一种微生物发酵工艺.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101696423 B (45)授权公告日 2013.07.24 CN 101696423 B *CN101696423B* (21)申请号 200910186403.9 (22)申请日 2009.10.27 C12P 1/02(2006.01) C12R 1/845(2006.01) (73)专利权人 浙江天台药业有限公司 地址 317200 浙江省台州市天台县城关丰泽 路浙江天台药业有限公司 (72)发明人 郭一平 (74)专利代理机构 台州蓝天知识产权代理有限 公司 33229 代理人 刘颖 CN 1706961 A,2005.12.14, 全文 . CN 18。

2、76808 A,2006.12.13, 全文 . 童望宇等 . 甾体化合物微生物转化 的特点 .制药微生物技术 - 基础与应 用 .2006,251-252. (54) 发明名称 一种微生物发酵工艺 (57) 摘要 本发明涉及一种微生物发酵工艺， 本工艺包 括种子培养和发酵消毒两大过程， 其中种子培养 过程又包括如下步骤 ： 小米斜面的配制、 无菌室 操作过程和刮种， 发酵消毒过程包括如下步骤 ： 先配料， 再将制作好的菌种投入发酵罐后进行菌 种培养， 然后将水、 洗衣粉、 粉碎后的沃氏物投入 投料罐内经搅拌压入发酵罐， 最后进行发酵氧化、 放罐和板框过滤 ； 本发明在发酵培养的投料过程 中，。

3、 把助溶剂由有机溶剂替换成水和少量洗衣粉， 既环保又能降低工艺成本， 还可以简化废液处理 工序， 其中洗衣粉起到分散剂的作用， 因此本发明 实用性强， 适合推广使用。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 马驰 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书6页 附图1页 (10)授权公告号 CN 101696423 B CN 101696423 B *CN101696423B* 1/2 页 2 1. 一种微生物发酵工艺， 包括如下步骤 ： a、 培养种子， 其又包括下述步骤 ： 配置培养基 ： 取小。

4、米 0.0001 0.0002% （重量） ， 清洗后浸泡 25 35 分钟， 接着将小 米蒸熟， 并控制压力为 0.04 0.06Mpa、 温度 100 115的条件下进行保压消毒 10 20 分钟， 然后将蒸熟的小米取出后碾碎装入茄子瓶里进行消毒， 消毒后冷却至常温时， 将瓶里 的小米舒展斜放构成小米种子斜面即培养基 ； 进行无菌室操作 ： 在无菌室内将小米种子斜面移至小米空白斜面， 完毕后放在恒室 温内培养 8 12 天， 然后将培养 8 12 天后的黑根霉种子放在温度为 0 6的冰箱中保 存 ； 刮种 ： 用刮棒将种子斜面上的黑根霉种子刮入瓶内并打散均匀成菌悬液， 然后用棉 塞封口， 。

5、同法刮剩余的种子斜面， 上述菌悬液每48瓶合成一瓶放入盛无菌水的三角烧瓶 中等待接种 ； b、 发酵消毒， 其也包括下述步骤 ： 配料 ： 按总量 3.5 4%（重量） 的葡萄糖浆、 3.3 3.6%（重量） 的玉米浆、 0.11 0.15%（重量） 的硫酸铵、 0.010 0.015%（重量） 的泡敌、 0.50% 0.85%（重量） 的沃氏氧 化物， 其重量记为 W1、 剩余量为水的成份投入发酵罐， 接着加入碱调 PH 至 4.2 4.4 后关好 罐盖并开搅拌， 而后进行消毒并接种 ； 发酵培养及投料 ： 先接种， 后进行菌种培养， 菌种培养的温度控制在 264， 压力 控制在 0.060。

