技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体涉及一种控制水稻分蘖的基因Osa-MIR156e， 同时涉及该基因在转基因水稻或转基因水稻种子中的应用。本发明采用正向遗传学的方 法，筛选T-DNA插入水稻突变体库，克隆到控制水稻分蘖基因Osa-MIR156e，通过共 分离检测表明该基因与多分蘖突变表型是紧密连锁的，及通过超量表达Osa-MIR156e 基因，使正常水稻出现分蘖多的表型，证实了该基因的功能。还涉及含有该基因和具有 该基因核心序列的该基因家族其它成员，以及含有其核心序列的其它DNA片段和其它 物种的同源基因的载体和涉及利用该基因或其功能类似物调控植株的分蘖能力从而提 高农作物的产量。
背景技术
水稻作为重要的粮食作物，世界上三分之一以上的人以其为主食。同时，由于水稻 具有基因组小、精细的遗传和物理图谱、相对容易的转基因技术及与其它禾本科作物的 共线性，而被视做模式植物。随着包括水稻在内的多种生物基因组测序的完成，人类开 始进入后基因组时代。全面开展功能基因组研究已成为生命科学的前沿领域。因此水稻 功能基因的研究对社会经济发展和生物学研究具有重大意义。
为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻单位面积产量仍是人们面临的挑 战。50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育是水稻增产的两次革命，但近几年 来水稻的增产开始徘徊。1994年国际水稻所(IRRI)提出水稻理想株型育种，就是基于减少 分蘖总数、提高成穗率、塑造穗大粒多一类新株型(NPT)的指导思想(Khush G S.Breaking the yield frontier of rice.Geo Journal，1995，35(3)：329-332)。我国的“水稻超高产育种计 划”实质也离不开株型问题。在产量构成因素穗数、穗粒数和粒重中，穗数的多少在很大 程度上受制于分蘖的发生量，因而分蘖是影响水稻与小麦等主要农作物单产的重要农艺 性状之一。
分蘖是单子叶植物在生长发育过程中形成的一种特殊的分枝特性。通常在每个节的 叶腋都有一个分蘖芽，分蘖芽的分化发生较早，在叶原基长成帽状时，其基部的一些细胞 加速分裂形成隆起的蘖原基。这些蘖原基继续分化生长成为分蘖芽。但只有位于茎秆基 部不伸长节间上的分蘖芽才能够伸长生长为分蘖；而茎杆上部伸长节间上的分蘖芽一般 不伸长而处于休眠状态。若环境条件适宜，从稻茎的下部节开始，自下而上这些分蘖芽都 可发育成分蘖。在主茎上形成的分蘖称为一级分蘖，一级分蘖上可形成二级分蘖，依次 类推。因此，一株水稻的最高分蘖数是全部蘖次、蘖位上的分蘖长成的总和。在正常(野 生型)水稻中，以一级与二级分蘖为主，更高级别的分蘖则很少形成。稻秧生长至4个 叶片时进入分蘖期。分蘖并非越多越好。后期分蘖一般是不能成穗的无效分蘖。品种具 有早生快发特性则有利于提高分蘖的质量，提高成穗率，从而提高水稻的产量。(李学勇 等，水稻分蘖的分子机理研究。中国科学院院刊，2003(4)：274-276；任翔等，水 稻分蘖能力QTL的定位。武汉大学学报(理学版)，2003，49(4)：533-537)。
水稻分蘖是一个复杂的发育性状。一般认为，分蘖数目是多基因控制的数量性状， 其遗传力往往较低，光照、灌溉、肥料、温度等都会有很大影响。Wu等应用动态基因定 位法在重组自交系群体中定位了5个数量性状座位(quantitative trait locus，QTL)(Wu W R et al.，Time-Related Mapping of Quantitative Trait Loci Underlying Tiller Number in Rice. Genetics，1999，151：297-303.)。Yan等应用双单倍体群体发现了多个分蘖相关QTL， 但其中只有1个在整个分蘖期发挥作用。至今已发现了23个影响分蘖数目的数量性状 QTLs位点，分布在除第9、第10号之外的其余10条染色体上(Yan J Q et al.，Quantitative Trait Loci Analysis for the Developmental Behavior of Tiller Number in Rice(Oryza sativa L.)。Theor Appl Genet，1998，97：267-274.)。
通过突变体来研究一些与植物生长、发育和其他性状相关的基因已成为一种重要的 基因功能研究手段。实际上通过传统的化学诱变、辐射诱变以及新近采用的转座子和 T-DNA标签法均已分离到一批与植物发育调节相关的重要基因，但大部分研究只是对突 变体进行表型描述或基因初步定位，只有少部分克隆到基因。John Doebley等在1997年 利用转座子标签法分离到一个玉米草主茎腋生分枝数相关基因TB1(John Doebley et al.， The evolution of apical dominance in maize.Nature，1997，386：485-488；Martienssen R.， The origin of maize branches out.Nature，1997，386：443.)。Schumacher K等1999年克隆到 了控制番茄侧枝发生基因LS(Schumacher K et al.，The lateral suppressor(LS)gene of tomato encodes a new member of the VHIID protein family.Proc.Natl.Acad.Sci. USA，1999，96：290-295)。2003年Greb T等克隆到拟南芥的侧枝抑制基因LAS(Greb T et. Molecular analysis of the LATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillary meristem formation.Genes Dev.