技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种大豆蛋白GmAIRP1及其编码基因在培育 抗逆性植物中的应用。
背景技术
盐碱、干旱等非生物胁迫是限制植物生长发育的主要环境因子。这些环境因子导 致植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚 至引起不可逆伤害，导致整个植株死亡。植物在长期的进化中，逐渐形成了一系列应 答逆境胁迫的防御机制，其中泛素/26S蛋白酶体途径是应答胁迫的一个重要途径。泛 素连接酶E3决定靶蛋白的特异性识别，在泛素化过程中具有至关重要的作用。
大豆是我国重要的经济作物和粮食作物，干旱、盐碱等非生物胁迫导致其产量和 品质均大大下降，既不能满足国内人民生活的需求，也极大限制了大豆的出口。探究 泛素/26S蛋白酶体途径在大豆抵御非生物胁迫中的功能与作用机制、挖掘相关调节基 因，将有助于推动大豆抗逆遗传育种。
发明内容
本发明一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的新用途。
本发明提供的如下1)-3)中任一种物质在调控植物抗逆性中的应用：1)蛋白； 2)编码蛋白的DNA分子；3)含有编码蛋白的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因 细胞系或重组菌；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残 基的取代和/或缺失和/或添加。
本发明另一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的新用途。
本发明提供的如下1)-3)中任一种物质在培育抗逆植物中的应用：
1)蛋白；
2)编码蛋白的DNA分子；
3)含有编码蛋白的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
上述应用中，所述编码蛋白的DNA分子是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨 基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
3)与1)所限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少 具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％ 或至少具有99％同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA 分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
上述应用中，所述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性。
上述应用中，所述抗逆为抗干旱。
上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为烟草。
本发明第三个目的是提供一种重组载体。
本发明提供的重组载体，为将编码蛋白的DNA分子插入表达载体中，得到表达蛋 白的重组载体；
所述蛋白为如下(1)或(2)：
(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
上述重组载体中，所述编码蛋白的DNA分子是如下1)至3)中任一所述的DNA 分子：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨 基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
3)与1)所限定的DNA分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少 具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％ 或至少具有99％同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA 分子。
上述重组载体为将序列表中序列1所示的GmAIRP1基因替换表达载体PBI121的 BamHI和SacI酶切位点间DNA片段得到的载体，命名为pBI121-GmAIRP1。
上述转基因植物的抗干旱性高于所述目的植物体现在干旱胁迫或PEG胁迫下，转 GmAIRP1烟草的脯氨酸含量高于野生型烟草。
本发明的实验证明，本发明将基因GmAIRP1转入烟草中，得到转GmAIRP1烟草， 用干旱胁迫条件处理转GmAIRP1烟草和野生型烟草，转GmAIRP1烟草长势优于野生型 烟草；对两组植株的POD、CAT、MDA、脯氨酸含量测定结果显示，转基因植株清除自 由基和调节渗透压的能力总体高于野生植株，揭示GmAIRP1可能参与了植物的抗干旱 调控过程，为培育抗干旱性植物奠定基础。
附图说明
图1为GmAIRP1基因的RT-PCR扩增结果。
图2为100μmol/LABA诱导下GmAIRP1基因的表达模式。
图3为20％PEG6000诱导下GmAIRP1基因表模式。
图4为农杆菌中重组质粒的PCR鉴定。
图5为转GmAIRP1烟草的PCR产物电泳检测结果。
图6为转GmAIRP1烟草的RT-PCR检测。
图7为转GmAIRP1烟草的发育进程。
图8为野生型烟草种子与转GmAIRP1烟草种子对比。
图9为转GmAIRP1烟草的抗干旱表型分析。
图10为20％PEG6000处理下转GmAIRP1烟草和野生烟草中的POD、CAT和MDA含 量。
图11为20％PEG6000处理下转GmAIRP1烟草和野生烟草中脯氨酸含量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
合丰45大豆(不同株型大豆群体分布对产量形成的影响.大豆科学，2005，29(4)： 634-637.)；
龙江981烟草(烤烟新品种龙江981的选育及其特征特性.中国烟草科学，2015， 36(4)：18-23.)
农杆菌菌株为EHA105(影响根癌农杆菌EHA105感受态细胞转化效率因素的研究. 热带生物学报，2012,3(1)：22-27.)