6、.10MPa， 并按培养时间在 1 2h 内的空气流量为 450 550m3/h、 培养时间 在 3 14h 内的空气流量为 600 700m3/h、 培养时间在 15h 投料前的空气流量为 700 800m3/h 的要求控制空气流量 ； 开始投料前在投料罐内加入重量为 3 6W1的水， 加入洗衣 粉 0.0024 0.048%（重量） ， 然后将重量为 0.8 2.0W1的沃氏氧化物粉碎后投入投料罐 内， 开搅拌， 关闭罐盖并消毒投料管路， 当 PH 下降转上升时即可将料液压入发酵罐 ； 发酵氧化及放罐 ： 投料结束后进入氧化期， 当氧化 25 35h 后开始做镜检， 若发现 染菌严重应及时。

7、放罐， 氧化期结束取样并检测残糖含量， 取样后开始加热， 加热温度升至 70 80后停搅拌进行压料， 压料时加大罐压保证罐内料液翻腾， 然后将料液压入中转 罐 ； 板框过滤 ： 发酵液压入中转罐后进行放料， 放料时利用罐压先进行压滤， 当菌丝压干 时， 用压缩空气吹干， 然后把菌丝从板上卸下来， 将滤饼粉碎成细粉， 粉碎完后装袋。 2. 根据权利要求 1 所述的微生物发酵工艺， 其特征在于所述进行无菌室操作中， 将小 米种子斜面移至小米空白斜面的操作步骤为 ： 打开种子瓶， 用移种针插入种子瓶挑取一粒 黄豆大的菌种， 把菌种放到无菌水中再加入无菌水直至以肉眼能观看到孢子为准， 同法做 另一个平。

8、行样， 然后根据无菌操作方法分别用吸管吸取上述制得的菌液， 并移到空白小米 斜面上。 3. 根据权利要求 1 所述的微生物发酵工艺， 其特征在于所述发酵消毒程序中， 消毒并 接种的操作步骤为 ： a、 保压灭菌 ： 开蒸汽加热， 控制蒸汽总压力在 0.1 0.25Mpa， 并搅拌， 待罐温达 100 时， 停搅拌， 用蒸汽直接灭菌， 调节罐内液体剧烈翻腾， 使之均匀 ； 当罐压达 0.08Mpa 时， 控 制蒸汽总压 ； 当罐内温度达 118时开始保温， 控制温度 118 120， 时间 20 30 分钟， 权 利 要 求 书 CN 101696423 B 2 2/2 页 3 压力控制在 0.。

9、09 0.10MPa ； b、 保压结束后冷却 , 当罐压降至 0.03 0.05Mpa 时， 通压缩空气进行保压， 待罐温降 至 301时进行接种 ； c、 接种前检查罐内温度、 罐压是否正常， 接种温度 261， 用 75% 乙醇擦拭罐上接种 口， 关空气进气阀， 当发酵罐气体快排空时， 迅速将火圈放在接种口上， 等罐内气体排完， 点 燃火圈， 将种液从火焰口倒入发酵罐内。 4. 根据权利要求 1 所述的微生物发酵工艺， 其特征在于所述板框过滤在压滤过程中， 需检查出液阀是否有菌丝逸出， 如发现菌丝逸出， 必须马上关掉进料阀， 并用压缩空气吹一 段时间， 并再试压滤， 如没有发现跑料， 再。

10、继续压， 否则停止压滤机工作。 权 利 要 求 书 CN 101696423 B 3 1/6 页 4 一种微生物发酵工艺 技术领域 0001 本发明属于发酵技术， 涉及一种微生物发酵工艺。 背景技术 0002 现有的微生物发酵工艺， 在发酵培养的投料过程中， 均采用有机溶剂如丙二醇等 作为助溶剂， 由于有机溶剂自身价格高， 且处理废液也需要不少的成本还可能会造成环境 污染， 随着人们环保意识的不断提高以及企业为取得竞争力而追求低成本、 高效率的经营 模式， 这种传统的微生物发酵工艺将难以再沿用。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种环保、 低成本的微生物发酵工艺。 0004 为达到上述发。