，2003，17：1175-1178.)。而水 稻分蘖控制基因MOC1的克隆是近年来在植物形态建成特别是侧枝形成研究领域中最重 要的进展之一(Li X et al.，Control oftillering in rice.Nature，2003，422：618-621)。虽然目 前已克隆到了一些控制植物分蘖的基因，但对植物分蘖的分子机理仍不清楚。现在世界 上许多国家都在创建各种突变体库，以此为平台克隆基因，这是一种很有效的方法，而 更多的植物分蘖基因也有望通过此方法被分离克隆。本发明也是利用该方法克隆到控制 水稻分蘖性状的基因Osa-MIR156e。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种控制水稻分蘖的基因Osa-MIR156e，如SEQ.ID. No.1所示的核苷酸序列，或具有其核心序列5′TGACAGAAGAGAGTGAGCAC 3′的该基因 家族其它成员，以及含有其核心序列的其它DNA片段。
本发明的另一个目的在于提供一种控制水稻分蘖基因Osa-MIR156e在转基因水稻 中的应用。
本发明的再一个目的在于提供一种控制水稻分蘖基因Osa-MIR156e在转基因水稻 种子中的应用。通过控制Osa-MIR156e基因或其同源基因在水稻中的表达量来控制水稻 分蘖数，从而形成理想株型，达到增产的目的。本基因的克隆还对阐明MIR156基因家 族的生物学功能有重要意义以及对植物分蘖的分子机理研究将有极大的推动作用。
实现本发明的技术如下：
1.创建突变体库(T0代)
农杆菌介导方法创建水稻T-DNA插入突变体库(T0代)。
2.T1代分蘖性状大田筛选
从T0代突变体库中选出3000份种子(T1代)，正常大田条件下种植，每份种20 株(称为1个家系)。观察突变体分蘖数变化，共观察到约100个家系有分蘖数突变。
3.突变株系与T-DNA共分离检测及T-DNA拷贝数初步分析。
用PCR(polymerase chain reaction)方法检测突变家系与T-DNA是否共分离， 100个突变家系中有41个为PCR阳性共分离。并对每个共分离家系所种的20个单株做 阳性检测，大致估算T-DNA拷贝数，根据盂德尔遗传规律单位点基因会出现3∶1分离， 当阳性∶阴性＝3∶1时为单拷贝。
4.分离侧翼序列
对41个T-DNA共分离家系做Tail-PCR(Liu Y G，Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR：Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking.Genomics，1995，25：674-681)分离侧翼序列，有 15个家系分离到侧翼序列，分析侧翼序列发现7个家系的侧翼序列能很好的定位在水稻 基因组上。
5.根据侧翼序列设计引物进一步做共分离检测
根据侧翼序列设计引物做进一步共分离验证，如图2，A表示在插入位点上游设计 的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引物。 在T1代植株中，T-DNA纯合植株只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入 A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只 有A和B配对可以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得 到产物。如果突变性状是隐性的，那所有突变株用A和B配对扩不出的为共分离。如 果突变性状是显性的，则所有突变单株用B和C配对都扩出，正常单株用B和C配对 都扩不出的为共分离。PCR分析，结果7个家系中只有一个家系是共分离。其突变表型 如图3。PCR结果，如图4：其中泳道4，6，10，16，19，20为T-DNA纯合；2，3，7， 8，9，12，13，14为T-DNA杂合；1，5，11，15，17，18为T-DNA阴性。与田间表 型对照，T-DNA纯合植株表型为分蘖多、矮化、不育；T-DNA杂合植株表型为分蘖多、 矮化、可育；T-DNA阴性植株表型为正常，表现出1∶2∶1分离。
6.T2代进一步做共分离验证
为了验证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，又繁殖了一代即T2代， 因为T1代中T-DNA纯合突变无种子，只能种杂合子，结果出现预期的三种表型，而且 符合1∶2∶1分离；正常单株的下一代没有出现分离，仍然表现正常。同时PCR检测 表明T-DNA的插入与突变表型共分离。由此证明，这个突变体是由于这个T-DNA插入 造成的单位点显性突变。
7.确定突变位点，获得候选基因
该突变体T-DNA插入水稻第4染色体，GenBank核苷酸数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中对应的克隆号：AL442115，插入该克隆第20054 位碱基旁，分析插入位点附近基因发现，相距1156bp处有一个编码miRNA基因 Osa-MIR156e，其编码的miRNA前体可形成茎环结构，如图5。
8.Osa-MIR156基因的功能验证
超量表达Osa-MIR156基因验证其功能。构建超表达载体pU17310，采用农杆菌 EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11，最后获得超表 达的组培苗100株，作为对照的由正常粳稻品种中花11愈伤分化的苗子30株，都种于 大田，结果约有50％的超表达组培苗出现分蘖多，半矮，半不育的突变表型。说明 Osa-MIR156e基因具有控制水稻分蘖的功能，同时还使水稻出现矮化和不育的表型。
9.Osa-MIR156基因的应用
