技术领域
本发明涉及源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的一种糖苷水解酶12家族的β-1，4-内切葡聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆，β-1，4-内切葡聚糖酶工程菌的构建以及重组β-1，4-内切葡聚糖酶的高效表达和纯化的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
纤维素是植物细胞壁最主要的结构成分，连同半纤维素占据了地球上可再生有机碳源的一半以上。纤维素酶是指能水解纤维素β-1，4葡萄糖苷键生成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖(endo-1，4-β-glucanase，EC 3.2.1.4，简称EG)、外切葡聚糖酶(exo-1，4-β-glucanase，EC 3.2.1.91，简称CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC 3.2.1.21，简称BG)3大类，在该3种酶的协同作用下可以把纤维素水解成葡萄糖。目前纤维素酶已被广泛的应用于食品、饲料、纺织、造纸、生物燃料和发酵等工业领域。
纤维素酶的种类繁多，在糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases，GH)第3、5、7、8、9、12等家族中都有分布，其中多数属于糖苷水解酶第5家族(GH5)和12家族(GH12)；纤维素酶的来源也很广，大多数纤维素酶主要来自微生物，自20世纪60年代以来，据不完全统计，国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约已有53个属的几千个菌株，主要包括细菌、真菌和放线菌。真菌是工业用纤维素酶的重要来源，主要有里氏木霉(Trichoderma reesei)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、黑曲霉(Aspergillus niger)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophile)和嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)等，目前研究最多且最清楚的是里氏木霉T.reesei。但有关来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)GH12的β-内切葡聚糖酶基因(Aus cel12A)的克隆和表达等的研究未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种宇佐美曲霉E001菌株新型β-1，4-内切葡聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列克隆，β-内切葡聚糖酶工程菌的构建以及重组β-内切葡聚糖酶的高效表达和纯化的方法。生物信息学分析表明，来源于宇佐美曲霉E001菌株的一种新型β-内切葡聚糖酶属于糖苷水解酶第12家族，命名为Aus Cel12A，其相应的基因命名为Aus cel12A。Aus Cel12A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值。
本发明的技术方案：一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株新型Aus Cel12A基因完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。获取完整mRNA和DNA序列的流程如图1所示。
A.usamii E001菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vol.31，No.4，Pg.50公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。
所述的由完整mRNA序列推导的Aus Cel12A氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
所述的重组Aus Cel12A的活性测定方法：
于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 5.0、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液配制的质量浓度为0.5％的β-葡聚糖(Sigma，USA)溶液2.4mL，50℃预热10min，在A管中加入0.1mL适当稀释的酶液，50℃准确反应20min；立即各加入2.5mL 3′，5′-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL酶液，A和B管均煮沸7min；冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从葡萄糖标准曲线上查出相应的还原糖(以葡萄糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个β-1，4-葡聚糖酶活性单位(U)。
所述的Aus cel12A完整mRNA和DNA序列的克隆和表达方法：
(1)Aus cel12A 3′端mRNA序列的克隆：首先对Aspergillus kawachii(GenBank D12901)、Aspergillus niger(GenBank AJ224451)和Aspergillus terreus(GenBank XM_001214697)GH12的β-内切葡聚糖酶序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的保守序列；再对该两段氨基酸序列的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物Cel12A-3F1和Cel12A-3F2。
Cel12A-3F1：5′-TA(T/C)GACAG(T/C)GC(G/C)TCGAGCCC-3′
Cel12A-3F2：5′-GTGAA(A/G)AGCTACTC(T/G)AACTC-3′
提取A.usamii E001的总RNA，按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)说明书进行RT-PCR扩增。将两轮PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-cel12A3′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus cel12A3′端mRNA序列。
(2)Aus cel12A 5′端mRNA序列的克隆：基于上述得到的Aus cel12A 3′端mRNA序列，设计两条反向引物Cel12A-5R1和Cel12A-5R2。
Cel12A-5R1：5′TTGTCCTGCTTCCATTCCAC-3′
Cel12A-5R2：5′ACATCACTCACGAGCTTCTT-3′
按照TaKaRa 5′-Full RACE Kit说明书进行5′-RACE。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-cel12A5′)，转化JM109，经酶切 鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus cel12A 5′端mRNA序列。
