技术领域
本发明属于基因工程与遗传育种领域，涉及到一种用于筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关SNP标记的引物对。
背景技术
牡蛎是一种重要的海洋水产资源，也是世界上最重要的海水养殖贝类之一。我国牡蛎养殖规模和产量多年都稳居世界首位，但是长期以来，我国牡蛎只能自产自销，难以进入高端市场。究其原因，主要是由于在养殖和繁育过程中，只注重牡蛎的高产高量，忽视了其营养品质的含量。而糖原等营养物质的高含量是牡蛎最主要的特色之一，其不仅影响牡蛎的肥满度和产量，同时影响着牡蛎消费口感，是牡蛎产品品质的重要组成部分。所以提高糖原等营养品质的含量并进行遗传改良，是解决我国牡蛎产业高产低效现状的重要途径。
水产动物育种研究起步晚，且目前主要采用传统的群体选育方法，构建家系，其主要弊端在于育种周期长，见效慢。而近年来，随着育种技术发展，分子标记辅助选育以及全基因组选择等逐渐应用于水产动物育种，大大提高了贝类的遗传育种水平，相比较于传统育种，显著提升了性状的选育效率和精度。同时利用分子标记辅助选择可以减少盲目性，缩短育种年限，提高育种的效率。而进行分子育种关键是获得可靠的分子标记。目前普遍采用的手段是性状的QTL定位及全基因组关联分析GWAS。虽然QTL定位方法能够快速定位与性状相关联的染色体区段，在性状解析方面具有准确度高的特点。但其基于有限减数分裂的连锁分析，定位的基因组大片段的区域都连锁在一起，很难精确定位。而全基因组关联分析GWAS的方法则能全基因组范围内对遗传变异基因进行总体关联分析，将关联位点定位于很小的区间内，显著提高了定位的准确度和精度，尤其适用于复杂性状的遗传解析。
尽管GWAS在作物和畜禽的农业生物研究中发挥了重要作用，但在水产动物中还仅有少量报道。在贝类已有的研究中，分子标记开发主要集中已知的功能基因上，标记相对数目不多，且不一定能获得主效位点，无法对表型的遗传调控机制有一个全面的认识。迄今为止，还未有基于全基因组关联分析获得主效位点的相关报道。但随着长牡蛎全基因组测序的完成以及高密度遗传连锁图谱的获取，本研究团队率先进行了牡蛎关键品质性状的GWAS分析，获得影响品质性状的关键位点及其基因，其中包括控制糖原含量的主效多态性位点及关键基因。而本发明在全基因组关联分析的基础上，开发海量SNP标记，解析决定牡蛎糖原含量的遗传基础，筛选出与糖原含量极显著相关的SNP标记，用于筛选高糖原含量个体。与以往开发的单个SNP位点相比，该研究结果可靠性更强，适用群体范围更广。
发明内容：
本发明的目的是提供一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记，为长牡蛎的分子标记辅助选择提供参考。
具体的获取SNP方法如下：(1)材料的收集及同质化驯养：收集486个长牡蛎野生个体，进行同质化养殖。(2)表型数据的测定：利用蒽酮比色发检测牡蛎个体糖原含量。(3)基因分型：Illumina二代测序平台，对486个牡蛎亲本进行重测序，筛查SNPs位点并进行个体分型，获得用于关联分析的有效SNPs位点。(4)关联分析：利用混合线性模型进行全基因组关联分析，获得与性状显著关联的7个SNP位点(P-value<10-6)，位于长牡蛎基因组scaffold 1597的36,512-37,583bp范围内。通过LD block分析，7个SNP位点紧密连锁(LD＞0.7)。全基因组关联分析的曼哈顿图见附图1。随后选取位于scaffold1597的36,675碱基处的1个SNP位点(P-value为2.49×10-7)，做为后续开发的SNP位点。该位点存在A和G两个碱基形式。位于scaffold 1597的35,512-37,583kb范围内的其它SNP位点都应用相同的鉴定方法。
本发明通过以下技术方案得以实现：
一种与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记：该标记位于长牡蛎基因组scaffold1597的36,675碱基出，此碱基存在A和G两个碱基形式。所述该位点上下游500kb的序列如SEQ ID No.1所示。主要检测步骤如下：
1、DNA采用酚-氯仿抽提法，具体步骤如下：
1)取1.5ml离心管，加入700μl DNA提取缓冲液(100mM Tris-HCl，5mM EDTA)，取3-10mg的牡蛎鳃组织，用剪刀剪碎。所用器皿在两个个体之间必须用火焰灭菌和ddH2O冲洗以防个体间的交叉污染。加入35μl SDS，混匀。加入2μl蛋白酶K，混匀。
2)将离心管在65℃金属浴中孵育，1.5小时后每管补加2μl蛋白酶K，期间轻轻摇动离心管组织完全消化后继续孵育半小时以上，总孵育时间至少3小时。
3)将孵育后的样品冷却至室温，加入等体积的PCI，充分混匀，13000rpm离心10min。重复上述步骤一次。PCI为酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)的混合溶液。