为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻单位面积产量仍是人们面临的挑 战。50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育是水稻增产的两次革命，但近几 年来水稻的增产开始徘徊。1994年国际水稻所(IRRI)提出水稻理想株型育种，就是基于控 制水稻分蘖总数、提高成穗率、塑造穗大粒多一类新株型的指导思想。通过农杆菌介导 的遗传转化方法也可以是基因枪法或其它遗传转化方法超量表达控制水稻分蘖基因 Osa-MIR156e在水稻中的表达量来提高水稻的分蘖数或着通过遗传转化方法抑制表达控 制水稻分蘖基因Osa-MIR156e在水稻中的表达量来减少水稻分蘖数，达到控制水稻分蘖 数的目的，形成理想株型。所以根据不同水稻品种的要求增加或减少水稻的分蘖数，形 成理想的水稻株型，达到增产的目的。控制水稻分蘖基因Osa-MIR156e可以在转基因水 稻中应用也可以在转基因水稻种子中应用，培育具有优良水稻株型的品种。
本发明的优点和效果：
1.本基因的成功克隆进一步证实了采用T-DNA标签法克隆基因的可行性，而且该 方法克隆基因速度快，效率高。
2.拟南芥基因家族ath-MIR156中的大部分基因虽已被克隆，但并不清楚其具体的 生物学功能，本发明克隆的Osa-MIR156e基因对水稻分蘖有显著的影响见图3，这对阐 明MIR156基因家族的生物学功能有重要意义。
3.虽然目前已克隆到了一些控制植物分蘖的基因，但对植物分蘖的分子机理仍不 清楚。而本发明克隆的Osa-MIR156基因能够控制水稻的分蘖数，这对植物分蘖的分子 机理研究将有极大的推动作用。
4.Osa-MIR156基因不仅影响分蘖数，同时还使突变体表现出矮化和不育的表型， 该基因的功能研究对于植物重要农艺性状的研究意义深远。
5.该突变体使水稻分蘖数大大地提高，说明Osa-MIR156e基因对改变分蘖效果很 明显，通过基因工程技术提高或减弱Osa-MIR156e基因的表达量能够控制植物分蘖或分 枝的数量，从而有利于形成理想株型，达到增产的目的。
附图说明
图1.创建突变体库所用pSMR-J18R载体图。
图2.根据插入位点设计引物验证共分离示意图。A表示在插入位点上游设计的引 物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引物。在T1 代植株中，纯合突变体只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA插入A与B配对的 产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入，只有A和B配对可 以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增得到产物。
图3.水稻多分蘖突变体表型。左：T-DNA纯合突变；中：T-DNA杂和突变；右： 正常表型。
图4.根据插入位点设计引物验证共分离的PCR结果。上一行引物：A+B，下一行 引物：C+B，M表示2KB Maker，其中泳道4，6，10，16，19，20为T-DNA纯合；2，3， 7，8，9，12，13，14为T-DNA杂合；1，5，11，15，17，18为T-DNA阴性。与田间表 型对照，T-DNA纯合植株表型为分蘖多、矮化、不育；T-DNA杂合植株表型为分蘖多、 矮化、可育；T-DNA阴性植株表型为正常，表现出1∶2∶1分离。
图5.Osa-MIR156e基因，其编码的miRNA形成的茎环结构。
图6.T2代验证共分离的PCR结果。上一行引物：A+B，下一行引物：C+B，M表 示2KB Maker，泳道2，6，7，13，19，20，28，31，37，40为T-DNA纯合植株；1，3， 4，8，10，11，12，15，16，17，21，22，24，25，27，29，32，34，36，38，39为 T-DNA杂合单株；5，9，14，18，23，26，30，33，35，为T-DNA阴性单株。与田间表 型对照，T-DNA纯合植株表型为分蘖多、矮化、不育；T-DNA杂合植株表型为分蘖多、 矮化、可育；T-DNA阴性植株表型为正常，表现出1∶2∶1分离。
图7.超表达实验所用pU1301载体图。
具体实施方式
实施例1：分离克隆Osa-MIR156e基因
1.创建突变体库(T0代)
所用载体pSMR-J18R，由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠，如图1，以农杆菌EHA105介导方式 在粳稻品种中花11号(Oryza sativa L.subsp.japonica cv.Zhonghua 11)基因组中随机插 入T-DNA(含Enhancer Trap)(Springer P S.Gene Traps：Tools for plant development and genomics.Plant Cell，2000，12：1007-1020)创建突变体库。突变体库的构建是按照Wu等 (Wu C et al.，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J，2003，35：418-427)所描述的方法构建而成。目前约得到10万株独立转化子。
2.T1代分蘖性状大田筛选
从T0代突变体库中选出3000份T1代种子，先在秧田划5×8寸的格子播种，20 天后再移栽至大田筛选。每份材料种2行，每行10株，共20株(为1家系)，行与行 间间距8寸，株与株间间距5寸。从水稻分蘖期结束后，开始观察每个家系分蘖数的突 变情况。共观察到约100个家系有分蘖数突变(变多或变少)。
3.突变株系与T-DNA共分离检测及T-DNA拷贝数初步分析。