(3)Aus cel12A 5′端启动子序列的克隆：采用先前我们发明的一种T载体介导的PCR方法，以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，第一轮PCR以T-PrimerF和Cel12A-5R1为引物，第二轮PCR以T-PrimerF和Cel12A-5R2为引物。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-cel12AP)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus cel12A 5′端启动子序列。
(4)Aus cel12A 3′端转录终止区的克隆：基于上述得到的Aus cel12A 3′端mRNA序列，设计两条正向引物Cel12A-3F3和Cel12A-3F4。
Cel12A-3F3：5′-GTGTCAGAAAGCCCTATCAA-3′
Gel12A-3F4：5′-CAGCTATCTCACTCAGAACC-3′
采用先前我们发明的一种T载体介导的PCR方法，以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，第一轮PCR以Cel12A-3F3和T-PrimerR为引物，第二轮PCR以Cel12A-3F4和T-PrimerR为引物。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-cel12A3T)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus cel12A 3′端转录终止区序列。
(5)Aus cel12A的生物信息学分析：将Aus cel12A的5′和3′端mRNA序列进行拼接，得到自转录起始位点至poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上对开放阅读框架(Open ReadingFrame)进行分析，进而推导出Aus Cel12A的氨基酸序列；进行信号肽预测。将Aus cel12A的编码区DNA序列与其两侧序列进行拼接，获得完整DNA序列，并对其5′端启动子区域和3′端转录终止区的功能进行预测。
(6)Aus cel12A内含子序列的测定：基于上述得到的Aus cel12A完整mRNA序列，设计一对引物Cel12A-F1和Cel12A-R。
Cel12A-F1：5′GAATTCATGAAGCTCCCTGTGACAC-3′，含EcoR I酶切位点
Cel12A-R：5′GCGGCCGCCTAGTTGACACTGGCGGTC-3′，含Not I酶切位点
以A.usamii E001基因组DNA为模板，Cel12A-F1和Cel12A-R为引物进行PCR，将其产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-cel12A-DNA)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus cel12A的编码区DNA序列。将编码区DNA序列与mRNA序列用DNAMAN 6.0进行序列比对，得出Aus cel12A的2个内含子序列。
(7)含编码Aus Cel12A成熟肽基因的表达质粒的构建：基于上述得到的Aus cel12A完整mRNA序列以及预测的信号肽序列，设计一条正向引物Cel12A-F。
Cel12A-F：5′-GAATTCCAGACGATGTGCTCTCAAT-3′，含EcoR I酶切位点
按照TaKaRa RNA PCR Kit(Ver.3.0)使用说明书进行RT-PCR。以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Cel12A-F为引物进行第一轮PCR；以Cel12A-F和Cel12A-R为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-cel12A)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
将测序结果正确的pUCm-T-cel12A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-cel12A(图2)，并对重组质粒进行序列测定。
(8)GS115/cel12A的构建、表达、产物纯化及活性测定：用Sal I对pPIC9K-cel12A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/cel12A；按照手册上的标准流程进行诱导表达，用DNS法测定β-1，4-内切葡聚糖酶活性；发酵液经冷冻离心、超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析，得到电泳纯的重组β-1，4-内切葡聚糖酶。
本发明的有益效果：本发明提供了一种宇佐美曲霉E001菌株新型β-1，4-内切葡聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列克隆，β-内切葡聚糖酶工程菌的构建以及重组β-内切葡聚糖酶的高效表达和纯化的方法，并对序列进行生物信息学分析。生物信息学分析表明来源于宇佐美曲霉E001的一种新型β-内切葡聚糖酶属于糖苷水解酶的第12家族，命名为Aus Cel12A，其相应的基因命名为Aus cel12A。Aus Cel12A具有较高的催化活性和热稳定性，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。
附图说明
图1：获取A.usamii E001 Cel12A基因完整mRNA和DNA序列的流程图
图2：重组质粒pPIC9K-cel12A的构建示意图
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1Aus cel12A 3′端mRNA序列的克隆
以Oligo dT-Adaptor Primer为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13 Primer M4和Cel12A-3F1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，52℃30s，72℃90s)，72℃10min；以M13 Primer M4和Cel12A-3F2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，52℃30s，72℃90s)，72℃10min。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-cel12A3′)， 转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
实施例2Aus cel12A 5′端mRNA序列的克隆
以5′-Full RACE Kit的Outer Primer和Cel12A-5R1为引物进行第一轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；以Inner Primer和Cel12A-5R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-cel12A5′)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
实施例3Aus cel12A 5′端启动子序列的克隆
