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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210574332.1 (22)申请日 2012.12.25 CCTCC No ： M 2012391 2012.10.08 C12N 1/14(2006.01) C12P 1/02(2006.01) A61K 36/06(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (73)专利权人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区潮王路 18 号 (72)发明人 王鸿 叶建军 赵美蓉 梅建凤 易喻 应国清 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人。
2、 黄美娟 冷红梅 (54) 发明名称 一株海洋真菌萨氏曲霉及其在制备抗肿瘤药 物中的应用 (57) 摘要 本发明提供了一株具有抗肿瘤活性的海 洋真菌萨氏曲霉 （Aspergillus sydowii） MNP12010103 及其应用。该菌株保藏于中国典 型培养物保藏中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 邮编 430072， 保藏编号 ： CCTCC No ： M 2012391， 保藏日期 2012 年 10 月 8 日。本发明的有益效 果主要体现在 ：（1） 本发明的海洋真菌萨氏曲霉 MNP12010103 营养要求简单、 容易培养 ；（2） 该菌 株的代谢产物具有抗肿瘤活性 ；（。
3、3） 该菌株的次 级代谢产物的抗肿瘤活性高， 其培养所得的发酵 液总浸膏对 HepG2 细胞、 PC12 细胞和 U937 细胞有 较强的抗肿瘤活性。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 李影 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103074234 B (45)授权公告日 2015.03.04 CN 103074234 B 1/1 页 2 1. 一 株 具 有 抗 肿 瘤 活 性 的 海 洋 真 菌 萨 氏 曲 霉 (Aspergillus sydowii) MNP12010103。
4、， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 邮编 430072， 保藏编号 ： CCTCC No ： M 2012391， 保藏日期 2012 年 10 月 8 日。 2. 权利要求 1 所述的萨氏曲霉 MNP12010103 在制备抗肿瘤药物中的应用， 其特征在于 所述抗肿瘤药物为治疗肝癌、 神经癌或淋巴癌的药物。 3. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于萨氏曲霉 MNP12010103 提取物用于制备抗肿 瘤药物， 所述萨氏曲霉 MNP12010103 提取物为乙酸乙酯提取物， 由如下方法制得 ： 将萨氏曲 霉 MNP12010103 接种至液体发酵培养。
5、基中， 于 25 35、 150 250r/min 振荡条件下培养 14 30d， 得到发酵液， 发酵液去除菌体细胞后用乙酸乙酯萃取， 浓缩挥干得浸膏， 即为所 述萨氏曲霉 MNP12010103 的乙酸乙酯提取物 ； 所述发酵培养基组成为 ： 葡萄糖 8 20g/L， 蛋白胨 1.5 3g/L， 酵母膏 0.8 2g/L， 溶剂为水 ： 人工海水体积比 1 ： 1 4 的混合物， pH 7 8。 权 利 要 求 书 CN 103074234 B 2 1/5 页 3 一株海洋真菌萨氏曲霉及其在制备抗肿瘤药物中的应用 （一） 技术领域 0001 本发明涉及一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌萨氏曲霉 （。
6、Aspergillus sydowii） MNP12010103， 及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 （二） 背景技术 0002 癌症一直都是人类难以攻克的一个难题， 寻找生理活性强的物质成为人类攻克疾 病的主要工作之一。海洋微生物代谢产物研究是近年来国际上新兴的研究课题。 0003 在海洋生态系统漫长的演化过程中， 海洋微生物形成了适应严酷生存环境的独特 机制， 进化出基因型、 代谢途径和生理生态功能的多样性， 蕴藏着大量新颖的次级代谢产 物。一些海洋来源的先导化合物已成功地开发成药物， 包括来源于海洋真菌的抗感染药 物头孢霉素 （cephalo sporins） ， 来源于海绵的抗肿瘤药物阿。