用PCR方法检测突变家系与T-DNA是否共分离，即突变株必需是T-DNA阳性。 所用引物：GAL4-L 5′AGA CCGGCAACAGGATTCAATC 3′，GAL4-R 5′TTCGTCCAGGACAACGTGAAC A 3′，反应体系的总体积为20μl，DNA模板1ul(约 50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL2 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物0.2ul、 0.3单位Taq酶，加ddH20(无菌去离子水)至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃ 45s、72℃ 1min 30cycles，72℃延伸5min。扩出的片段为T-DNA的一个片 段，大小为611bp。100个突变家系中有41个为PCR阳性共分离。并对共分离家系所 种的20个单株做阳性检测，大致估算T-DNA拷贝数，根据孟德尔遗传规律单位点基因 会出现3∶1分离，当阳性∶阴性＝3∶1时为单拷贝。
4.分离侧翼序列
对41个T-DNA共分离家系按Liu等的Tail-PCR方法分离侧翼序列(Liu Y G， Whittier R F.Thermal asymmetric interlaced PCR：Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking.Genomics，1995， 25：674-681)。利用CTAB法抽提突变体总DNA，方法如SAGHAI-MAROOF等 (SAGHAI-MAROOF et al.，Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance，chromosomal location，and population dynamics.Proc. Natl.Acad.Sci.USA，1984，81：8014-8018)。根据转化载体pSMR-J18R的T-DNA 左侧末端设计的嵌套式特异引物序列和引物在载体上对应的位置如下LSP2(引物)： 5’-GAAGTACTC GCC GATAGTGGAAAC C-3’6701-6677；LBT2(引物)：5’-ATA GGG TTT CGC TCA TGT GTT GAG CAT-3’6550-6524；LBT3(引物)：5’-CCA GTA CTA AAA TCC AGA TCC CCC GAA T-3’6447-6420。用于分离侧翼序列的简并引物及其序 列为：AD2a(引物)：5’-(AGCT)GT CGA(GC)(AT)G A(AGCT)A(AT)GA A-3’。反应 体系为：第一轮：DNA模板1.0μl；10×buffer 2.0μl；2Mm dNTP 2.0μl；25Mm MgCl2 2.0μl；10μM特异性引物0.2μl；100μM简并引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH2O至20μl。 第二轮：DNA模板1.0μl；10×buffer 2.0μl；2Mm dNTP 2.0μl；25Mm MgCl2 2.0μl；50％ 甘油2.0μl；10μM特异性引物0.2μl；100μM简并引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH2O 至20μl。第三轮：DNA模板1.0μl；10×buffer 2.0μl；2Mm dNTP 1.5μl；25Mm MgCl2 1.2μl； 50％甘油2.0μl；10μM特异性引物0.2μl；100μM简并引物0.2μl；Taq酶1u；加ddH2O 至20μl。反应程序按照Liu等的方法进行。反应完成后，取第三轮反应产物5μl在0.8％ 的琼脂糖凝胶上检测。采用低熔点琼脂糖挖胶回收的方法纯化PCR反应产物。纯化方 法为：将第三轮PCR反应产物在1％的低熔点琼脂糖上电泳，把扩增产物条带从胶上切 下放入1.5ml Eppendorf离心管中，65℃水浴15min，加入等体积PH7.9苯酚，颠倒摇 匀5min，13000r/min离心8min，取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)颠 倒摇匀5min，13000r/min离心8min，取上清，加入1/10体积3M醋酸钠(PH5.2)，2 倍体积预冷的95％乙醇，混匀后置-20℃冰箱中20min以上，13000r/min离心15min， 倒掉95％乙醇后再用75％乙醇浸洗沉淀，自然风干，DNA沉淀溶于20μl无菌去离子 水。把回收产物测序，测序引物序列和在载体上的位置为：NTLB5(引物)：5’-AATCCA GAT CCC CCG AAT TA-3’6437-6418，有15个家系分离到侧翼序列，分析侧翼序列发现 有7个家系的侧翼序列能很好的定位在水稻基因组上。
5.根据侧翼序列设计引物进一步做共分离检测
根据侧翼序列与水稻基因组的匹配情况，可以确定插入位点，在插入位点的两边设 计一对引物A和B，及T-DNA上设计一条引物C，如图2，A表示在插入位点上游设 计的引物，B表示在插入位点下游设计的引物，C表示根据T-DNA内部序列设计的引 物。在T1代植株中，T-DNA纯合植株只有A和C配对可以扩增的出，因为有T-DNA 插入A与B配对的产物太大无法得到扩增片段，野生型的植株由于没有T-DNA的插入， 只有A和B配对可以得到产物，杂合植株则A和C配对以及A和B配对时都可以扩增 得到产物。如果突变性状是隐性的，那所有突变株用A和B配对扩不出的为共分离。 如果突变性状是显性的，那所有突变单株用C和B配对都扩出，正常单株用C和B配 对都扩不出的为共分离。最后分析结果，7个家系中只有一个家系是共分离。该共分离 家系突变表型如图3，其分离的侧翼序列全长902 bp如下：
tgccgatatt agtaattaaa aaccctggcg agttgcttcc gatcttgtac aggagcccag caaattaaac
tcaagtaaaa ctagtggggg atatatatgg actctgaacc gagagagggt ggtaagtacg agcaccatga
atggaacagt ggcccaacag tatcctacat ttttggagcc attgggggac aatgcatcgt tgcaccatta
ctccctactt tgaatgccag agcgagatgt gaggtgttaa ttctcaagaa catggaggac cagcaggaca