植物表达载体质粒PBI121全长14Kb，含有卡那霉素抗性，记载在如下文献中：致 病疫霉NLP家族基因PITG_10839的克隆和功能分析.中国农业科学， 2014,47(5):895-902。
MS培养基，1/2MS培养基，卡那霉素(Kan)，头孢霉素(Cef)，利福平(Rif)、 6BA，NAA等。
RNA提取试剂盒RNApreppurePlantKit、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒DNA 提取试剂盒均购自天根生物有限公司；RNA反转录试剂盒FirstStrandcDNASynthesis Kit购自东洋纺生物有限公司；限制性内切酶BamHI和SacI均购自NEB公司。ExTaqDNA 聚合酶、dNTP、氨苄青霉素(Amp)购自宝生物(大连)有限公司。
实施例1、GmAIRP1基因的克隆及表达模式
一、GmAIRP1基因的克隆
利用primerpremier5.0设计引物，并分别在引物5′端加上BamHI和SacI两个 限制内切酶识别位点，引物序列如下：
GmAIRP1-P1：5′CGGGATCCATGGGCGGTTGCTGTTGT3′ BamHI
GmAIRP1-P2：5′GGAGCTCTTATTCAATGGGAGGGTCG3′ SacI
提取合丰45大豆的总RNA，反转录得到cDNA作为模板，用GmAIRP1-P1和 GmAIRP1-P2进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR扩增产物电泳结果如图1所示，M:DL2000分子量标准；1～8:PCR扩增产物， 得到约640bp大小的目的条带。
将上述PCR扩增产物与pMD-19Tsimple载体连接，转化E.coliDH5α，通过蓝 白斑筛选和PCR鉴定初步筛选出阳性克隆，对阳性克隆进行测序，结果该PCR产物具 有序列表中序列1所示的核苷酸，序列表中序列1所示的基因命名为GmAIRP1，该基 因的开放阅读框为序列1第1-642位核苷酸，其编码的蛋白命名为GmAIRP1，该蛋白 的氨基酸序列为序列表中序列2所示，该蛋白由213个氨基酸残基组成。
二、GmAIRP1基因在逆境胁迫和激素诱导下的表达模式分析
1、逆境胁迫
将合丰45大豆种子播种于蛭石中，在温度为28℃的温室中培养，当幼苗长至第 三片三出复叶时，进行各种处理。
(1)干旱胁迫处理：在干燥的蛭石中浇入含20％PFG6000的Hoagland溶液，处 理0～24h；
(2)ABA处理：在干燥的蛭石中浇入含100μmol/LABAHoagland溶液，处理0～ 24h。
分别于0.5h、1h、1.5h、3h、6h、12h和24h取不同处理组的大豆叶片，用去离 子水冲洗，液氮速冻后于-80℃保存，提取RNA，反转录得到cDNA作为模板，进行RT-PCR。
上述内参及目的基因引物如表1所示，
表1为内参及目的基因引物
ABA胁迫GmAIRP1基因表达结果如图2(上图为电泳图，下图为柱状图)所示，在 ABA处理之后，GmAIRP1基因的表达量大致呈现一个先降后升的趋势，通过柱状图可以 观察到，在处理后1h和6h时表达量最高，1h时达到峰值，在12h后该基因表达量趋 于平稳，这表明短时间的ABA处理能够诱导该基因上调表达。
PEG6000胁迫GmAIRP1基因表达结果如图3(上图为电泳图，下图为柱状图)所示， 在20％PEG6000处理后，GmAIRP1基因的表达趋势相比ABA处理后的表达趋势有所平 缓，基本上都维持在比较高的表达量。同样在0.5h该基因表达量有所下降，在1h上 升，直到3h后达到最大峰值，之后表达量趋于平稳，大致呈现一个先下降后上升的趋 势。这表明，短时间的干旱胁迫也可以诱导该基因表达量的升高。
实施例2、GmAIRP1基因的功能鉴定
一、重组载体的构建
将实施例1的一获得的642bp的PCR产物经过BamHI和SacI酶切，与经过相同酶 切的表达载体PBI121连接，得到重组载体。
经过测序，重组载体为将序列表中序列1所示的GmAIRP1基因替换表达载体PBI121 的BamHI和SacI酶切位点间DNA片段得到的载体，命名为pBI121-GmAIRP1。
二、重组菌的制备
三亲杂交法将目的质粒pBI121-GmAIRP1导入农杆菌EHA105，具体如下：
(1)将受体农杆菌EHA105接种于含有100mg/L利福平的YEP固体培养基上，28℃ 培养，待长出单菌落，挑取一个单菌落接种于液体培养基中，28℃振荡培养。