7、糖胞苷 （cytarabine， AraC） ， 抗病毒药物阿糖腺苷 （vidarabine， AraA） ， 来源于芋螺的镇痛药芋螺毒素 （ziconotide， Prialt） 等。目前， 全球还有 40 余种海洋新药批准进入临床研究。 0004 在过去的几十年， 全世界范围内已从海洋微生物中分离得到新型化合物 20000 多 种。大量研究表明， 海洋真菌的代谢产物结构类型主要有 ： 环肽类、 甾醇类、 蒽醌类、 吡喃酮 类、 缩酮类、 含羰基羟基类 （醛酮化合物、 酯和游离羧基化合、 含羟基化合物） 、 含氮类 （含硫 生物碱类化合物、 哌嗪类与喹唑类化合物、 吡咯类、 其他氮杂稠环类与。
8、吡啶类化合物、 酰胺、 胺与其他含氮化合物） 。海洋真菌产生的生物活性物质主要有 ： 抗菌活性物质、 抗肿瘤活性 物质。目前研究较多的抗肿瘤、 抑制乙酰胆碱酯酶、 抗 细菌和抗氧化等海洋真菌次级代谢 产物已成为具有生物医学意义的天然化合物丰富来源， 均具有广阔的药用前景。故从海洋 真菌的次级代谢产物中发现高活性的物质对于发现先导化合物非常的重要， 对疾病的攻克 也具有着重要的意义。 （三） 发明内容 0005 本发明目的是提供一株具有抗肿瘤活性的海洋真菌萨氏曲霉 （Aspergillus sydowii） MNP12010103， 及其在制备抗肿瘤药物中的应用。 0006 本发明采用的技术方案。
9、是 ： 0007 一 株 具 有 抗 肿 瘤 活 性 的 海 洋 真 菌 萨 氏 曲 霉 （Aspergillus sydowii） MNP12010103， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 邮编 430072， 保藏编号 ： CCTCC No ： M 2012391， 保藏日期 2012 年 10 月 8 日。 0008 所述萨氏曲霉 MNP12010103 的菌落特征如下 ： 涂布或划线接种于海水 PDA 上生 长迅速， 在海水 PDA 上 28 培养 5d， 菌落直径 31mm， 平坦， 中部突起， 质地绒状至絮状， 分生孢子结构大量， 表面灰蓝色至。
10、暗蓝色， 边缘白色， 老后色深， 无渗出液， 菌落反面淡黄褐 色， 可溶性色素缺乏 ； 所述萨氏曲霉的菌体生长特征如下 ： 在液体培养基中， 28培养 48 h 后呈颗粒状悬浮生长 ； 所述的萨氏曲霉 MNP12010103 分生孢子头球形至辐射形， 小分生孢 子头似青霉状， 散乱或疏松柱形。本种的最主要特征是致密的柱形分生孢子头和光滑的小 说 明 书 CN 103074234 B 3 2/5 页 4 分生孢子， 且菌丝体呈白色。 0009 本发明菌株是由浙江省三门湾海域采集的海水中分离和筛选得到的。 0010 菌株的筛选纯化方法为 ： 将采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板 培养基上， 28。
11、培养至菌落数量不再增加， 挑取单菌落至斜面培养基上。 28培养2d， 以菌株形态特征 区别进行挑选， 即得该菌株， 并对该菌株进行菌种鉴定。 0011 所述的平板培养基和斜面培养基的组成相同， 组成为 ： 土豆 150350g/L， 葡萄糖 1030g/L， 琼脂 1535g/L， 溶剂为水， pH7.28.0。 0012 将所述的萨氏曲霉 Aspergillus sydowii MNP12010103 的 rDNA-ITS 序列在美国 国立生物信息中心 （National Center for Biotechnology Information USA， NCBI） 的 GenBank 中进。
12、行同源比对， 鉴定为萨氏曲霉 （Aspergillus sydowii） 。其 rDNA-ITS 的测序 序列如下 ： 0013 CTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCAC CCGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAGCCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGC CTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTGAATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCG ATGAAGAAC。
13、GCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATT GCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTC GTCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCA CCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGGGCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGACCTCGGATCAGGT。
14、AG GGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA。 0014 本发明还涉及所述的萨氏曲霉 MNP12010103 在制备抗肿瘤药物中的 应用。 0015 具体的， 所述抗肿瘤药物为治疗肝癌、 神经癌或淋巴癌的药物。 0016 具体的， 所述萨氏曲霉 MNP12010103 提取物用于制备抗肿瘤药物。 0017 优选的， 所述提取物为乙酸乙酯提取物， 由如下方法制得 ： 将萨氏曲霉 MNP12010103 接种至液体发酵培养基中， 于 2535、 150250 r/min 振荡条件下培养 1430d， 得到发酵液， 发酵液去除菌体细胞后用乙酸乙酯萃取， 浓缩。
15、挥干得浸膏， 即为所述 萨氏曲霉MNP12010103的乙酸乙酯提取物 ； 所述发酵培养基组成为 ： 葡萄糖820 g/L， 蛋白 胨 1.53 g/L， 酵母膏 0.82g/L， 溶剂为水 ： 人工海水体积比 1 ： 14 的混合物， pH 78。 0018 所述人工海水每 100 mL 组成为 ： NaCl 2.448 g， Na2SO4 0.3917 g， KCl 0.0664 g， KBr 0.0096 g， SrCl2 0.0024 g， MgCl 6H2O 0.4981 g， CaCl2 H2O 0.1102 g， NaHCO3 0.0192 g， H3BO3 0.0026 g， 。
16、NaF 0.0004 g， 蒸馏水 100 mL。 0019 所述菌株在发酵培养前， 通常需要先经斜面培养活化， 然后经种子培养、 获得种子 菌株再接入液体发酵培养基进行产酶培养。 0020 所述的斜面培养基组成为 ： 土豆 150350g/L， 葡萄糖 1030g/L， 琼脂 1535g/L， 溶 剂为水， pH7.28.0。 0021 所述的平面种子培养基组成为 ： 葡萄糖 815g/L， 蛋白胨 1.54g/L， 酵母膏 0.51.5g/L， 琼脂 1520g/L， 溶剂为水 ： 人工海水体积比 1:14 的混合物， pH7.28.0。 0022 所述的液体发酵培养基组成为 ： 葡萄糖 。
17、815g/L， 蛋白胨 1.53g/L， 酵母膏 0.82g/L， 溶剂为水 ： 人工海水体积比 1:14 的混合物， pH78.0。 0023 具体的， 所述提取物由如下方法获得 ： 说 明 书 CN 103074234 B 4 3/5 页 5 0024 （1） 将海洋真菌萨氏曲霉 MNP12010103 菌株接种于斜面培养基， 于 2535培养 2448 h， 得到活化后的菌种 ； 所述的斜面培养基组成为 ： 土豆 150350g/L， 葡萄糖 1030g/ L， 琼脂 1535g/L， 溶剂为水， pH7.28.0 ； 0025 （2） 将步骤 （1） 活化培养后海洋真菌萨氏曲霉 MNP。
18、12010103 菌体接种至平面种子 培养基中， 于 2535条件下培养 1648h， 得到种子菌 ； 所述平面种子培养基组成为 ： 葡萄 糖 815 g/L， 蛋白胨 1.54 g/L， 酵母膏 0.51.5 g/L， 琼脂 1520g/L， 溶剂为水 ： 人工海水 体积比 1:14 的混合物， pH7.28.0 ； 0026 （3） 将步骤 （2） 种子菌株以 1%10% 的体积比的接种量， 移种到液体发酵培养基中， 于2535、 150250 r/min振荡条件下培养1430天， 得到发酵液 ； 所述液体发酵培养基组 成为 ： 葡萄糖 820 g/L， 蛋白胨 1.53 g/L， 酵母膏。
19、 0.82g/L， 溶剂为水 ： 人工海水体积比 1:14 的混合物， pH 78 ； 0027 （4） 将步骤 （3） 的发酵液于 4条件下细胞破碎、 离心或者过滤， 分离除去菌体， 所 得发酵液用乙酸乙酯萃取后收集上层萃取液， 浓缩挥干制得的油状提取物总浸膏， 即乙酸 乙酯提取物。 0028 本发明的有益效果主要体现在 ：（1） 本发明的海洋真菌萨氏曲霉 MNP12010103 营 养要求简单、 容易培养 ；（2） 该菌株的代谢产物具有抗肿瘤活性 ；（3） 该菌株的次级代谢产 物的抗肿瘤活性高， 其培养所得的发酵液总浸膏对 HepG2 细胞、 PC12 细胞和 U937 细胞有较 强的抗肿。
20、瘤活性。 （四） 附图说明 0029 图 1 为平板培养基上萨氏曲霉 MNP12010103 的菌落形态 ； 0030 图 2 为光学显微镜下萨氏曲霉 MNP12010103 的菌体形态。 （五） 具体实施方式 0031 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0032 实施例 1 ： 菌株的筛选、 纯化及鉴定 0033 （1） 将自东海三门湾海域采集的海水运用稀释涂布法涂于土豆平板培养基上， 28培养至菌落数量不再增加， 挑取单菌落至新的土豆平板培养基上。 28培养2d， 以菌株 形态特征区别进行挑选， 即得该菌株。所述土豆平板培养基按如下组成配制 。