以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，第一轮PCR以T-PrimerF和Cel12A-5R1为引物，反应条件为：94℃4min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；第二轮PCR以T-PrimerF和Cel12A-5R2为引物，反应条件为：94℃，4min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-cel12AP)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
实施例4Aus cel12A 3′端转录终止区的克隆
以经处理的A.usamii E001基因组DNA为模板，第一轮PCR以Cel12A-3F3和T-PrimerR为引物，反应条件为：94℃4min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min；第二轮PCR以Cel12A-3F4和T-PrimerR为引物，反应条件为：94℃4min，30个循环(94℃30s，55℃30s，72℃60s)，72℃10min。将两轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-cel12A3T)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
实施例5含编码Aus Cel12A成熟肽基因的表达质粒的构建
以Oligo dT-Adaptor Primer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以Cel12A-F和M13 Primer M4为引物进行第一轮PCR，反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃60s)，72℃10min；以Cel12A-F和Cel12A-R为引物进行第二轮PCR，反应条件为：94℃2min，30个循环(94℃30s，53℃30s，72℃45s)，72℃10min。将第二轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-cel12A)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T-cel12A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-cel12A，并对重组质粒进行序列测定。
实施例6GS115/cel12A的构建、表达、产物纯化及活性测定
用Sal I对pPIC9K-cel12A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/cel12A。该基因工程菌用1.0％甲醇诱导表达96h，采用DNS法测得发酵液中重组β-内切葡聚糖酶活性达240U/mL。发酵液经离心后的上清液为重组AusCel12A粗酶液，该粗酶液经截留分子量为10kDa的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose FastFlow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组Aus Cel12A的分子量为27kDa。该重组Aus Cel12A的最适作用温度60℃，最适作用pH 5.0，该酶在pH 4.0-7.0、60℃以下稳定。
序列表
序列表
<110>江南大学
<120>一种β-1，4-内切葡聚糖酶基因的克隆及重组酶的制备
<140>201010581299.6
<141>2010-12-10
<210>SEQ ID NO：1
<211>1020
<212>mRNA
<213>宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001
<220>
<221>CDS
<222>(91)...(810)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(91)...(138)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(139)...(807)
<400>1
ccctccgtgt tggtgtctta tcctgaacac ttatcctctt attcctttcg aatttccctt 60
gattgccgct cctccgctct aacgcccaac atgaagctcc ccgtgtcact tgctatgctt 120
gcggccaccg ccatgggcca gacgatgtgc tctcaatatg acagtgcctc gagccccccg 180
tattcagtga accagaacct ctggggcgag taccaaggca ccggcagcca gtgtgtatat 240
gtcgacaaac tctccagcag tggtgcatcc tggcacaccg aatggacctg gagcggtggt 300
gagggaacag tgaaaagcta ctctaactct ggcgttacat ttaacaagaa gctcgtgagt 360
gatgtatcaa gcatccccac cttggtggaa tggaagcagg acaacaccaa cgtcaacgcc 420
gatgtcgcgt atgatctttt caccgcggcg aatgtggacc atgccacttc tagcggcgac 480
tatgaactga tgatttggct tgcccgctac ggcaacatcc agcccattgg caagcaaatt 540
gccacggcca cagtgggagg caagtcctgg gaggtgtggt atggcagcac cacccaggcc 600
ggtgcggagc agaggacata cagcttcgtg tcagaaagcc ctatcaactc atacagtggg 660
gacatcaatg catttttcag ctatctcact cagaaccaag gctttcccgc cagctctcag 720
tacttgatca atctgcagtt tggaactgag gcgttcaccg ggggcccggc aaccttcacg 780
gttgacaact ggaccgccag tgtcaactag ggttctagaa gtagcctttg aggcagaatc 840
tgggtaaatt gactccagct cgggagaatg atagcttgtt tcttcgttct ggaacgttgg 900
gcgtgtgaga gctaaaaagt cgtacccact ctgattggaa agacttattc aacattggtc 960
cttcccttct gttgggcaag gcatagttag tgattagaca agtcaaggtc atggtggatc 1020
<110>江南大学
<120>一种β-1，4-内切葡聚糖酶基因的克隆及重组酶的制备
<140>201010581299.6
<141>2010-12-10
<210>SEQ ID NO：2
<211>1568
<212>DNA
<213>宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001
<220>
<221>CDS
<222>(523)...(929)，(980)...(1212)，(1279)...(1358)
<220>
<221>mat_peptide
