、 乙脑病毒、 猪蓝耳病毒、 猪伪狂犬 说明书 5/8 页 7 CN 107385115 A 7 病毒和猪瘟病毒的保守序列重组质粒作为阳性标准品， 将重组质粒标准品为模板， 用SYBR Green II试剂采用两步法进行PCR，。

29、 绘制熔解曲线； 0097 3.3最佳引物浓度的确定： 以3.7105copies/ L重组质粒标准品为模板， 分别用 0.2 L、 0.4 L、 0.6 L、 0.8 L和1.0 L的本实施例中提供的引物组合， 每个引物组合的浓度10 mol/L； 进行PCR反应； 0098 3.4最佳退火温度的确定： 分别取稀释到1105copies/ L阳性质粒标准品为模 板， 分别以56、 57、 58、 59、 60.0、 61、 62、 63、 64、 65为退火温度对病毒 进行PCR扩增， 以确定最佳退火温度； 0099 3.5标准曲线的建立： 以重组质粒为标准品， 紫外分光光度计测定阳性标准品。

30、的 OD260值， 根据阳性标准品的分子量与质量浓度， 计算其拷贝浓度， 调整浓度后做10倍梯度稀 释， 口蹄疫病毒重组质粒最终的浓度分别依次为3.8101copies/ L-3.8106copies/ L； 轮状病毒重组质粒最终的浓度分别依次为4.96102copies/ L-4.96108copies/ L； 乙脑 病毒重组质粒最终的浓度分别依次为2.0102copies/ L-2.0107copies/ L； 猪蓝耳病病 毒重组质粒最终的浓度分别依次为3.3101copies/ L-3.3107copies/ L和3.3 109copies/ L； 猪伪狂犬病毒重组质粒最终的浓度分别依次。

31、为2.6102copies/ L-2.6 108copies/ L； 猪瘟病毒重组质粒最终的浓度分别依次为3.8102copies/ L-3.8 107copies/ L。 系列标准模板， 采用优化好的条件进行SYBR Green实时荧光定量PCR， 得 到各自的Ct值， 以Ct值为纵坐标， 以起始模板浓度的对数为横坐标， 建立标准曲线。 0100 荧光定量PCR 0101 4.1荧光定量PCR反应体系： 以2 L阳性标准品或待检样品或双蒸水为模板， SYBR Premix Ex Taq10 L、 ROX Reference Dye0.5 L， 第1-6引物对的上下游引物各0.6 L， Nuc。

32、lease-Free Water补足到20 L； 0102 如图1所示为口蹄疫病毒标准品的熔解曲线， 熔解曲线具有窄且尖的单峰， 熔解温 度为(890.4)， 表明检测口蹄疫病毒的引物对具有特异性扩增性能。 0103 如图2所示为轮状病毒标准品的熔解曲线， 熔解曲线具有窄且尖的单峰， 熔解温度 为(820.4)， 表明该检测轮状病毒的引物对具有特异性扩增性能。 0104 如图3所示为乙脑病毒标准品的熔解曲线， 熔解曲线具有窄且尖的单峰， 熔解温度 为(880.4)， 表明检测乙脑病毒的引物对具有特异性扩增性能。 0105 结果如图4所示为猪蓝耳病毒标准品的熔解曲线， 熔解曲线具有窄且尖的单峰，。

33、 熔 解温度为(870.4)， 表明检测猪蓝耳病毒的引物对具有特异性扩增性能。 0106 结果如5所示为猪伪狂犬病毒标准品的熔解曲线， 熔解曲线具有窄且尖的单峰， 熔 解温度为(930.4)， 表明检测组伪狂犬病毒的引物对具有特异性扩增性能。 0107 结果如图6为所示猪瘟病毒标准品的熔解曲线， 熔解曲线具有窄且尖的单峰， 熔解 温度为(880.4)， 表明检测猪瘟病毒的引物对具有特异性扩增性能。 0108 可以看出， 检测均呈现单一的溶解峰， 在同样的温度下， 扩增产物单一产物， 无非 特异性扩增， 特异性较好。 0109 结果如图7所示， 口蹄疫病毒的以SYBR Premix Ex Taq。

34、10 L、 ROX Reference Dye0.5 L、 上下游引物各0.6 L、 模板(质粒或cDNA)2 L、 Nuclease-Free Water补足至20 L。 采用两步法PCR， 反应条件为:95变性2min； 95变性15s， 63退火1min， 扩增40个循 说明书 6/8 页 8 CN 107385115 A 8 环； 结果各浓度有很好的线性关系， 阴性对照无扩增反应， 以PCR反应循环阈值为纵坐标， 以 模板拷贝数的对数值为横坐标， 得到标准曲线方程为Y-3.8739X+33.136； R20.9894。 0110 结果如图8所示， 轮状病毒的标准曲线为： 标准曲线方程为。