11、明目的本发明所采用的技术方案是 ： 0005 一种微生物发酵工艺， 包括如下步骤 ： 0006 a、 培养种子， 其又包括下述步骤 ： 0007 配置培养基 ： 取小米 0.0001 0.0002%， 清洗后浸泡 25 35 分钟， 接着将小米 蒸熟， 并控制压力为 0.04 0.06Mpa、 温度 100 115的条件下进行保压消毒 10 20 分 钟， 然后将蒸熟的小米取出后碾碎装入茄子瓶里进行消毒， 消毒后冷却至常温时， 将瓶里的 小米舒展斜放构成小米种子斜面即培养基 （重量百分比） ； 0008 进行无菌室操作 ： 在无菌室内将小米种子斜面移至小米空白斜面， 完毕后放在 恒室温内培养 。

12、8 12 天， 然后将培养 8 12 天后的黑根霉种子放在温度为 0 6的冰箱 中保存 ； 0009 刮种 ： 用刮棒将种子斜面上的黑根霉种子刮入瓶内并打散均匀成菌悬液， 然后 用棉塞封口， 同法刮剩余的种子斜面， 上述菌悬液每48瓶合成一瓶放入盛无菌水的三角 烧瓶中等待接种 ； 0010 b、 发酵消毒， 其也包括下述步骤 ： 0011 配料 ： 按总量 3.5 4% 的葡萄糖浆、 3.3 3.6% 的玉米浆、 0.11 0.15% 的硫 酸铵、 0.010 0.015% 的泡敌、 0.50% 0.85% 的沃氏氧化物 （沃氏氧化物重量记为 W1） 、 剩 余量为水的成份投入发酵罐， 接着加。

13、入碱调 PH 至 4.2 4.4 后关好罐盖并开搅拌， 而后进 行消毒并接种 （重量百分比） ； 0012 发酵培养及投料 ： 先接种， 后进行菌种培养， 菌种培养的温度控制在 264， 压力控制在 0.060.10MPa， 并按培养时间在 1 2h 内的空气流量为 450 550m3/h、 培养 时间在 3 14h 内的空气流量为 600 700m3/h、 培养时间在 15h 投料前的空气流量为 700 800m3/h 的要求控制空气流量 ； 开始投料前在投料罐内加入重量为 3 6W1的水， 加 入洗衣粉 0.0024 0.048%， 然后将重量为 0.8 2.0W1的沃氏氧化物粉碎后投入投。

14、料罐 内， 开搅拌， 关闭罐盖并消毒投料管路， 当 PH 下降转上升时即可将料液压入发酵罐 （重量百 分比） ； 说 明 书 CN 101696423 B 4 2/6 页 5 0013 发酵氧化及放罐 ： 投料结束后进入氧化期， 当氧化 25 35h 后开始做镜检， 若 发现染菌严重应及时放罐， 氧化期结束取样并检测残糖含量， 取样后开始加热， 加热温度升 至 70 80后停搅拌进行压料， 压料时加大罐压保证罐内料液翻腾， 然后将料液压入中转 罐 ； 0014 板框过滤 ： 发酵液压入中转罐后进行放料， 放料时利用罐压先进行压滤， 当菌丝 压干时， 用压缩空气吹干， 然后把菌丝从板上卸下来， 。

15、将滤饼粉碎成细粉， 粉碎完后装袋。 0015 所述进行无菌室操作中， 将小米种子斜面移至小米空白斜面的操作步骤为 ： 打开 种子瓶， 用移种针插入种子瓶挑取一粒黄豆大的菌种， 把菌种放到无菌水中再加入无菌水 直至以肉眼能观看到孢子为准， 同法做另一个平行样， 然后根据无菌操作方法分别用吸管 吸取上述制得的菌液， 并移到空白小米斜面上。 0016 所述发酵消毒程序中， 消毒并接种的操作步骤为 ： 0017 a、 保压灭菌 ： 开蒸汽加热， 控制蒸汽总压力在 0.1 0.25Mpa， 并搅拌， 待罐温达 100时， 停搅拌， 用蒸汽直接灭菌， 调节罐内液体剧烈翻腾， 使之均匀 ； 当罐压达 0.0。

