技术领域
本发明涉及编码人成骨蛋白-1的重组核酸及其表达。
背景技术
OP-1(osteogenic protein-1)即成骨蛋白-1，是BMP即骨形态发生蛋白家族中 的成员。有些文献中称之为BMP-7。人OP-1的cDNA编码NQEALR肽段。人 OP-1(hOP-1)的cDNA含有一个1293bp的开放读框，编码431个氨基酸的hOP-1 蛋白。在编码的第一个蛋氨酸后面分别为疏水性信号肽段、前体肽段和成熟肽段。 成熟肽具7个Cys，形成三个链内二硫键，两成熟肽单体通过一个链间二硫键形 成二聚体。成熟肽单体有一个位点被糖基化。信号肽段、前体肽段参与OP-1表 达的胞内翻译后加工过程，这些加工过程只在真核细胞发生。在原核系统表达 OP-1很难得到活性产物，国内外文献尚未见到成功报道。OP-1已经在CHO、 COS-1和昆虫细胞中成功表达出有活性的成熟蛋白(Sampath TK，Maliakal JC， Hauschka PV，Jones WK，Sasak H，Tucker RF，White KH，Coughlin JE，Tucker MM， Pang RH，et al.J Biol Chem 1992 Oct5；267(28)：20352-62)。而且，上述表达所用 仅限于OP-1的天然序列，至今尚为有关人工优化的报道。
OP-1具有广泛的生理功能，对骨骼、眼、肾、脑的发育起着重要调节作用[Jena N，Martinseisdedos C，Mccue P，et al.Exp cell Res，1997，230：28-37.]。尤其是，OP- 1在诱导骨组织和肾组织形成方面起重要作用。至今已有大量报道证实OP-1有助 于骨及软骨组织缺损的修复，显示了良好的临床应用前景。骨折的治疗常使用大 量的骨移植以诱发缺损处的愈合，自体或异体骨移植是最常被使用的方法，但各 有其使用上的限制。目前已知当利用自体或异体骨移植治疗片段骨缺损，BMP 蛋白能促进骨愈合。
但是，人们始终需要不断提高目的蛋白例如OP-1蛋白的表达量，这对于科 研和进一步的产业化应用无疑具有巨大的潜在价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种编码hOP-1的重组核酸，能够实现在哺乳动物， 尤其是CHO细胞中的高表达。
本发明的目的还在于提供用于实现以上目的的载体。
本发明的目的还在于提供用于实现以上目的宿主细胞。
为了实现以上目的，本发明提供了一种编码hOP-1的重组核酸，其序列如 SEQ ID NO：1所示。
本发明的重组核酸可用多种方法获得，其中包括，以公开的天然序列(例如 的Genbank登录号XM-030620)为模板进行定点诱变；或根据本发明给定的序列 进行全合成。这些都已是本领域的常规技术。而且，核苷酸序列的鉴定也是本领 域的常规技术，在现有文献中多有记载。因此，根据本发明给定的核苷酸序列， 本领域技术人员不难结合现有技术制备得到本发明的编码hOP-1的重组核酸。
本发明还提供一种载体，其中含有本发明编码hOP-1的重组核酸。在本领域 中，通过适当的克隆技术，将目的核酸片段插入合适的载体以实现保存，扩增和 /或表达等目的，已是一般常规技术。合适载体的选择取决于克隆目的，载体容量， 与宿主细胞的相容性，酶切位点等多种因素，本领域技术人员不难根据具体情况 做出适当选择。可用以本发明的载体例如但不限于pMSG，pGEM，pET15b， pET32b(Invitrogen公司产品)等。
本发明还提供了一种细胞，包含本发明编码hOP-1的重组核酸，所述核酸处 于与所述细胞相容的表达系统中。所述细胞选自哺乳动物细胞，尤其是CHO细 胞。所述宿主细胞可以通过常规转染或转化而获得所述核酸。挑选与宿主细胞相 容的表达载体已是本领域的常规技术，结合大量已有文献，不难做出此类选择。
从后文实施例中可以看出，本发明编码hOP-1的重组核酸显著提高了hOP-1 蛋白在宿主细胞内的表达，最大提高可达6.3倍。
附图说明
图1为用于构建本发明表达载体的pMSG载体。
具体实施方式
编码hOP-1的重组核酸及其制备
