一种木脂素类化合物及其制备方法、鉴定方法和应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101429107 B (45)授权公告日 2013.03.20 CN 101429107 B *CN101429107B* (21)申请号 200810233600.7 (22)申请日 2008.11.18 C07C 43/253(2006.01) C07C 41/34(2006.01) A61K 31/09(2006.01) A61P 31/18(2006.01) (73)专利权人 云南民族大学 地址 650031 云南省昆明市一二一大街 134 号 (72)发明人 李干鹏 范逸平 董秀华 杨海英 (74)专利代理机构 昆明协立知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 。

2、) 53108 代理人 旃习涵 吴平 US 6020384 A,2000.02.01, CN 1634031 A,2005.07.06, CN 101168551 A,2008.04.30, (54) 发明名称 一种木脂素类化合物及其制备方法、 鉴定方 法和应用 (57) 摘要 本发明涉及新颖的通式 (I) 的木脂素类化 合物， 其中的 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15， 16， 17， 18 分别表示 C1， C2， C3， C4， C5， C6， C7， C5， C8， C9， C10， C11， C12， C13， C14。

3、， C15， C16， C17， C18。 本发明还涉及从五味子中分离出新颖的 木脂素类化合物的制备方法和鉴定方法。 同时， 本 发明还涉及该化合物在制备抗 HIV 活性的药物中 的应用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李勇 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 8 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 8 页 1/1 页 2 1. 下述通式 （） 化合物 ： 其中 ： 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 分别表示C1,C2， C3,C4,C5, C6,。

4、C7,C5, C8,C9,C10, C11,C12,C13, C14,C15, C16,C17,C18 。 2. 权利要求 1 化合物的制备方法， 其特征在于 ： 该方法包括下述步骤 ： （1） 以鹤庆狭叶五味子 （S. wilsoniana ） 为原料， 将五味子果实粉末用乙酸乙酯浸提 三次， 每次 5 天， 期间每隔 3 小时超声一次， 一次 1 小时 ； 合并提取液减压蒸馏至浸膏， 浸膏 用它体积的一半的氯仿溶解与硅胶拌样， 搅拌均匀后将溶剂挥干， 碾磨均匀 ； （2） 用硅胶干法填充层析柱， 用 1:0 0:1 的氯仿 : 丙酮梯度洗脱， 收集各部份洗脱液 ； （3） 将洗脱液用高效液。

5、相色谱法分离纯化， 根据紫外检测器谱峰收集目标级分 ； （4） 目标级分浓缩干燥后， 得到所需的化合物单体。 3. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于 ： 在步骤 （2）中所用的硅胶规格是 200 300 目。 4. 权利要求所述化合物在制备抗 HIV 活性的药物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101429107 B 2 1/5 页 3 一种木脂素类化合物及其制备方法、 鉴定方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及木脂素类化合物， 更具体地说， 本发明涉及一种从五味子中分离出的 新颖的木脂素类化合物。 同时， 本发明还涉及所述化合物的鉴定方法、 制备方法及其在药物 制备中的。

6、应用。 背景技术 0002 五味子科 (Sehisandraeeae) 植物全世界共有 50 种， 分布于亚洲东南部和北 美东南部。我国约 29 种， 主产于西南部和中南部。五味子科包括两个属， 即五味子属 (Sehisandra) 和南五味子属 (Kadsura)。中国药典中记载的五味子和南五味子分别为五味 子属的五味子S.chinensis(Turcz.)Baill.和华中五味子S.sphenanthera Rehd.et Wils. 的果实， 是传统的滋补强壮药， 具收敛固涩、 益气生津、 补益宁心之功效。本草考证， 五味子 始载于 神农本草经 列为上品。 图经本草 记载 ：“五味皮肉甘。

7、甜， 核中辛苦， 都有咸味， 此则五味俱也。 ” 故名五味子， 一直沿用至今。木脂素是五味子科植物中的主要生物活性成 分， 结构类型多， 立体化学复杂。 0003 迄今为止从该科植物中分离得到的木脂素有近 200 个， 根据骨架类型可分为五 大类 ： I. 联苯环辛烯类 (dibenzocyclooctadinenes)， II. 螺苯并呋喃型联苯环辛烯类 (spirobenzofuranoid dibenzocyclooctadienes)， III. 芳基四氢萘类 (aryltetralins)， IV. 二芳基丁烷类 (diarylbutanes)， V. 四氢呋喃类 (tetrahyd。