16、8Mpa 时， 控制蒸汽总压 ； 当罐内温度达 118时开始保温， 控制温度 118 120， 时间 20 30 分钟， 压力控制在 0.09 0.10MPa ； 0018 b、 保压结束后冷却 , 当罐压降至 0.03 0.05Mpa 时， 通压缩空气进行保压， 待罐 温降至 301时进行接种 ； 0019 c、 接种前检查罐内温度、 罐压是否正常， 接种温度 261， 用 75% 乙醇擦拭罐上 接种口， 关空气进气阀， 当发酵罐气体快排空时， 迅速将火圈放在接种口上， 等罐内气体排 完， 点燃火圈， 将种液从火焰口倒入发酵罐内。 0020 所述板框过滤在压滤过程中， 需检查出液阀是否有菌丝。

17、逸出， 如发现菌丝逸出， 必 须马上关掉进料阀， 并用压缩空气吹一段时间， 并再试压滤， 如没有发现跑料， 再继续压， 否 则停止压滤机工作。 0021 本发明在发酵培养的投料过程中， 把助溶剂由有机溶剂替换成水和少量洗衣粉， 既环保又能降低工艺成本， 还可以简化废液处理工序， 其中洗衣粉起到分散剂的作用， 因此 本发明实用性强， 适合推广使用。 附图说明 0022 图 1 是本发明的工艺流程图。 具体实施方式 0023 一种微生物发酵工艺的步骤如下 ： 0024 1 种子培养过程 ： 0025 1.1 培养基 （小米斜面） 的配制 ： 0026 称一定小米数量， 清洗后浸泡 30 分钟后， 。

18、将小米放托盘中铺平， 置消毒柜内蒸熟， 消毒保压时控制压力为 0.05Mpa、 温度为 105 110， 保压 15 分钟 ； 消毒结束后， 将蒸熟 的小米取出碾碎， 装入茄子瓶里， 每个茄子瓶装量为 10g， 扎好瓶口放入消毒柜里消毒 30 分 钟， 压力为 0.10Mpa， 消毒后冷却至常温时， 将瓶里的小米舒展。 0027 1.2 无菌室操作过程 ： 说 明 书 CN 101696423 B 5 3/6 页 6 0028 1.2.1 准备工作 ： 洗澡后穿上白色工作服带上小米种子斜面、 小米空白斜面及另 外使用物品移进无菌室迅速将外缓冲间门关上， 更换无菌衣裤拖鞋及带上口罩， 进第二缓 。

19、冲间， 同样将使用物品移置内无菌室， 同时将门关上进行无菌操作， 先用 75% 乙醇棉花擦净 工作台， 浸泡自己的双手， 然后分别在操作台左、 中、 右三处放三支平板， 作无菌室无菌试 验。 0029 1.2.2 小米种子斜面移小米空白斜面操作 ： 右手大拇指、 食指、 中指拿移种针， 左 手取茄子瓶， 右手小拇指、 无名指将种子瓶上的棉塞打开， 移种针进入种子瓶挑取一粒黄豆 大的菌种后， 将棉塞塞回种子瓶后， 分别用上述无菌操作方法把菌种放到 100ml 左右无菌 水中， 再在 100ml 左右无菌水中倒入 150ml 左右无菌水中 （以肉眼能观看到孢子为度） ， 同法 做另一个平行样， 然。

20、后根据无菌操作方法分别用吸管吸取上述制得的菌液， 并移到空白小 米斜面上， 移种完毕后的斜面， 瓶口用塞子塞紧， 用纱布包好， 用敲打法把小米同菌液充分 混匀， 铺成斜面放入恒温室内在26下恒温培养910天， 记录好移种用的原始种子批号、 日期、 瓶数及暴露实验菌落数， 培养910天后的黑根霉种子分别装于干塑料袋内， 按上批 号牌子， 放冰箱 2 4保存。 0030 1.3 刮种 ： 0031 1.3.1 准备工作 ： 将刮棒、 塞子、 纱布、 牛皮纸包扎好后和盛有 800ml 水的三角烧瓶 12 瓶 （1 批） 一起灭菌 1 小时， 压力为 0.15Mpa， 冷却后备用 ； 无菌衣及口罩灭菌。