本发明对hOP-1的编码核酸进行了重组设计，所得人工序列如SEQ ID NO：1 所示。用DNAstar软件的MegAlign功能将本发明人工序列与发表的hOP-1基因 的编码区的DNA序列(自GeneBank登录号XM_030620)进行比较，发现两者有 175个碱基的差异，均匀分布在整个编码区。
有多种方法可获得序列已知的聚核苷酸，这些都已是本领域的常规技术。例 如，本发明的人工序列可通过长链PCR合成来制备(参见Chrisostomos Prodromou and Larurence H.Pearl，1992，Protocol：Recursive PCR：a novel technique for total gene synthesis，Protein Engineering，5：827～829.)。具体的说，参照该文献所述，根 据本发明的人工序列设计重叠PCR引物，从序列的5′至3′，包括正向引物F1- 18(SEQ ID NO：2-19)，及反向引物B1(SEQ ID NO：20)。其中，为了进行后续操作， 在第一正向引物F1的5′端增加保护性碱基及NheI位点，即ctc gctagc；同理，在 反向引物B1的5′端增加保护性碱基及位点Xho I cat ctcgag。合成引物(上海生化 公司)并用PEGA纯化，在无菌水中制备成500ng/μL的储备液。
在如下PCR体系中进行反应：F1和B1终浓度100ng/μL，其余片段为 20nM/μL，1X PCR反应缓冲液，1.5mM MgCl2，200nM的dNTPs，Pfu DNA聚合 酶10U。反应程序为：94℃，预变性5分钟；主循环为：94℃变性1分钟，55℃ 1分钟，72℃5分钟，循环30次；72℃，后延伸5分钟。
上述PCR完毕后，在1％琼脂糖电泳上鉴定合成产物。割取1300bp左右的 明显条带，用Promega公司的凝胶回收试剂盒进行回收。
人工序列的鉴定
取5微升如上制备的本发明重组DNA，与1微升pGEM-T easy载体(Promega 产品)混合，加入2微升10X连接缓冲液(Promega产品)和1微升NEB的T4 DNA 连接酶，充分混合后在16℃反应10小时以上。按常规方法用所得重组载体转化 大肠杆菌DH5a菌株，经蓝/白斑筛选获得阳性克隆。酶切鉴定确认带有目的插入 片段的克隆，在ABI377全自动测序仪上对其进行双向测序。确认序列与本发明 设计的SEQ ID NO：1完全相符。该克隆在本发明中命名为：pGEM/rhOP-1，其中 的“r”表示重组。
天然hOP-1基因的制备
为了进行后文表达水平比较试验，另制备天然hOP-1基因。
取新鲜胎盘组织200mg(上海长海医院提供)，剪碎后在液氮中研磨至极细， 立即加入2ml TRIZOL匀浆(购自Invitrogene公司)，按厂家说明书提取总RNA。 所提总RNA在1.5％琼脂糖电泳上鉴定完整性，28sRNA、18sRNA两条标志带完 整清晰，表明所需的RNA没有降解。
根据已经发表的hOP-1 DNA序列(GenBank登录号：XM_030620)设计引物， 其中引物F(SEQ IN NO：21)设计在ORF上游6～20bp，并引入以斜体表示的Hind III位点。引物R(SEQ IN NO：22)中引入以斜体表示的BamHI位点：
引物F：5 GC AAGCTTAGCGCGTAGAGCCG 3
引物R：5 TA GGATCCCTAGTGGCAGGCC 3
合成上述引物(上海生工公司)并进行PAGE纯化。采用反转录试剂盒 (Promega公司)，将以上提取的总RNA以随机六核苷酸引物反转录成单链cDNA 模板。对反转录模板用引物F和引物R扩增hOP-1完整基因。具体扩增条件为： 50微升反应体系，其中包含1X PCR反应缓冲液，引物F和引物R的浓度均为 100pM，镁离子1.5mM，模板cDNA浓度为100微摩尔，含5U Pfu DNA聚合酶 (购自NEB公司)。扩增程序为：预变性：94℃2分钟；主循环：94℃1分钟，58 ℃1分钟，72℃2.5分钟，共30个循环；后延伸：72℃5分钟。平行进行5管扩 增以获取足量的扩增产物。以上扩增产物在1％琼脂糖电泳上进行鉴定。发现有 一分子量约1kb的单一条带，与预期大小相符。用凝胶回收试剂盒(Bio101产品)， 按照产品说明书，进行凝胶回收，得到纯化的DNA。