8、rofurans)。它们大多具有 抑制中枢神经， 降低血清转氨酶， 抗癌， 抗HIV， 抗胃溃疡， 抗过氧化等作用。 而近年来开发新 药的一个主要的途径就是从传统药物中寻找活性成分， 并根据它们的结构进行人工合成或 以此为先导物合成一系列衍生物， 从中找出有效的药物。治疗肝炎药物联苯双酯就是在研 究五味子有效成分化学结构基础上， 进行人工合成中产生的。然而传统的分离方法有出层 析法、 后来发展到采用柱层析和中压液相色谱结合的方法， 它们存在者消耗试剂量大， 很难 提纯化合物， 消耗时间长等缺点， 并且这些方法很难分离出新化合物， 就算发现了效率也是 非常低。这是本技术领域中一个长期存在的技术难。

9、题。 发明内容 0004 本发明目的是针对现有技术的不足， 提供一种木脂素类新的化合物。本发明另一 个目的在于提供所述新化合物的制备方法与其化学结构的鉴定方法。同时， 本发明目的还 在于对所述化合物的药物活性进行研究， 以期寻找抗肿瘤或抗 HIV 活性强的化合物。 0005 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。 0006 A. 本发明提供了一种新的木脂素类化合物， 该化合物用下述通式 (I) 表示 ： 0007 说 明 书 CN 101429107 B 3 2/5 页 4 0008 其中 ： 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12， 13， 14， 15，。

10、 16， 17， 18 分别表示 C1， C2， C3， C4， C5， C6， C7， C5， C8， C9， C10， C11， C12， C13， C14， C15， C16， C17， C18。 0009 B. 本发明提供了一种所述化合物的制备方法， 该方法包括下述步骤 ： 0010 1. 以鹤庆狭叶五味子 (S.wilsoniana) 为原料， 将五味子果实粉末用乙酸乙酯浸 提三次， 每次 5 天， 期间每隔 3 小时超声一次， 一次 1 小时 ； 合并提取液减压蒸馏至浸膏， 浸 膏用它体积的一半的氯仿溶解与硅胶拌样， 搅拌均匀后将溶剂挥干， 碾磨均匀 ； 0011 2.用硅胶干法填。

11、充层析柱， 用氯仿:丙酮(1:00:1)梯度洗脱， 收集各部份洗脱 液 ； 0012 3. 将洗脱液用高效液相色谱法分离纯化， 根据紫外检测器谱峰收集目标级分 ； 0013 4. 目标级分浓缩干燥后即可得到所需的化合物单体。 0014 其中， 在步骤 (2) 中所用的硅胶规格是 200 300 目 ； 步骤 (3) 中的洗脱液选择 9:1 和 8:2 部分。 0015 C. 本发明提供了一种对所述化合物的结构进行鉴定的方法， 该方法包括以下步 骤 ： 0016 1. 本发明制备得到的白色粉末，-5.44， EIMS 显示分子离子峰 m/z404 结合 NMR 谱， 确定分子式为 C22H28O。

12、7， 并经高分辨 ESIMS 谱 (M+Na+， m/z427) 证实不饱和度为 9 ； 0017 2.HPLC-UV在240.8具有联苯环辛烯木脂素的特征吸收， IR(KBr)光谱显示存在羟 基 (3347cm-1)， 芳环和双键 (1640， 1600， 1500cm-1)， 1H 和13C NMR 谱说明分子中有两个苯环， 4 个甲氧基 (C135.9， 135.8， 135.6， 135.4)， 2 个甲基 (H0.73， 3H， d， 1.38， 3H， s)， 一个季 碳 (C72.8)， 一个次甲基 (C41.79)， 两个亚甲基 (C39.2， 34.2) 和两个羟基 ； 00。

13、18 3. 与已知的木脂素类化合物波谱数据比较确定该化合物为联苯环辛烯木脂素， 经 HMBC 谱 H-17 与 C-6、 C-7 和 C-8 相关， H-18 与 C-7、 C-8 和 C-9 相关， 两个羟基氢分别与 C-11、 C-12、 C-13 和 C-6、 C-7、 C-8 相关说明两个甲基分别位于 C-7、 C-8 上， 两个羟基分别 位于 C-12、 C-7 上 ； 0019 4.CD 谱在 250nm 处有很强的负 Cotton 效应， 结合 ROESY 和 COSY 确定化合物的联 说 明 书 CN 101429107 B 4 3/5 页 5 苯为 M 螺旋， 即构型为 S 。