gcagaagata actgactgat gataagggga agccgctcca agcagatctg ggtctcagta ctgttcctgc
ctgtcctcct tcctcctcct ctctctcctc cgatcctgat catgtagcta gctgatcttc tacacacttg
tgtgcttaat tacgactgta acactggatg gggcgctaca gtaagatgat cgaagctatg tatcaatttc
taaacaagat taaaaagatg ctcgatctag attgacattt tctgacatgc ccatgggaga ttgcctgcga
ctgattctga ttaataccag tagcctagat gcaatcaata gcactagtat actagttgca tgttcctacc
atgatgggga atgaatagaa agactgccta gtactagcta gctagctagt cgactagcag ctacgcactc
ttgcctaaat gcatgaaaga aatgtcgtcg tacttatttg accgcaggag tattttgtaa acacgcaact
gcatggcctg taccttccta ccgtttcatt gcataaaacc tggattccaa ttggcaattc cgtaccctgg
cattgttttt gactcattcc cttaattggc aatatccaaa gaaaccggaa cgaattgttt tc
采用BLAST分析方法(Altschul S F et al.，Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.， 1990，215：403-410)发现侧翼序列与GenBank核苷酸数据库中的克隆：AL442115能够 很好的匹配，侧翼序列的24-353，382-478分别和AL442115的20054-19726，19698 -19605匹配，同源性高达97％。根据插入位点设计的引物序列为A(引物)： 5′CTTAGCCAAACTTCATTGTTATCTG3′。B(引物)：5′AGTCGGTGTTGATGCCTGTA3′。 C(引物)：5′AATCCAGATCCCCCGAATTA3′。PCR反应体系的总体积为20μl，DNA 模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL2 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10 uM引物0.2ul、0.3单位Taq酶，加ddH2O至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃ 45s、55℃45s、72℃1min 30cycles，72℃延伸5min。PCR结果，如图4，其中泳道4， 6，10，16，19，20为T-DNA纯合；2，3，7，8，9，12，13，14为T-DNA杂合；1， 5，11，15，17，18为T-DNA阴性。与田间表型对照，T-DNA纯合植株表型为分蘖多、 矮化、不育；T-DNA杂合植株表型为分蘖多、矮化、可育；T-DNA阴性植株表型为正 常，表现出1∶2∶1分离。说明该突变表型确实是T-DNA插入造成的。
6.T2代进一步做共分离验证
为了验证该突变体的遗传稳定性及进一步验证共分离情况，又繁殖了一代即T2代。 将T1代收获的种子播种得到T2代，因为T1代中T-DNA纯合突变无种子，只能种杂合子， 结果出现预期的三种表型，即分蘖多、矮化、不育；分蘖多、矮化、可育以及正常3种， 而且符合1∶2∶1分离。而正常单株的下一代没有出现分离，仍然表现正常。同时PCR 检测表明T-DNA的插入与突变表型共分离，如图6，泳道2，6，7，13，19，20，28，31， 37，40为T-DNA纯合植株；1，3，4，8，10，11，12，15，16，17，21，22，24，25， 27，29，32，34，36，38，39为T-DNA杂合单株；5，9，14，18，23，26，30，33，35， 为T-DNA阴性单株。与田间表型对照，T-DNA纯合植株表型为分蘖多、矮化、不育；T-DNA 杂合植株表型为分蘖多、矮化、可育；T-DNA阴性植株表型为正常，表现出1∶2∶1分 离。由此证明，这个突变体是由于T-DNA插入造成的单位点显性突变。
7.确定突变位点，获得候选基因，并进行功能分析
采用BLAST分析方法发现，该突变体T-DNA插入水稻第4染色体，对应GenBank核 苷酸数据库中的克隆号为：AL442115，插入该克隆第20054位碱基旁，分析插入位点附 近基因发现，相距1156bp处有一个编码miRNA基因Osa-MIR156e，其编码的miRNA前体 可形成茎环结构，如图5。Osa-MIR156e基因在水稻基因组中有多个同源基因，与拟南芥 ath-MIR156基因属于同一基因家族MIR156。虽然在拟南芥中已克隆到基因家族 ath-MIR156中的部分基因，但并不清楚其具体的生物学功能，且Osa-MIR156e基因在水 稻中是否表达还没证实(Matthew W.Rhoades et al.，Prediction of Plant MicroRNA Targets. Cell，2002，110：513-520；Brenda J.Reinhart et al.，MicroRNAs in plants.GENES & DEVELOPMENT，2002，1616-1626)。本发明克隆的Osa-MIR156e基因对水稻分蘖有显著 的影响，这对阐明MIR156基因家族的生物学功能有重要意义。另外Osa-MIR156基因不 仅影响分蘖数，同时还使突变体表现出矮化和不育的表型，说明该基因具有多种功能。 通过PCR方法扩增到Osa-MIR156基因，并克隆到超表达载体，见实施例2。
实施例2：Osa-MIR156基因的功能验证和应用
1.遗传转化载体的构建