21、 30 分钟， 生 产用具消毒后不得超过两天 ； 接种用具 （除菌种外） 放置无菌室紫外灯灭菌 45 分钟以上， 同 时开启净化工作电源， 通风 30 分钟 ； 操作人员洗澡后穿上工作服带种子斜面进无菌室， 同 时穿上连帽带鞋式无菌衣， 用 75% 乙醇擦抹工作台并浸泡双手。 0032 1.3.2 刮种 ： 将接种瓶内的无菌水分别倒入 6 只斜面内， 右手大拇指、 食指、 中指将 刮棒从玻璃管中取出， 左手拿斜面、 右手无名指、 小指打开棉塞， 用刮棒将菌丝孢子打散均 匀成菌悬液， 然后塞上棉塞， 同法刮剩余的种子斜面， 上述菌悬液每56瓶合成一瓶 （盛无 菌水的三角烧瓶） ， 操作节结束后填。

22、写好原始记录 , 等待接种。 0033 2 发酵消毒 ： 0034 2.1 配料 ： 0035 2.1.1 原辅料配比及投料量 0036 原辅料名称配比投料量备注 葡萄糖浆3.7%1400Kg提供营养成分 玉米浆3.45%1300Kg提供营养成分 硫酸铵0.13%49Kg提供营养成分 氢氧化钠适量适量调 PH 泡敌0.012%4.5Kg消除泡沫 沃氏氧化物0.55 0.78%200 300Kg（W1）底物 说 明 书 CN 101696423 B 6 4/6 页 7 0037 2.1.2 配料 ： 将玉米浆压入计量罐， 至 1300Kg， 然后用泵完全打入发酵罐内， 随后 将葡萄糖浆从葡萄糖浆。

23、罐压入计量罐， 一直压至 1400Kg， 接着用蒸汽冲洗葡萄糖浆管路， 直 至彻底冲干净为止， 然后将葡萄糖浆泵入发酵罐内， 再用饮用水清洗计量罐 2-5 次， 然后开 饮用水打入发酵罐至累计用水量38000L， 同时从发酵罐口投入49Kg硫酸铵， 4.5Kg泡敌 （根 据物料情况， 以及消毒时泡沫多少， 可适当增加或减少泡敌使用量， 范围在 4.5 14Kg） 及 200 300Kg（记为 W1） 沃氏氧化物， 当所有物料都按要求投入发酵罐内后， 关打料泵， 称适 量片碱调 PH 至 4.2 4.4 后关好罐盖， 开搅拌准备消毒。 0038 2.2 消毒 ： 0039 2.2.1 培养基消毒。

24、 ： 开启盘管排水阀门， 再开盘管蒸汽加热。控制蒸汽总压力在 0.1 0.25Mpa， 待罐温达 100时， 停搅拌， 关盘管蒸汽， 改用三路蒸汽直接灭菌， 先开底部 蒸汽， 再开空气管蒸汽， 最后开取样管蒸汽， 略开排空阀， 开发酵罐罐头各排气阀门适量， 调 节罐内液体剧烈翻腾， 使之均匀 ； 当罐压达 0.08Mpa 时， 控制三路蒸汽总压， 当罐内温度达 118时开始保温， 控制温度118120， 时间2030分钟， 压力控制在0.090.10MPa ； 保压结束后， 关各排气阀门， 再关三路蒸汽 （顺序依次为 ： 取样管、 底部、 空气分布管） ， 开盘 管循环水进行冷却， 开空气排空。

25、阀， 当罐压降至 0.03 0.05Mpa 时， 通压缩空气进行保压 ； 当温度降至 35时， 取培养基测残糖含量， 待罐温降至 301时进行接种。 0040 2.2.2 接种 ： 接种前检查罐内温度， 罐压是否正常， 当温度降至 261， 用 75% 乙 醇擦拭罐上接种口， 关空气进气阀， 当发酵罐气体快排空时， 迅速将火圈放在接种口上， 等 罐内气体排完， 点燃火圈， 带好防火手套， 将种液从火焰口倒入发酵罐内， 接种完后， 用湿棉 布包好火圈， 关好接种口， 开搅拌， 开空气进气阀， 调节排气阀， 控制好罐压及流量， 进入发 酵培养过程。 0041 2.3 发酵培养 ： 0042 2.3。

