海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的基因工程应用
技术领域
本发明涉及海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的基因工程应用，属于基因工程领域， 具体地讲涉及植物重金属胁迫应答的金属结合蛋白。
技术背景
金属硫蛋白是生物界普遍存在的低分子量，富含半胱氨酸，具有金属结合能力的蛋 白质(Cobbett et al.，2003)。目前，已先后从至少38种植物中克隆了超过50个金属硫蛋 白基因。研究结果表明细胞质内存在一些有机化合物，可以与重金属离子螯合，降低细 胞质中重金属的自由离子活度，从而对细胞原生质起保护作用(Clemens，2001；Hall， 2002)，金属硫蛋白就是其中一类可降低自由离子活度的多肽。金属硫蛋白还参与氧化 胁迫、高盐、低温、热激等非生物胁迫反应。对酵母及蚕豆此类MT基因的研究表明， 在花椰菜和拟南芥中过量表达MT显著提高了植株的耐重金属能力及对重金属的积累 (Evans et al.，1992；Hasegawa et al.，1997)。因此植物金属硫蛋白对于改良植物重金属耐 性及富集能力具有重要的应用价值。
海州香薷(Elsholtzia haichowensis)是唇形花科香薷属植物，生长在中国长江流域 的铜矿区，为铜矿指示植物，其体内含铜量为102mg/kg DW(Tang，1999)，具有重金属 污染土壤植物修复的潜力。迄今为止尚无关于海州香薷金属硫蛋白基因的功能描述。本 发明从海州香薷中鉴定了第1个与重金属胁迫有关的金属硫蛋白EhMT1，并研究了其与 重金属胁迫的关系，提出了利用EhMT1基因进行植物重金属耐性及富集能力改良的方 法。
发明内容
技术问题 本发明的目的在于公开一种耐铜植物——海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1 的基因工程应用，将该基因作为目的基因导入植物，提高植物耐重金属及积累能力，以 进行植物重金属耐性及富集能力的改良。
技术方案 海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的基因工程应用，包括：
1、海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的基因工程应用，包括：
1)总RNA的提取
以海州香薷为实验材料，待海州香薷幼苗长至7-8叶期后，用50μM CuSO4进行处 理，48小时后立即取叶片置于液氮中冷冻保存，取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂 解液的1.5ml离心管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内，匀浆后移至1.5ml离心管， 抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含 量。
2)海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的克隆
利用RT-PCR获得海州香薷金属硫蛋白基因片段，再利用RACE技术获得海州香薷 金属硫蛋白基因的5′末端和3′末端，将上述三条片段进行拼接全长序列，根据拼接的全 长序列设计两端引物：
引物P1：5′-ACGTCGATCACTAAGAAAAG-3′
引物P2：5′-CTTAGACGCATAAACACGAA-3′
以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增， PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃变性30s，55℃复性1min，72℃延伸45min， 28个循环后，72℃ 7min，将PCR产物进行克隆、测序后获得具有完整编码区的海州香 薷金属硫蛋白基因EhMT1的cDNA序列。
3)植物表达载体的构建
根据海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的cDNA序列，见GenBank登录号为 DQ059081的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物：
引物P3：5′-G TCTAGAAAGAAAATGTCGAGTGGA-3′
引物P4：5′- CCCGGGAGGCAGTATATCTGACAG-3′
并分别引入限制性内切酶位点，以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR 扩增后，将EhMT1的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到双元表达载体 PBI121。
4)转基因植株的获得
将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入烟草，对获得的转基因植株进 行PCR、RT-PCR验证后进行植物的耐铜性评价，转基因植株的T0代和野生型烟草进行 50μM CuSO4的持续处理，观察他们的生长表现，铜处理12天后的表现明显优于野生型 的转基因烟草植株即为获得的耐铜转基因植株。
有益效果
1、本发明将来自海州香薷(Elsholtzia haichowensis)的金属硫蛋白基因EhMT1，作为目 的基因导入植物，提高植物对重金属的耐性，以进行重金属耐性及富集植物的改良， 所编码的蛋白质具有重金属结合功能。
2、本发明人提供的EhMT1基因功能是参予植物重金属胁迫应答反应，mRNA表达分析 表明EhMT1基因在50μM CuSO4诱导条件下表达增强。
3、本发明涉及的EhMT1基因来自海州香薷，具有适合于烟草、拟南芥等双子叶植物表 达的优化密码子，其基因工程受体植物除双子叶植物，如花椰菜、烟草、蚕豆等之 外，还适合于水稻、玉米等单子叶植物。
4、利用EhMT1基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花 椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中 必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定 可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如β-葡糖醛酸糖 苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。 所用的表达载体可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介 导、基因枪或电击等方法转化植物。