所用载体是本实验室构建的pU1301。pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体 pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37：517-527)基 础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米泛素启动子的农杆菌介导的遗传转 化载体(图7)。pCAMBIA1301载体由澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)惠赠。用PCR方法，直接从 水稻基因组扩目标基因SEQ.ID.No.1，PCR反应体系的总体积为20μl，水稻基因组 DNA模板1ul(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL2 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、 10uM引物各0.2ul、50％甘油2ul、0.3单位rTaq酶(Takara公司)，加ddH2O至20μl。反 应程序为：94℃变性3min，94℃ 45s、55℃45s、72℃ 1min、35cycles，72℃延伸5min， 扩10管，收集PCR产物于1.5ml离心管纯化，加等体积24∶1氯仿异戊醇，轻摇5分 钟，12000rpm离心15分钟，吸上清，加2倍体积95％乙醇，1/10体积3 M醋酸钠(PH5.2)， -20℃放置30分钟，12000rpm离心20分钟，弃上清，加500ul 75％乙醇放置5min， 12000rpm离心5分钟，弃上清，晾干，加75ul ddH2O溶解。把纯化的PCR产物及pU1301 载体酶切，体系：总体积100ul，PCR产物或载体质粒75ul，限制性内切酶BamH1 30U， 限制性内切酶Kpn1 30U，10X K buffer 5ul，ddH2O 16ul，37℃酶切5小时。纯化酶切产物， 方法同上，最后加10ul ddH2O溶解。连接反应：10ul PCR产物全部用于连接反应，载 体0.5ul，2U T4 ligase，5X buffer 3ul，总15ul体积，连接24小时。取1ul连接产物， 电压18000V，电转到大肠杆菌DH10B，加800ul LB，复苏45分钟，取200ul涂于含卡 那霉素的LA平板，37℃，过夜。挑单克隆，扩大培养抽质粒，酶切验证，酶切方法同上。 PCR验证，体系程序与从水稻基因组扩目标基因相同。挑阳性克隆，把构建好的载体电 转农杆菌EHA105，抽质粒，PCR验证，取750ul含构建好载体的农杆菌菌液加等体积的 50％甘油混匀，-70℃保存。构建好的载体命名为pU17310。
2.遗传转化
采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)将超表达载体导入正常中花11水稻品种。农杆 菌介导的遗传转化步骤如下：
1)愈伤诱导
(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞 (HgCl2)15分钟；
(2)灭菌水洗种子4-5次；
(3)将种子放在诱导培养基上；
(4)置于黑暗处培养5周，温度25-27℃。
2)愈伤继代
挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周， 温度25-27℃。
3)预培养
挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4天，温度25- 27℃。
4)农杆菌培养
(1)在带有卡那霉素的LA培养基上预培养含构建好载体的农杆菌EHA105两 天，温度28℃；
(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。
5)农杆菌侵染
(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；
(2)调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；
(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；
(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度 19-20℃。
6)愈伤洗涤和选择培养
(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；
(2)浸泡在含400ppm头孢霉素的灭菌水中30分钟；
(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；
(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次头孢霉素筛选浓 度为400ppm，第二次以后为250ppm)
7)分化
(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天；
(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(2000 lx)下培养，温度26 ℃，5-7周。
8)生根
(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化时产生的根；
(2)然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。
9)移栽
洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保 持水分湿润。
3.Osa-MIR156e基因超表达结果和应用
最后获得超表达的组培苗100株，作为对照的由正常中花11愈伤分化的苗子30 株，都种于大田，结果约有50％的超表达组培苗出现分蘖多，半矮，半不育的突变表型， 见超表达实验结果统计。说明Osa-MIR156e基因具有控制水稻分蘖的功能，同时还具有 控制水稻株高和育性的功能。