4)将步骤3)的上清液再用氯仿：异戊醇(24:1)抽提1次，13000rpm离心5min。
5)将步骤4)的上清液移入等体积-20℃异丙醇，来回颠倒充分混匀，-20℃放置20min。
6)将步骤5)的混合液在4℃，13000rpm离心5min。小心倒出所有液体，注意不要让底部的白色沉淀颗粒移动或倒出。
7)用-20℃75％乙醇洗涤2次倒出液体，开口放置离心管晾干乙醇，待白色沉淀变为无色透明时加入50-100μl(具体看DNA的量)ddH2O来溶解DNA。置于-20℃备用。
2、利用特异引物，进行外围扩增。
取上述长牡蛎基因组DNA为模板，利用引物配制反应体系：基因组DNA 1uL，通用PCR mix 5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL；所述反应体系可同比放大；
引物为：上游引物F：5’-TCCGAACTTGGAATCCTCTC-3’
下游引物R：5’-GCAAATGTTAAGGTGGCTCA-3’
PCR扩增的反应程序为：
3、SnaPshot模板制备
在15μL PCR产物中加入5U SAP和2U ExoI震荡混匀37℃保温1hr然后75℃保温15min以灭活SAP和ExoI酶。
4、SnaPshotPCR扩增及纯化。
以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，在纯化好后，每种各取2μL混合。SNaPshot PCR具体步骤为：
特异引物序列为：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTGAGAATTGTAAACCACACACGG-3’
产物纯化：在10μL上述SNaPshot PCR产物中加入1U SAP，震荡混匀，37℃保温1hr，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24hr或-20℃长期保存。
5、毛细管电泳。
1)电泳样品制备：首先将SNaPshot产物稀释20倍：
95℃变性5min，后迅速冰冷4min。
2)毛细管电泳。使用3730XLDNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号。环境条件：实验室温度：18-25℃；毛细管长度：50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kV。结果使用GeneMapper V4.0对实验结果进行分析。判断不同基因型。
与长牡蛎糖原含量相关的SNP标记的潜在应用：到目前为止，除本专利外，在牡蛎中，尚未有基于全基因组关联分析开发SNP标记的报道。本研究结果相对于以往开发的SNP标记，可信度更高，适应群体的范围更广，效果更稳定。在苗种繁育前，通过非致死性取样提取牡蛎基因组DNA，利用如上述所述的SNP标记及其鉴定方法判断亲贝基因型，通过筛选GG基因型亲贝有效提高后代长牡蛎糖原含量。
附图说明
图1是上述长牡蛎糖原含量全基因组关联分析的曼哈顿图。
具体实施方式：
以下结合实施例来进一步阐释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1：
a)样品的采集：采集胶南同时孵苗的野生群体288个个体，对其进行解剖，取闭壳肌和剩余组织，用液氮速冻后于-80℃保存备用。
b)DNA的提取：提取288个样本的基因组DNA并使用紫外吸光光度法测定浓度，根据测定浓度使用灭菌水将基因组DNA稀释至10-20ng/uL；
c)利用SnaPshot进行SNP位点基因型检测：(1)利用特异引物，进行外围扩增。取上述长牡蛎基因组DNA为模板，利用引物F和R配制反应体系：基因组DNA 1uL，通用PCR mix 5uL，引物F和R各0.2uL，灭菌双蒸水3.6uL；所述反应体系可同比放大；引物序列为：
上游引物F：5’-TCCGAACTTGGAATCCTCTC-3’
下游引物R：5’-GCAAATGTTAAGGTGGCTCA-3’
PCR扩增的反应程序为：
(2)SnaPshot模板制备。在15μL PCR产物中加入5U SAP和2U ExoI震荡混匀37℃保温1hr然后75℃保温15min以灭活SAP和ExoI酶。
(3)SnaPshotPCR扩增及纯化。以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，在纯化好后，每种各取2μL混合。SNaPshot PCR具体步骤为：
特异引物序列为：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTGAGAATTGTAAACCACACACGG-3’
产物纯化：在10μL上述SNaPshot PCR产物中加入1U SAP，震荡混匀，37℃保温1hr，75℃保温15min以灭活酶，4℃可保存24hr或-20℃长期保存。
(4)毛细管电泳。电泳样品制备：首先将SNaPshot产物稀释20倍：