(2)将含有prk2013(上海北诺生物科技有限公司，货号addgene0697，Kan抗 性)的大肠杆菌接种于LB固体培养基上，37℃培养，待长出单菌落，挑取一个单菌落 接种于液体培养基中，37℃振荡培养(1天)。
(3)挑选带有pBI121-GmAIRP1质粒的大肠杆菌单菌落在含50mg/L的Kan液体 LB培养基中37℃震荡培养(1天)。
(4)待三种菌长到OD为0.5左右时，等体积(共150～200μl)混匀，涂布于 不含任何抗生素的YEP固体培养基上，28℃过夜培养。
(5)将长出的菌落转接到含有100mg/L利福平和50mg/LKan的YEP固体培养基 上，28℃培养2-4天，长出单菌落。
(6)将单菌落再次转接到含有100mg/L利福平和50mg/LKan的YEP固体培养基 上，28℃培养2天，长出单菌落。
将上述单菌落培养于50mg/L利福平和50mg/LKan的YEP液体培养基中，提取质 粒，用引物GmAIRP1-P1、GmAIRP1-P2进行扩增。
结果如图4所示，M：DL2000分子量标准；1-2：单克隆菌落PCR产物；3：空白 对照，得到642bp的为阳性克隆，将上述阳性克隆命名为EHA105/pBI121-GmAIRP1。
三、转GmAIRP1烟草的获得
1、农杆菌介导的烟草遗传转化制备转GmAIRP1烟草
(1)无菌苗的获得
取龙江981烟草(以下也称为野生型烟草)种子在95％的乙醇中浸泡1min，用 无菌水冲洗4次，然后用10％的次氯酸钠浸泡15min，无菌水冲洗6次，将种子接种到 MS培养基上或铺有3-4层潮湿的滤纸上，待植株长到4-5片真叶时即可用于感染。
(2)预培养：取烟草叶片，无菌条件下用解剖器将烟草叶片切成约5mm直径的叶 盘，放入MS1(MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA)培养基中预培养48小时。
(3)农杆菌活化：挑取一个转化后的农杆菌单菌落，接种于10mlYEP液体培养基 (含50mg/LRif和50mg/LKan)中，28℃，250r/min振荡培养过夜，次日，以1： 100比例转接至20ml上述YEP培养基中活化(为避免生长过度，可多接种几瓶)，28℃， 250r/min振荡培养至对数生长期(OD600＝0.5～0.6)。
(4)侵染与共培养：将烟草叶圆片浸入活化的农杆菌菌液中5～8min。用灭菌的 滤纸吸净多余的菌液，置于MS1培养基上，于黑暗处28℃共培养30～48h。
(5)芽诱导：将叶片转置于诱导出芽的MS2选择培养基(MS1+100mg/L Kan+500mg/LCef)上，室温25℃，16h，3000Lux光照条件下培养。三天转一次，连 续转三次后，以后每两周转一次。
(6)生根和移栽：待不定芽长到1厘米左右时，将芽转移至MS3培养基(1/2MS+0.2 mg/LNAA+l00mg/LKan+250mg/LCef)上诱导生根，等根长到6-7厘米时，移至蛭石中， 一个星期后将植株移入土壤中，得到T0代转GmAIRP1烟草。
上述发展流程如图7所示，A:愈伤组织的诱导和分化；B：再生植株；C：阳性植 株开花与结实。
2、转GmAIRP1烟草的分子生物学鉴定
1)PCR鉴定
提取T0代转GmAIRP1烟草叶片的基因组DNA，用引物GmAIRP1-P1、GmAIRP1-P2 进行PCR扩增，得到PCR产物。以野生型烟草为对照。
PCR产物电泳结果如图5所示，M：DL2000分子量标准；1-7：T0代转GmAIRP1烟 草；8：阳性对照pBI121-GmAIRP1；9：野生型烟草对照；10：空白对照，得到642bp 为PCR鉴定阳性T0代转GmAIRP1烟草。
(2)RT-PCR鉴定
提取上述PCR鉴定阳性T0代转GmAIRP1烟草的RNA，反转录为cDNA，用GmAIRP1 基因引物P1、P2进行RT-PCR检测，得到PCR产物。
PCR产物电泳结果如图6所示，M：DL2000分子量标准；1-3：阳性T0代转GmAIRP1 烟草；4：野生型烟草对照；5：空白对照6：阳性对照pBI121-GmAIRP1，得到642bp 为阳性T0代转GmAIRP1烟草。
采用同样的方法将pBI121载体转入野生型烟草中，得到T0代转pBI121烟草，采 用同样的方法进行PCR鉴定和RT-PCR鉴定，结果与野生型烟草无显著差异。
T0代收种得到T1代。