<222>(571)...(929)，(980)...(1212)，(1279)...(1358)
<220>
<221>Promoter
<222>(395)...(442)
<220>
<221>TATA_signal
<222>(408)...(413)
<400>2
agcttcttac ccgtgagctt cgtatcagtc aaaacaccta agccctgttg atatttcacc 60
gacaaaaggc cggtccctaa gccatgctca tctaaattga gttggtctat ccttctaaat 120
taatatcgtc agcacaagca ggaccctttt cttgtttccc atcagatccc gttctccacg 180
ttgttcggtt accgactgcc acagaccatc actaacttta aacggaaagt gctccgacat 240
agggtctcat tttgaaacgg aggatgtgca tgtctgttgc agattggcgt gagatggcgg 300
cgcaacccgc aatagctagt tggcttactt cttcttgaat gccatattgg acacggaaat 360
tcggacaatc ataatggcaa tagtaagcat tgttgattag attcaggtat ttaagctgcc 420
tcatctgccg ctccctccgt gttggtgtct tatcctgaac acttatcctc ttattccttt 480
cgaatttccc ttgattgccg ctcctccgct ctaacgccca acatgaagct ccccgtgtca 540
cttgctatgc ttgcggccac cgccatgggc cagacgatgt gctctcaata tgacagtgcc 600
tcgagccccc cgtattcagt gaaccagaac ctctggggcg agtaccaagg caccggcagc 660
cagtgtgtat atgtcgacaa actctccagc agtggtgcat cctggcacac cgaatggacc 720
tggagcggtg gtgagggaac agtgaaaagc tactctaact ctggcgttac atttaacaag 780
aagctcgtga gtgatgtatc aagcatcccc accttggtgg aatggaagca ggacaacacc 840
aacgtcaacg ccgatgtcgc gtatgatctt ttcaccgcgg cgaatgtgga ccatgccact 900
tctagcggcg actatgaact gatgatttgg tatgtgagct cgcaaagaat caaagaatac 960
agaaatctaa caaccccagg cttgcccgct acggcaacat ccagcccatt ggcaagcaaa 1020
ttgccacggc cacagtggga ggcaagtcct gggaggtgtg gtatggcagc accacccagg 1080
ccggtgcgga gcagaggaca tacagcttcg tgtcagaaag ccctatcaac tcatacagtg 1140
gggacatcaa tgcatttttc agctatctca ctcagaacca aggctttccc gccagctctc 1200
agtacttgat cagtaagatt ccctgattct accagcggac gccgcagcga aacagtcact 1260
aacagaagtg atgtgtagat ctgcagtttg gaactgaggc gttcaccggg ggcccggcaa 1320
ccttcacggt tgacaactgg accgccagtg tcaactaggg ttctagaagt agcctttgag 1380
gcagaatctg ggtaaattga ctccagctcg ggagaatgat agcttgtttc ttcgttctgg 1420
aacgttgggc gtgtgagagc taaaaagtcg tacccactct gattggaaag acttattcaa 1480
cattggtcct tcccttctgt tgggcaaggc atagttagtg attagacaag tcaaggtcat 1560
ggtggatc 1568
<110>江南大学
<120>一种β-1，4-内切葡聚糖酶基因的克隆及重组酶的制备
<140>201010581299.6
<141>2010-12-10
<210>SEQ ID NO：3
<211>239
<212>PRT
<213>宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001
<400>3
Met Lys Leu Pro Val Ser Leu Ala Met Leu Ala Ala Thr Ala Met
5 10 15
Gly Gln Thr Met Cys Ser Gln Tyr Asp Ser Ala Ser Ser Pro Pro
20 25 30
Tyr Ser Val Asn Gln Asn Leu Trp Gly Glu Tyr Gln Gly Thr Gly
35 40 45
Ser Gln Cys Val Tyr Val Asp Lys Leu Ser Ser Ser Gly Ala Ser
50 55 60
Trp His Thr Glu Trp Thr Trp Ser Gly Gly Glu Gly Thr Val Lys
65 70 75
Ser Tyr Ser Asn Ser Gly Val Thr Phe Asn Lys Lys Leu Val Ser
80 85 90
Asp Val Ser Ser Ile Pro Thr Leu Val Glu Trp Lys Gln Asp Asn
95 100 105
Thr Asn Val Asn Ala Asp Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala
110 115 120
Asn Val Asp His Ala Thr Ser Ser Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile
125 130 135
Trp Leu Ala Arg Tyr Gly Asn Ile Gln Pro Ile Gly Lys Gln Ile
140 145 150
Ala Thr Ala Thr Val Gly Gly Lys Ser Trp Glu Val Trp Tyr Gly
155 160 165
Ser Thr Thr Gln Ala Gly Ala Glu Gln Arg Thr Tyr Ser Phe Val
170 175 180
Ser Glu Ser Pro Ile Asn Ser Tyr Ser Gly Asp Ile Asn Ala Phe
185 190 195
Phe Ser Tyr Leu Thr Gln Asn Gln Gly Phe Pro Ala Ser Ser Gln
200 205 210
Tyr Leu Ile Asn Leu Gln Phe Gly Thr Glu Ala Phe Thr Gly Gly
215 220 225
Pro Ala Thr Phe Thr Val Asp Asn Trp Thr Ala Ser Val Asn
230 235 239