26、.1 接种后进入菌种培养期， 培养期温度控制在 261， 压力控制在 0.060.01MPa。 0043 2.3.2 根据目前的沃氏投料量， 按以下要求控制培养期的空气流量 ： 0044 培养时间 （h）空气流量 （m3/h） 1 2500 3 14600 700 15 结束700 800 0045 2.4 投料 ： 0046 2.4.1 原辅料配比及投料量 说 明 书 CN 101696423 B 7 5/6 页 8 0047 0048 2.4.2 准备工作 ： 在投料罐内加入 1000 1500kg 饮用水， 升温至 100后冷却至 70 80， 后加入洗衣粉 10kg， 然后将粉碎后的沃。

27、氏氧化物 W2=（600 720） -W1kg 投入投 料罐内， 开搅拌， 关闭罐盖， 在菌种培养24小时后， 开始取样做转化率， 并用PH计检测PH， 当 PH下降转上升时即可投料， 一般此时转化率在2035%左右， 当检测数据接近投料点时， 用 高压蒸汽对投料管路进行消毒直至投料。 0049 2.4.3 投料 ： 当具备投料条件时， 开始投料， 投料时控制发酵罐的压力在 0.03Mpa， 开冷冻水降温， 当投料罐压力升至 0.10 0.15Mpa， 打开投料罐压料管路阀门， 将料液压入 发酵罐， 调节投料罐空气阀门控制投料时间 10 20 分钟， 投料完毕后， 控制发酵罐的空气 流量 75。

28、0 800m3/h， 温度在 261， 压力 0.030.01Mpa。 0050 2.5 发酵氧化过程 ： 0051 2.5.1 按目前投料量， 氧化期不同阶段的温度、 压力与流量控制如下 ： 0052 0053 2.5.2氧化30h后开始取样， 每两小时取样一次， 做镜检， 并检测转化率和PH,目的 是对罐内氧化情况作初步的了解， 主要测其是否染菌、 以及转化情况， 发现异常情况可及时 解决 ； 并将各项数据及时记录， 菌检发现有染菌情况， 应及时采取措施， 视情况的轻重来决 定是否放罐 ； 若镜检只发现很少杂菌， 且滤速良好， 可适当延长氧化时间 ； 若镜检发现情况 比较严重， 应及时加热。

29、放罐 ； 若镜检正常、 PH 值在允许范围内且滤速良好， 氧化 30 40 小 时后即加热放罐。 0054 2.6 放罐 ： 0055 氧化期结束加热前用烧杯取样， 送质检测残糖含量， 取样后开始加热， 关循环水或 冷冻水进水阀门， 开启盘管排污阀门， 开盘管蒸汽进行加热， 加热温度升至 75后将料液压 入中转罐。 0056 2.7 板框过滤 ： 说 明 书 CN 101696423 B 8 6/6 页 9 0057 2.7.1 过滤 ： 待发酵液压入中转罐后放料， 放料时打开压滤机的出发酵液阀门， 关 掉空气阀门和高压水泵阀门， 打开回流阀门， 利用罐压先压滤 20 分钟左右 ； 当发现出液阀 的水流量过小时关掉回流阀， 开启高压泵， 控制压力 0.8Mpa， 压滤时， 检查出液阀是否有 菌丝逸出， 如发现菌丝逸出， 必须马上关掉进料阀， 并用压缩空气吹一段时间， 并再试压滤 ； 当出液口也很少有发酵液出来时， 说明菌丝已压干， 关掉高压水泵， 用压缩空气吹干 ； 后把 菌丝从板上卸下来， 送到粉碎间。 0058 2.7.2 粉碎 ： 将滤饼先用粗粉碎机粉碎成粗粉， 再用细粉碎机粉碎成细粉， 粉碎完 后装袋， 系上袋口， 得含霉菌氧化物菌丝。 说 明 书 CN 101696423 B 9 1/1 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 101696423 B 10 。