四、转GmAIRP1烟草的表型及抗逆性检测
1、表型检测
观察阳性T0代转GmAIRP1烟草和野生型烟草的种子，结果如图8所示，A：野生 型烟草种子；B：阳性T0代转GmAIRP1烟草种子，可以看出，阳性T0代转GmAIRP1烟 草种子相比野生型烟草种子颜色更深，接近黑色，籽粒也没有野生型种子饱满，推测 可能是因为外源基因的转入影响了烟草的结实，具体作用机制还需进一步研究。
2、转基因烟草的抗逆性鉴定
10mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液；POD反应液；CAT反应液；3％磺基水杨酸水溶液； 2.5％酸性茚三酮显色液；甲苯；85％磷酸；冰乙酸；10％TCA；0.6％TBA；Hoagland 溶液；NaCl；PEG6000；6-BA；NAA等。
1)将阳性T0代转GmAIRP1烟草进行无性繁殖
选用阳性T0代转GmAIRP1烟草的幼叶叶片，经去离子水洗后用70％乙醇擦洗叶片 表面，后立即置于10％次氯酸钠溶液中进行表面灭菌6分钟，接着在无菌条件下，用 无菌去离子水洗涤4-5次，用无菌吸水纸吸去叶片表面的水分，并除去主脉。切成约 5x5(毫米)的小块，接种于装有MS(2mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+100mg/LKan) 培养基，每瓶5块。材料接种后,将培养瓶置于25士l℃的恒温培养间进行培养,每 天用日光灯光照10小时，将所得芽转入1/2MS(0.2mg/LNAA+100mg/LKan)培养 基中进行生根处理，待幼苗长出2-3片幼叶，作为无性繁殖转GmAIRP1烟草。
2)胁迫处理
将上述无性繁殖转GmAIRP1烟草、野生型烟草和T0代转pBI121烟草分别移到含 有含有200mmol/L甘露醇的1/2MS培养基中，置于25士l℃的恒温培养室进行培养， 每天用日光灯光照10小时，21天后观察幼苗生长形态，并拍照。
结果如图9所示，上：野生型植株(A1-A3)；下：无性繁殖转GmAIRP1烟草(B1-B3)， 可以看出，在干旱处理下，转GmAIRP1烟草生长情况好于野生型烟草，因此转GmAIRP1 烟草(B1-B3)的抗干旱性高于野生型烟草。
3)检测胁迫处理后相关生理指标
选取无性繁殖转GmAIRP1烟草、野生型烟草和T0代转pBI121烟草栽种于蛭石中， 用Hoagland溶液培养一个月，选择长势一致的植株分别进行胁迫处理。干旱胁迫处 理：在干燥的蛭石中浇入含20％PEG6000的Hoagland溶液，处理3d。分别在第1d、 2d、3d进行取材，将所取材料用液氮冷冻后存于-80℃冰箱待用。实验设三次重复。
A、抗氧化酶活性测定
(1)酶液的提取
分别称取0.1g各组经干旱胁迫处理的无性繁殖转GmAIRP1烟草、野生型烟草和 T0代转pBI121烟草叶片加入2ml预冷的50mmol/L磷酸缓冲液，充分研磨至无粗纤维 为止，分装在小离心管中，再用1mlpH7.0的磷酸缓冲液洗净研钵，洗液一并转入50ml 心管中，10000rpm离心20min，吸取上清液2ml即为POD和CAT粗酶提取液。
称取0.15g各组经干旱胁迫处理的无性繁殖转GmAIRP1烟草、野生型烟草和T0代 转pBI121烟草叶片，加1ml的10％TCA于研钵中研磨，然后再加0.5mlTCA继续研磨， 匀浆在4000r/min离心10min,上清液即为MDA粗酶提取液。
(2)酶活性测定
a、POD活性的测定
取上清液50μl加入比色杯中(对照加磷酸缓)，加3ml反应液，马上读470nm 下的OD值并计时，每隔1min读1次OD470值(读0，1，2min)。
计算公式：POD总活性(Ug/min)＝△A470*VT/VS*W*0.01*t；
注：△A：反应时间内吸光值的变化，VT：总粗酶液体积(ml)，VS：测定时所用 粗酶液体积(ml)，W：样品鲜重(g)，t：时间(min)。
b、CAT活性的测定
分别吸取上清酶液和用沸水煮过的上清酶液200μl加入比色杯中(对照加磷酸)， 加3ml反应液，马上读240nm下的OD值并计时，每隔30S再读一次(读第0，1，2， 3min的OD值)。
计算公式：CAT总活性(Ug/min)＝[A1-(A2+A3)/2]*VT/0.1*VS*W*t；
注：A1:加入煮死酶液的对照管吸光值，A2、A3：样品吸光值，VT：总粗酶液体积 (ml)，VS：测定时所用粗酶液体积(ml)，W：样品鲜重(g)，t：时间(min)。