为解决人口增长与耕地面积减少的矛盾，提高水稻单位面积产量仍是人们面临的挑 战。50、60年代的矮化育种和70年代的杂交水稻培育是水稻增产的两次革命，但近几 年来水稻的增产开始徘徊。1994年国际水稻所(IRRI)提出水稻理想株型育种，就是基于控 制水稻分蘖总数、提高成穗率、塑造穗大粒多一类新株型的指导思想。通过农杆菌介导 的遗传转化方法也可以是基因枪法或其它遗传转化方法超量表达控制水稻分蘖基因 Osa-MIR156e在水稻中的表达量来提高水稻的分蘖数或着通过遗传转化方法抑制表达控 制水稻分蘖基因Osa-MIR156e在水稻中的表达量来减少水稻分蘖数，达到控制水稻分蘖 数的目的，形成理想株型。所以根据不同水稻品种的要求增加或减少水稻的分蘖数，形 成理想的水稻株型，达到增产的目的。控制水稻分蘖基因Osa-MIR156e可以在转基因水 稻中应用也可以在转基因水稻种子中应用，培育具有优良水稻株型的品种。
超表达实验结果统计
附：农杆菌介导的遗传转化试剂和配方
(1)试剂和溶液缩写
6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D (2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香 酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)； DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6min(N6 小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmin(MS小量成分溶液)
(2)组织培养的溶液配方
1)N6max母液[10倍浓缩液(10X)]
硝酸钾(KNO3) 28.3g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 4.0g
硫酸铵((NH4)2SO4) 4.63g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 1.85g
氯化钙(CaCl2·2H2O) 1.66g
逐一溶解，然后在20-25℃下定容至1000ml。
2)N6min母液[100倍浓缩液(100X)]
碘化钾(KI) 0.08g
硼酸(H3BO3) 0.16g
硫酸锰(MnSO4·4H2O) 0.44g
硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 0.15g
在20-25℃下溶解并定容至1000ml。
3)Fe2EDTA贮存液(100X)
在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁(FeSO4·7H2O)2.78g
在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水并加热至70℃，然后加入乙二铵四乙酸二 钠(Na2EDTA·2H2O)3.73g
在它们都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备 用。
4)维生素贮存液(100X)
烟酸(Nicotinic acid) 0.1g
维生素B1(Thiamine HCl) 0.1g
维生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g
甘氨酸(Glycine) 0.2g
肌醇(Inositol) 10g
加水定容至1000ml，4℃保存备用。
5)MSmax母液(10X)
硝酸铵(NH4NO3) 16.5g
硝酸钾 19.0g
磷酸二氢钾 1.7g
硫酸镁 3.7g
氯化钙 4.4g
在20-25℃下溶解并定容至1000ml。
6)MSmin母液(100X)
碘化钾 0.083g
硼酸 0.62g
硫酸锰(MnSO4·4H2O) 2.23g
硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 0.86g
钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 0.025g
硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.0025g
氯化钴(CoCl2·6H2O) 0.0025g
在20-25℃下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D贮存液(1mg/ml)
2，4-D 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在 20-25℃下保存。
8)6-BA贮存液(1mg/ml)
6-BA 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在 20-25℃下保存。
9)NAA贮存液(1mg/ml)
NAA 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃ 保存备用。
10)IAA贮存液(1mg/ml)
IAA 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，4℃ 保存备用。
11)葡萄糖贮存液(0.5g/ml)
葡萄糖 125g
蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4℃保存备用。
12)AS贮存液
AS 0.392g
DMSO 10ml
分装至1.5ml离心管内，4℃保存备用。
13)1N氢氧化钾贮存液
氢氧化钾 5.6g
蒸馏水溶解定容至100ml，在20-25℃下保存备用。
14)KT贮存液(1mg/ml)
KT 100mg.