按照产品说明书，将上述所得纯化DNA插入pGEM-T载体(Promega产品)， 获得重组DNA。然后，用上述重组DNA按常规操作转化大肠杆菌DH5a菌株， 通过蓝/白斑筛选获得阳性克隆。挑选阳性克隆进行酶切鉴定，确认带有目的插入 片段的转化克隆。在ABI377全自动测序仪上对所得阳性转化克隆进行双向测序， 确认与已知hOP-1天然基因序列完全一致。该克隆在本发明中命名为： pGEM/hOP-1。
hOP-1基因天然序列与人工序列的表达及比较
用常规方法抽提前述天然hOP-1基因克隆pGEM/hOP-1和编码hOP-1的重组 核酸克隆pGEM/rhOP-1的DNA。分别用Nhe I和Xho I进行双酶切。在0.8％琼 脂糖电泳上进行分离，各切取分子量约1.3kd左右的带后用Promega公司的凝胶 回收试剂盒回收该片段，即天然和重组hOP-1 DNA。
将上述回收的天然和重组DNA连接到pMSG表达载体(购自Pharmacia公司) 的Nhe I/Xho I位点上，获得含天然hOP-1基因的表达载体pMSG/hOP-1和含本 发明重组hOP-1基因的载体pMSG/rhOP-1。
用购自Invitrogene公司的转染试剂盒，按照说明书，采用脂质体法，用以上 所得表达载体转染CHO细胞。转染后的CHO细胞经连续3个月的霉酚酸筛选， 其浓度从0.05uM到10uM，每两周增加一次浓度，每次霉酚酸的用量约为前一次 的2倍，具体视细胞生长情况而定。
挑选阳性克隆进行细胞培养，培养基为15％胎牛血清 (Gibco)+RPM1640/DEME；37℃，5％CO2培养箱中培养72小时进行扩增。然后 用极度稀释法进行单克隆化。用ELISA方法检测培养物上清液中的表达量，其中， 一抗为鼠抗人OP-1单抗(购自深圳晶美公司)，二抗为HRP标记的兔抗鼠单克隆 抗体(购自华美生物工程公司)。测定结果：含天然hOP-1基因的CHO克隆最高表 达强度为22.13mg/μL；含本发明编码hOP-1的重组核酸即工序列的CHO克隆最 高表达强度则高达139.43mg/μL，是天然基因表达强度的6.3倍。由此证明，本 发明编码hOP-1的重组核酸与天然hOP-1基因相比，显著提高了其在CHO细胞 中的表达。
hOP-1表达产物的生物活性鉴定
将CHO细胞株pMSG/hOP-1和pMSG/rhOP-1分别接种在50ml RPMI1640培 养基，37℃，5％CO2培养箱中进行培养。7日后取25ml细胞培养液，500RPM 离心10分钟取上清。
将上述两种来源培养上清分别置于Millipore Microcon MW15000的离心浓缩 管中，5000rpm离心30分钟，使其浓缩10倍左右。然后，以1∶5、1∶10、1∶20、 1∶50、1∶100的稀释比加入成骨细胞MC3T3-E1细胞培养基(GIBCO BRL公司产品 V0743)中。
将500μl上述加有不同浓度OP-1上清液的成骨细胞MC3T3-E1细胞培养基 加入到96孔板中，每种浓度6个孔。以不加OP-1上清液的成骨细胞MC3T3-E1 细胞培养基作为阴性对照。然后在每个孔中加入20微升细胞密度为1×106细胞 /ml的成骨细胞MC3T3-E1，37℃培养72小时后取50微升细胞测定碱性磷酸酶(AP) 活性。活性测定用NBT/BCIP法进行显色反应，在酶标仪上读取495nm处的光吸 收。结果如下：
从上述结果可以看出，无论是rhOP-1，还是rhHOP-1，其表达产物都有显著 的刺激成骨细胞AP表达的能力。由于AP水平是成骨细胞分化指征之一，说明 我们获得的含rhHOP-1细胞株能够表达有生物活性的OP-1蛋白。其中，rhHOP-1 上清液具有更高的生物活性，因为其表达强度较高。
序列表
<110>上海中信国健药业有限公司
<120>编码人成骨蛋白-1的重组核酸及其用途
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