c、MDA活性的测定
取离心的上清液2ml(对照用2ml蒸馏水代替)，加入2ml0.6％TBA，混合后于沸 水中反应15min,取上清夜测定450、532及600nm处的OD值。
计算公式：
MDA浓度(μmol/L)＝6.45×(D532-D600)-0.56×D450
MDA含量(μmol/g)＝MDA浓度(μmol/L)×提取液体积(ml)/鲜重(g)
结果如图10所示，可以看出，在20％PEG6000处理下两组植物的POD含量大致呈 现出先升后降的趋势。胁迫第1天，转GmAIRP1烟草的POD活性达到最大峰值，显著 高于野生型烟草POD的活性。随着胁迫时间增加两组植株POD活性均下降，可能是随 着胁迫时间的增长，两组植株氧化物酶系统遭到破坏所致。由此推测，短时间内转 GmAIRP1烟草可先启动抗氧化酶系统抵御外界胁迫。
20％PEG6000处理下两组植株的CAT活性变化大致呈现先降低后升高最后降低的趋 势，在胁迫第二天达到峰值。转GmAIRP1烟草的CAT的活性均高于野生型烟草。
20％PEG6000处理下，转GmAIRP1烟草与野生型烟草的MDA含量都不断累积，但转 GmAIRP1烟草MDA含量均低于野生植株，表明膜质过氧化程度低于野生型植株，可能 的原因是GmAIRP1基因的表达能更有效的启动转基因植株的抗氧化酶系统，以降低干 旱对膜的损伤程度。
野生型烟草和T0代转pBI121烟草结果无显著差异。
由此推测，干旱胁迫下，转基因植株的抗逆性高于野生植株。
B、游离脯氨酸含量的测定
在正常的生长环境下，植物中游离脯氨酸的含量较低，但植物遇到干旱、低温、 盐碱等逆境胁迫时，游离的脯氨酸会大量累积，且累积指数与植物的抗逆性呈正相关， 因此，脯氨酸可以作为植物抵抗逆境胁迫的一项生理生化指标。
(1)标准曲线的制作
取6支具塞试管分别按下表加入下列试剂：
表2
加入表中试剂后，置于沸水浴中加热30min。取出冷却，各试管再加入4ml甲苯， 振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。用移液器轻轻吸取各管上层脯氨 酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定OD值。以1～ 5号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。求出线性回归方程 (y＝0.018x-0.0205R2＝0.9741)。根据线性回归方程和计算公式求出游离脯氨酸的含 量。
(2)样品的测定
1)脯氨酸的提取
称取各组经干旱胁迫处理的无性繁殖转GmAIRP1烟草、野生型烟草和T0代转 pBI121烟草叶片各0.2g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨 酸溶液，在沸水浴中提取10min(提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管 中，滤液即为脯氨酸的提取液。实验设三次重复。
2)脯氨酸含量的测定
吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml2.5﹪酸性茚三酮试剂， 在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片 刻，取上层液至10ml离心管中，在3000r/min离心5min。用吸管轻轻吸取上层脯氨 酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定OD值。
3)计算公式：
从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：
脯氨酸含量(μg·g－1Fw)＝X×提取液总量(ml)/样品鲜重(g)×测定时提 取液用量(ml)。
注：X为从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μg)
结果如图11所示，20％PEG6000处理下，转GmAIRP1烟草的游离脯氨酸的含量随 着胁迫天数的增加呈迅猛上升趋势，虽然野生型烟草的游离脯氨酸含量也有所上升， 但是上升幅度小，显著低于转GmAIRP1烟草的游离脯氨酸含量。
野生型烟草和T0代转pBI121烟草结果无显著差异。