14、构型， 此化合物与已知化合物 gomisin J 相似， 但是此化合物 C-1 和 C-3 上的取代基刚好与 gomisin J 相反， 并且此化合物 C-7 上还有一个羟基。 0020 综合上述分析， 确定了新化合物的结构为通式 (I) 所示， 经文献检索证实该化合 物为一种新化合物。 0021 D. 本发明提供了所述新化合物的抗 HIV 活性实验 ： 0022 本发明对新化合物做了 HIV 感染细胞的保护作用试验 ： 将 8105/mLMT4细胞 50L/ 孔接种到含有 100L/ 孔倍比稀释化合物的 96 孔细胞培养板上， 培养板的一半孔 加入 50L 的 HIV-1IIIB稀释 (M.。

15、O.I.0.006)， 另一半孔加入 50L 培养基。每个浓度梯度 2个重复孔， 同时设置不含化合物的对照孔和空白对照孔， 37， 5CO2培养， 第三天每孔补 加100L新鲜培养基， 第五天或第六天采用MTT比色法检测细胞存活率。 ELx800 ELISA仪 测定 OD 值， 测定波长为 595nm， 参考波长为 630nm。按 Reed&Muench 法计算出化合物抑制病 毒的50有效浓度(EC50)， 50抑制细胞生长浓度(CC50)及抗HIV-1活性的治疗指数TI值 (Therapeutic index)， 结果如表 1 所示。实验结果表明， 本发明提供的新化合物显示出较 显著的抗 H。

16、IV 活性， 其选择指数有值得深入研究的价值， 有可能成为抗艾滋病的后选药物 或后选药物的先导化合物， 预示了良好的药用前景。 0023 表 1. 本发明的化合物抗 HIV 活性试验结果 0024 0025 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果 ： 0026 本发明提出了一种高效的分离方法。此法至今尚未见到有关报道。本发明提供的 方法步骤简单、 效率高、 直观、 重现性好、 出新率高。高效液相色谱分析表明， 采用该方法制 备的木脂素类新化合物纯度高达 99以上。 附图说明 0027 图 1 为本发明的工艺流程示意图 ； 0028 图 2 为本发明粗提物的 HPLC 图 ； 0029 图 3。

17、 为经高效液相色谱法纯化后的 HPLC 图 ； 0030 图 4 为新化合物的 ESIMS 图 ； 0031 图 5 为新化合物的 1HNMR 图 ； 0032 图 6 为新化合物的 13CNMR 图 ； 0033 图 7 为新化合物 HMBC 图 ； 0034 图 8 为新化合物的 COSY 图 ； 0035 图 9 为新化合物的 ROESY 图。 说 明 书 CN 101429107 B 5 4/5 页 6 具体实施方式 0036 通过下面给出的具体实施例， 可以进一步清楚地了解本发明。但它们并不是对本 发明保护范围的限定。 0037 实施例 1 0038 鹤庆狭叶五味子 (S.wilso。

18、niana) 的提取和粗分离 0039 将鹤庆狭叶五味子S.wilsoniana的果实干燥、 粉碎过80目筛， 用十倍于其体积的 乙酸乙酯浸泡提取三次， 每次 5 天， 期间每隔 3 小时超声一次， 一次 1 小时， 合并提取液减压 蒸馏浓缩至浸膏， 浸膏用它体积一半的氯仿溶解与硅胶拌样， 搅拌均匀后将溶剂挥干， 碾磨 均匀 ； 用硅胶干法填充层析柱， 用氯仿:丙酮为1:0洗脱， 收集洗脱液， 将洗脱液部分减压蒸 馏浓缩近干， 用适量的甲醇溶解， 过 0.45m 滤头到进样瓶中， 用 75的甲醇划段， 收集每 一段， 浓缩干燥， 重复上述操作， 降低甲醇比例直到将每个峰分开， 即可得到各化合物。