21、： 土豆 200g， 葡 萄糖 20g， 琼脂 20g， 蒸馏水 1000mL。 0034 （2）对筛选获得的菌株 MNP12010103 的 rDNA-ITS 的 PCR 产物序列进行核苷酸 序列比对， 结合形态学观察， 将其命名为萨氏曲霉 MNP12010103（Aspergillus sydowii MNP12010103） ， 提交中国典型培养物保藏中心， 保藏号 ： CCTCC No ： M 2012391， 保藏日期 2012 年 10 月 8 日。 0035 实施例 2 ： 菌株的活化及大规模培养 0036 (1) 将实施例 1 中筛选获得的菌株接种于斜面培养基， 于 28培养 。
22、24-48h， 得到 活化后的菌株， 所述斜面培养基按如下组成配制 ： 土豆 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂 20g， 蒸馏水 1000mL。 说 明 书 CN 103074234 B 5 4/5 页 6 0037 (2) 将步骤 （1） 活化培养后的菌株接种至平面培养基中， 于 28、 150250 r/min 振荡条件下培养 48h， 得到种子液， 所液体种子培养 基按如下组成配制 ： 葡萄糖 10g， 蛋白 胨 2g， 酵母膏 1g， 琼脂 15g， 蒸馏水 400mL， 人工海水 600mL， pH 7.5。 0038 (3) 将步骤 （2） 种子菌株以 10% 的体积比的接种量，。
23、 移种到大规模液体发酵培养基 中， 于28、 150250 r/min振荡条件下培养21d， 得到发酵液。 所述液体发酵培养基按如下 组成配制 ： 葡萄糖 10g， 蛋白胨 2g， 酵母膏 1g， 蒸馏水 400mL， 人工海水 600mL， pH 7.5。 0039 实施例 3 ： 海洋真菌萨氏曲霉 MNP12010103 的抗肿瘤活性研究 0040 (1) 将实施例 2 中培养所得的发酵液先于超声波细胞破碎仪中进行菌体破碎 20min， 然后于 4条件下离心 （9000r/min， 15min） 或者过滤， 除去菌体， 用乙酸乙酯进行萃 取， 对萃取相进行旋蒸， 所得浸膏即为该菌株的次级代。
24、谢产物总浸膏。 0041 (2) 将步骤 （1） 所得的发酵液总浸膏进行抗肿瘤活性测定。具体步骤如下 ： 选取 三株肿瘤细胞， 分别为肾上腺嗜铬细胞瘤细胞 （PC12 细胞） 、 肝癌细胞 （HepG2 细胞） 和人组 织细胞淋巴瘤细胞 （U937 细胞） ， 取对数期的细胞株制成细胞悬液， 接种于 96 孔板中， 培养 48h， 待测样品 （总浸膏） 加入 0.1% DMSO10L 溶解后， 用无血清的 1640 细胞培养基稀释， 加 100L 至试验组中， 使得最终发酵液总浸膏的浓度分别为 50g/mL、 100g/mL、 200g/ mL、 400g/mL、 800g/mL， 阴性对照组。
25、加等量不含样品的无血清培养基， 空白对照组则为 无细胞和样品的无血清培养基， 依托泊苷 （VP-16） 作为阳性对照品， 每个浓度设 5 个复孔， 肿瘤细胞在 CO2 培养箱 （37） 培养 48h， 每孔加入 5mg/mL 的 MTT20L， 继续培养 4h 后， 小 心移去上清， 每孔加DMSO150L， 振荡10min， 用酶标仪充分振荡使 得MTT紫色产物完全溶 解， 测 490nm 的 A 值， 根据公式 ： 抑制率 =（A 阴性对照组 -A 空白对照组） -（A 样品组 -A 空 白对照组） /(A 阴性对照组 -A 空白对照组 ) 即可求得抑制率。 0042 (3) 根据步骤 （。
26、1） -（3） 所得的数据见表 13。 0043 表 1 ： 菌株发酵液浸膏对 HepG2 细胞的抑制作用 0044 0045 表 2 ： 菌株发酵液浸膏对 U937 细胞的抑制作用 0046 说 明 书 CN 103074234 B 6 5/5 页 7 0047 表 3 ： 菌株发酵液浸膏对 PC12 细胞的抑制作用 0048 0049 由表中数据可得 ： 海洋真菌萨氏曲霉 MNP12010103 的次级代谢产物的抗肿瘤活性 高， 其培养所得的发酵液总浸膏对肝癌细胞 （HepG2 细胞） 和人组织细胞淋巴瘤细胞 （U937 细胞） 有较强的抗肿瘤活性， 对肾上腺嗜铬细胞瘤细胞 （PC12 细胞） 也具有一定的抗肿瘤活 性。 说 明 书 CN 103074234 B 7 1/1 页 8 0001 序 列 表 CN 103074234 B 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103074234 B 9 。