35、Y-3.3446X+37.756； R20.9962。 0111 结果如图9所示， 乙脑病毒的标准曲线为： 标准曲线方程为Y-3.1175X+30.343； R20.9992。 0112 结果如图10所示， 猪蓝耳病毒的标准曲线为： 标准曲线方程为Y-3.1493X+ 34.292； R20.9964。 0113 结果如图11所示， 猪伪狂犬病毒的标准曲线为： 标准曲线方程为Y-3.6525X+ 40.293； R20.9916。 0114 结果如图12所示， 猪瘟病毒的标准曲线为： 标准曲线方程为Y-4.004X+31.935； R20.9826。 0115 实验例1 0116 本实验例提供。

36、验证实施例6提供的试剂盒的灵敏度和阳性判定。 0117 灵敏度实验 0118 取实施例6中的6种病毒重组质粒为模板， 并测得重组质粒浓度； 将重组质粒以10 倍梯度进行8个梯度的稀释， 口蹄疫病毒重组质粒最终的浓度分别依次为3.8101copies/ L-3.8106copies/ L； 轮状病毒重组质粒最终的浓度分别依次为4.96102copies/ L- 4.96108copies/ L； 乙脑病毒重组质粒最终的浓度分别依次为2.0102copies/ L-2.0 107copies/ L； 猪蓝耳病病毒重组质粒最终的浓度分别依次为3.3101copies/ L-3.3 107copies。

37、/ L和3.3109copies/ L； 猪伪狂犬病毒重组质粒最终的浓度分别依次为2.6 102copies/ L-2.6108copies/ L； 猪瘟病毒重组质粒最终的浓度分别依次为3.8 102copies/ L-3.8107copies/ L。 进行PCR试验， PCR试验参考实施例6。 0119 如图13-18所示， 所有检测病毒的引物对， 在低至几十或者上百个拷贝低浓度样本 都能检测到， 说明设计的引物具有较高的灵敏度。 0120 检测样品在实时荧光定量RT-PCRCt值30,则结果判定为阳性。 0121 实验例2 0122 本实验例提供对产品样本进行检验。 0123 对生产的三个。

38、批次的注射用骨肽产品进行检验。 0124 采用实施例6提供的总RNA提取、 反转录和荧光定量PCR方法对样本进行检验， 分别 用检测6种病毒的引物对进行荧光定量PCR检测。 0125 根据荧光定量PCR结果， 并通过6种病毒的标准曲线计算， 得出待检样本的Ct值， 结 果显示三个批次的产品Ct值30， 说明三个批次的产品检测结果未影响， 产品安全可靠。 0126 综上所述， 本发明实施例提供的检测病毒的检测引物具有较好的特异性和较高的 灵敏度， 使用该检测引物应用于检测口蹄疫病毒、 轮状病毒、 乙脑病毒、 猪蓝耳病毒、 猪伪狂 犬病毒和猪瘟病毒， 以及应用于制备检测上述病毒的试剂盒， 都具有较。

39、好的特异性和较高 的灵敏度； 检测上病毒的试剂盒方便提取病毒的核酸并进行鉴定， 具有较高的实用性和较 高的推广应用价值。 0127 以上所描述的实施例是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 本发明的实 说明书 7/8 页 9 CN 107385115 A 9 施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围， 而是仅仅表示本发明的选定实施 例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。 说明书 8/8 页 10 CN 107385115 A 10 SEQUENCE LISTING 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司。

40、、 哈尔滨珍宝制药有限公司 一种检测病毒的引物组合及应用、 试剂盒 12 PatentIn version 3.5 1 21 DNA 人工序列 1 ttacaaacct gtgatggcct c 21 2 24 DNA 人工序列 2 cgcaggtaaa gtgatctgta gctt 24 3 22 DNA 人工序列 3 actccatatg cgaactcgac ac 22 4 20 DNA 人工序列 4 tcctgttggc caccctttag 20 5 20 DNA 人工序列 5 cagatcccta gcgaagatcg 20 6 20 DNA 序列表 1/2 页 11 CN 10。

41、7385115 A 11 人工序列 6 tcatggatag gcgtttaggg 20 7 20 DNA 人工序列 7 gtgccagatg ctgggtaaga 20 8 20 DNA 人工序列 8 gacgacagac acaattgccg 20 9 20 DNA 人工序列 9 agaacgtcat cgtcacgacc 20 10 20 DNA 人工序列 10 ggtcaccttg tggttgttgc 20 11 20 DNA 人工序列 11 aacgagatag ggctgttggg 20 12 20 DNA 人工序列 12 gtgggtaaag ccctcttggg 20 序列表。

42、 2/2 页 12 CN 107385115 A 12 图1 图2 说明书附图 1/9 页 13 CN 107385115 A 13 图3 图4 说明书附图 2/9 页 14 CN 107385115 A 14 图5 图6 说明书附图 3/9 页 15 CN 107385115 A 15 图7 图8 说明书附图 4/9 页 16 CN 107385115 A 16 图9 图10 说明书附图 5/9 页 17 CN 107385115 A 17 图11 图12 说明书附图 6/9 页 18 CN 107385115 A 18 图13 图14 说明书附图 7/9 页 19 CN 107385115 A 19 图15 图16 说明书附图 8/9 页 20 CN 107385115 A 20 图17 图18 说明书附图 9/9 页 21 CN 107385115 A 21 。