19、单体。 0040 实施例 2 0041 重复实施例1， 用氯仿:丙酮(9:1和8:2)洗脱， 收集各部分洗脱液， 将洗脱液部分 减压蒸馏浓缩近干， 用适量的甲醇溶解， 过 0.45m 滤头到进样瓶中， 用 75的甲醇划段， 收集每一段， 浓缩干燥， 重复上述操作， 降低甲醇比例直到将每个峰分开， 即可得到新化合 物单体。( 见图 2)。 0042 实施例 3 0043 重复实施例1， 用氯仿:丙酮(分别为7:3， 6:4， 5:5， 4:6， 3:7， 2:8， 1:9， 0:1)洗脱， 收集各部分洗脱液， 将洗脱液部分减压蒸馏浓缩近干， 用适量的甲醇溶解， 过 0.45m 滤头 到进样瓶中，。

20、 用 75的甲醇划段， 收集每一段， 浓缩干燥， 重复上述操作， 降低甲醇比例直到 将每个峰分开， 即可得到各化合物单体， 但不是本专利所述的新化合物。 0044 实施例 4 0045 重复实施例 1， 改变乙酸乙酯的体积， 提取次数， 天数， 超声时间， 结果同样得到相 同的化合物单体 ( 李蓉涛等采用常规方法从小花五味子中分离出 43 个化合物， 其中 4 个新 化合物， 出新率近 10， 而本法分离鹤庆五味子， 分离出 40 个化合物， 其中 20 个新化合物， 出新率为 50 )。 0046 实施例 5 0047 以鹤庆狭叶五味子 (S.wilsoniana) 为原料， 将五味子果实粉。

21、末用乙酸乙酯浸提 三次， 每次 5 天， 期间每隔 3 小时超声一次， 一次 1 小时 ； 合并提取液减压蒸馏至浸膏， 浸膏 用它体积的一半的氯仿溶解与硅胶拌样， 搅拌均匀后将溶剂挥干， 碾磨均匀。 用硅胶干法填 充层析柱， 用氯仿 : 丙酮 (9:1 和 8:2) 洗脱， 收集各部份洗脱液。将洗脱液用高效液相色谱 法分离纯化， 根据紫外检测器谱峰收集目标级分 ； 目标级分浓缩干燥后即可得到所需的化 合物单体。 0048 实施例 6 0049 实施例 3 中所述的高效液相色谱法所用的流动相为以甲醇和水的混合物为流动 相。 0050 实施例 7 0051 当两个化合物分离度不好时可以调节甲醇和水。

22、的比例， 具体方法为 ： 从甲醇含量 说 明 书 CN 101429107 B 6 5/5 页 7 80 -50不断变化， 寻找能够将化合物分开的最佳比例， 甲醇比例的变化必然要影响出峰 时间， 甲醇比例越低出峰时间越长， 为了节约时间， 本发明的特征在于采用连续进样的方法 (即计算所有峰出完所需要的时间t和第一个峰和最后一个峰之间相隔的时间t， 通过实 践未出峰前进样的次数 n (t- t)/ t)。每隔 ( t-1min) 进一次样， 这样便可以节 约因降低甲醇比例而延长的时间 )。 0052 实施例 8 0053 实施例 3 所述的高效液相色谱色谱法所用的半制备柱为 ： AgilentZ。

23、ORBAX-C18(9.4250nm、 5m)。 0054 实施例 9 0055 实施例 6 所述的高效液相色谱色谱法所用的半制备柱并不仅限于这一个厂家， 同 样适用于其他的不同厂家的半制备柱。 0056 实施例 10 0057 实施例 3 所述的高效液相色谱色谱法所用的检测波长采用三波长 (210nm、 254nm、 300nm)， 如果三个波长下的吸收峰相似、 对称性相似， 线条平滑便可判定已经分纯。 说 明 书 CN 101429107 B 7 1/8 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 101429107 B 8 2/8 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 101429107 B 9 3/8 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 101429107 B 10 4/8 页 11 图 5 说 明 书 附 图 CN 101429107 B 11 5/8 页 12 图 6 说 明 书 附 图 CN 101429107 B 12 6/8 页 13 图 7 说 明 书 附 图 CN 101429107 B 13 7/8 页 14 图 8 说 明 书 附 图 CN 101429107 B 14 8/8 页 15 图 9 说 明 书 附 图 CN 101429107 B 15 。