95℃变性5min，后迅速冰冷4min。使用3730XLDNA Analyzer对制备好的样品进行毛细管电泳并搜集信号。环境条件：实验室温度：18-25℃；毛细管长度：50cm；加热炉温度：60℃；运行电压：15kV。结果使用GeneMapper V4.0对实验结果进行分析。判断不同基因型。
d)结果分析:检测后，有第86个个体基因型为G/G，141个个体基因型为A/G，61个个体基因型为A/A。
e)糖原含量的检测：图中数据显示，不同基因型糖原含量的顺序为GG>AG>AA。GG基因型糖原含量相较于AA型，提高4.5％。所以，该位点的分型与糖原含量是显著关联的。育种中通过筛选GG型个体，可以显著提高后代糖原含量。
表1：288个个体糖原含量和基因分型分析。
序列表(1)SEQ ID NO.1的信息序列特征长度：1001bp
类型：核酸
链型：单链
拓扑结构：线形
分子类型：DNA
来源：长牡蛎
序列描述：
>scaffold1597
CAATGGTTTTTTTTTTACTACTACCTCAGAATTAAAAAATTGTACATCTGATACAAAATGGCGGGGCAGGGTGCGGTCTAGCGGTGGAGTTTAATATCCTTGATGTGGATAAAAAGCAATTAGTGGAACTGTCAGAGAAGAGAAAAATGGCGATGTTTCTTCGATTCGCAAATCATATGCCTGACAGGTTCTCAAATTTTACAATTTACGATTTATTGGCCTTGATTTATAACAGCAGATCATTTTTGGTCAATGTCCCGAGTGTCTTGTTTCTGTACTGAGCAGCCACGCGTGCACAATAGTAATTTCCGAACTTGGAATCCTCTCATATCGGCGAAGACGGGCCGAAAATAACTGATACCGCGAATAGTCAAAAAATGTCTGTTAACAGTGAAGCGTTAACAGTGAAATTTTGCACCATCTTTTTCAAAACGTCCCATCTTCAGCAACATTTGACTGTTTAGTGTTGTTTAAAAGAGAACGATGTCCAATAGGTTTTTACCGTGTGTGGTTTACAATTCTCCCTATAATTCTCCTTCCCACAGGGCCGTAGATTACGGGTCGGCGGAACATAAGCGGGCCTCAACCATGCCGTCACAGGGTTCACTGTTCACCAATTTTGAGGAAGTTCAGGTAAGATCTCACCTTTGGCAATCTAATATACTAGTAGCAGTATCCTAGTGAGCCACCTTAACATTTGCTTTTCGTTTTTGAAGATTTTGAAACAGACCAAAAAAAATATCATGTTCATTTCATCATTTTGAGAATTTTGAATTAACTAGATAAATAAGTGTAAATACAAAATTTACAATTTTTAAAACAAAGTATACTTGTATTGTGTGAAAATACATAGTTATTTCTAGCCCTGAAAAACTAAAAATATACACTTGTAGTATGTATTATAGATCGTGTGTCGTGGGAATATTTTGGGAAAACTGTGGTTTCAACATTATTTATAGGCATCAATTTAGAAATTAAAGCACAGTTACAAACTATGGTTA。
本发明SNP位点在基因组DNA中存在A和G两个等位基因形式；其上下游500bp核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。实施结果表明利用该方法可以准确检测该SNP位点，筛选高糖原含量个体。同时该位点GG基因型个体相比较于AA基因型个体，糖原含量显著提高4.5％。后续可以通过该方法，筛选GG基因型的亲贝，指导牡蛎育种。本发明提供了一个筛选长牡蛎高糖原含量个体的SNP标记开发及其潜在应用，其有益效果在于可以在苗种繁育前对亲贝进行基因型鉴定，提高子代糖原含量。本研究结果获得SNP标记可信度更高，适应群体的范围更广，效果更稳定。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种用于筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关SNP标记的引物对
<141> 2017-09-20
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1001
<212> DNA
<213> gene
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1001)
<400> 1
caatggtttt ttttttacta ctacctcaga attaaaaaat tgtacatctg atacaaaatg 60
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