附图说明
图1铜胁迫下野生型(WT)及转EhMT1基因烟草(#20)植株生长情况
具体实施方式
实施例1
采自铜矿区的海州香薷种子，待海州香薷幼苗长至7-8叶期，用50μM CuSO4进行 处理48小时后，立即取叶片置于液氮中冷冻保存。取部分叶片，用研钵研碎，加入盛 有裂解液(购自北京天根公司)的1.5ml离心管中，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。 匀浆后移至1.5ml离心管中，抽提总RNA。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后 在分光光度计上测定RNA含量。以RT-PCR及RACE扩增的三条片段进行序列拼接得 到全长序列，根据此序列设计两端引物
引物P1：5′-ACGTCGATCACTAAGAAAAG-3′
引物P2：5′-CTTAGACGCATAAACACGAA-3′
采用RT-PCR方法进行全长cDNA扩增，PCR程序如下：94℃预变性4分钟，94℃ 变性30s，55℃复性1min，72℃延伸45min，28个循环后，72℃ 7min，将PCR产物进 行克隆、测序后获得具有完整编码区的海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的cDNA序列； EhMT1的cDNA序列GenBank登录号为DQ059081及编码的氨基酸序列GenBank登录 号为AAY57923。
BLAST的结果证明从海州香薷中新得到的基因确为一个编码MT基因。本发明涉及 的功能基因EhMT1为海州香薷中的首次报道，与重金属结合有关的MT基因，有望应用 于植物重金属耐性及富集能力的抗逆遗传改良。
EhMT1全长581bp，其开放阅读框位于61-286处。DNAssist软件分析表明EhMT1 共编码74个氨基酸，其中N-端和C-端含有2个典型的富含Cys区域，分别按照 CXCXXXCXCXXXCXC和CXCXXXCXCXXCXC的基序排列。经Blast程序比较发现， EhMT1编码蛋白与Mimulus guttatus(沟酸浆属植物)MT1的氨基酸相似性最高为75％。 使用Compute pI/MW软件估算其pI＝5.13，MW＝7.14kDa。
实施例2
用实施例1中设计的EhMT1两端引物进行半定量RT-PCR分析海州香薷幼苗地上部 与地下部的表达，以海州香薷18SrRNA基因(Sancenon et al.，2003)的表达为内参。结 果表明，海州香薷幼苗EhMT1的表达在50μM CuSO4处理下48小时达到最高。
实施例3
根据实例1得到的EhMT1的全长序列，设计扩增完整编码框的引物P3和P4，序列如下：
引物P3：5′-G TCTAGAAAGAAAATGTCGAGTGGA-3′
引物P4：5′- CCCGGGAGGCAGTATATCTGACAG-3′
并分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物 为模板，经PCR扩增后，将EhMT1的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，进一步克隆到 双元表达载体pBI121，在保证阅读框正确的前提下鉴定表达载体，再将其转入农杆菌中， 继而转入烟草。待获得的转基因植株进行PCR以及RT-PCR验证后进行植物的耐重金属 评价。即将转基因植株的T0代和对照植株进行50μM CuSO4的持续处理，观察他们的生 长表现，结果表明转基因烟草50μM CuSO4处理12天后的表现明显优于对照组。野生型 植株比未进行铜处理的对照植株干重降低了37％；而转基因植株的生长并未受到抑制， Cu处理反而促进植株生长，干重是对照植株的1.7倍(图1)。
上述实施例1表明本发明克隆的海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1，为海州香薷中首 次克隆的EhMT1基因，此类基因在海州香薷中的功能迄今未经描述。实施例2表明该基 因与植物的重金属胁迫密切相关。此类基因由于来源于耐铜植物，与其它来源的金属硫 蛋白基因相比，更加适合于植物耐重金属及富集能力的遗传改良。
mRNA表达分析表明EhMT1主要在海州香薷根、叶片中表达，在茎中检测不到表 达；而且50μM CuSO4的处理增强了EhMT1的表达。转基因研究表明，将EhMT1基因 转入烟草，转基因植株在正常条件下的长势类似对照，该基因可作为目的基因导入植物， 提高植物耐重金属能力，以进行植物品种改良。在本发明的方法中，可利用EhMT1基因 作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒 (CaMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增 强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包 括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如 荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒、 Ri质粒、植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导、基因枪或电击等方法转化植物。
本发明的EhMT1基因来自海州香薷，具有适合于烟草、拟南芥等双子叶植物表达的 优化密码子，其基因工程受体植物除双子叶植物，如花椰菜、烟草、蚕豆等之外，还适 合于水稻、玉米等单子叶植物。
序列表
<110>南京农业大学
<120>海州香薷金属硫蛋白基因EhMT1的基因工程应用
<130>说明书
<140>00
<141>2007-06-05
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物P1
<222>(1)..(20)
<223>
<400>1
acgtcgatca ctaagaaaag 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物P2
<222>(1)..(20)
<223>
<400>2
cttagacgca taaacacgaa 20
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物P3
<222>(1)..(25)
<223>
<400>3
gtctagaaag aaaatgtcga gtgga 25
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>引物P4
<222>(1)..(24)
<223>
<400>4
cccgggaggc agtatatctg acag 24