1ml 1N氢氧化钾溶解5分钟，然后加10ml蒸馏水溶解完全后定容至100ml，在 20-25℃下保存。
(3)培养基配方
1)诱导培养基
N6max母液(10X) 100ml
N6mix母液(100X) 10ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 10ml
维生素贮存液(100X) 10ml
2，4-D贮存液 2.5ml
脯氨酸(Proline) 0.3g
CH 0.6g
蔗糖(Sucrose) 30g
Phytagel 3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml， 分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
2)继代培养基
N6max母液(10X) 100ml
N6mix母液(100X) 10ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 10ml
维生素贮存液(100X) 10ml
2，4-D贮存液 2.0ml
脯氨酸 0.5g
CH 0.6g
蔗糖 30g
Phytagel 3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸(100℃)并定容至1000ml， 分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。
3)预培养基
N6max母液(10X) 12.5ml
N6mix母液(100X) 1.25ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml
维生素贮存液(100X) 2.5ml
2，4-D贮存液 0.75ml
CH 0.15g
蔗糖 5g
琼脂粉(Agarose) 1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培 养皿中(25ml/皿)。
4)共培养基
N6max母液(10X) 12.5ml
N6mix母液(100X) 1.25ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml
维生素贮存液(100X) 2.5ml
2，4-D贮存液 0.75ml
CH 0.2g
蔗糖 5g
琼脂粉 1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。
使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培 养皿中(25ml/皿)。
5)悬浮培养基
N6max母液(10X) 5ml
N6mix母液(100X) 0.5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 0.5ml
维生素贮存液(100X) 1ml
2，4-D贮存液 0.2ml
CH 0.08g
蔗糖 2g
加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。
使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。
6)选择培养基
N6max母液(10X) 25ml
N6mix母液(100X) 2.5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml
维生素贮存液(100X) 2.5ml
2，4-D贮存液 0.625ml
CH 0.15g
蔗糖 7.5g
琼脂粉 1.75g
加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒入 培养皿中(25ml/皿)。
7)预分化培养基
N6max母液(10X) 25ml
N6mix母液(100X) 2.5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 2.5ml
维生素贮存液(100X) 2.5ml
6-BA贮存液 0.5ml
KT贮存液 0.5ml
NAA贮存液 50μl
IAA贮存液 50μl
CH 0.15g
蔗糖 7.5g
琼脂粉 1.75g
加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。
使用前溶解培养基，加入250μl 50mg/ml的潮霉素和400ppm头孢霉素，分装倒 入培养皿中(25ml/皿)。
8)分化培养基
N6max母液(10X) 100ml
N6mix母液(100X) 10ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 10ml
维生素贮存液(100X) 10ml
6-BA贮存液 2ml
KT贮存液 2ml
NAA贮存液 0.2ml
IAA贮存液 0.2ml
CH 1g
蔗糖 30g
Phytagel 3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。
煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到100ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。
9)生根培养基
MSmax母液(10X) 50ml
MSmix母液(100X) 5ml
Fe2+EDTA贮存液(100X) 5ml
维生素贮存液(100X) 5ml
蔗糖 20g
Phytagel 3g
加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。
煮沸(100℃)并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。
10)LA培养基(LB培养基不含琼脂粉)
蛋白胨 2.5g
酵母粉 1.25g
氯化钠 2.5g
琼脂粉 3.2g
蒸馏水溶解定容至250ml，装于500ml三角瓶，灭菌后20-25℃保存备用。
序列表
<110>华中农业大学
<120>控制水稻分蘖的基因及用途
<130>控制水稻分蘖的基因及用途
<160>1
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>390
<212>DNA
<213>Oryza sativa
atggcggtgt ctccggccgg cgggcgagcg ggccggtggc gcgaggtgac agaagagagt 60
gagcacacgg ccgggcgtga cggcaccggc gggcgtgccg tcgcggccgc gtgctcactg 120
ctctttctgt catccggtgc cggccgtttt ctccccctcc cgcggctagc taagctggcc 180
tctcggcccc tcgccggccg gccggtcgcc gacggaatcc cctgtactgc tccgcgcgcc 240
atgagctgtt ccgagtctct aggctcttta gattaattcg atcccctctt ctccggcgca 300
atcgtgcata ggcgcagttg ccaggttcta gatctctcac aatcgaattg atgcattctg 360
cgatttttcg ttcgtgttcc agcgccgtga 390