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本申请要求2008年1月30日提交的美国临时专利申请No.61/024825的权 益，通过述及将其公开内容完整收入本文用于所有目的。
发明领域
本发明关注包含结合HER2结构域II的主要种类HER2抗体及其酸性变体 的组合物。本发明还涉及包含所述组合物的药物配制剂及所述组合物的治疗 用途。
发明背景
HER2抗体
受体酪氨酸激酶的HER家族是细胞生长、分化和存活的重要介质。该受 体家族包括四个独特的成员：表皮生长因子受体(EGFR、ErbB1或HER1)、 HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbB1基因编码的EGFR已被认为是人类恶性肿瘤的病因。具体而言， 在乳癌、膀胱癌、肺癌、头癌、颈癌和胃癌以及成胶质细胞瘤中已经观察到 EGFR表达的升高。EGFR受体表达的升高常常与EGFR配体，转化生长因子 α(TGF-α)的产量增加有关，这样的肿瘤细胞通过自分泌刺激途径导致受体 活化。BaselgaandMendelsohn，Pharmac.Ther.64：127-154(1994)。针对EGFR 或其配体TGF-α或EGF的单克隆抗体已经作为治疗此类恶性肿瘤的治疗剂进 行了评估。参见例如BaselgaandMendelsohn，见上文；Masuietal.，Cancer Research44：1002-1007(1984)；及Wuetal.，J.Clin.Invest.95：1897-1905 (1995)。
HER家族的第二个成员p185neu最初被鉴定成转化基因的产物，来自经化 学处理的大鼠的成神经细胞瘤。neu原癌基因的活化形式产生自所编码蛋白 质跨膜区中的点突变(缬氨酸变成谷氨酸)。在乳癌和卵巢癌中观察到neu的 人同系物的扩增，而且这与预后不良有关(Slamonetal，Science235：177-182 (1987)；Slamonetal.，Science244：707-712(1989)；及美国专利4,968,603)。迄 今为止，对于人类肿瘤尚无neu原癌基因中与之类似的点突变的报道。在其 它癌瘤中也已观察到HER2的过表达(频繁但不均一，原因在于基因扩增)， 包括胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结肠、甲状腺、胰和膀胱的癌瘤。参 见Kingetal.，Science229：974(1985)；Yokotaetal.，Lancet1：765-767(1986)； Fukushigeetal.，Mol.CellBiol.6：955-958(1986)；Guerinetal.，OncogeneRes. 3：21-31(1988)；Cohenetal.，Oncogene4：81-88(1989)；Yonemuraetal.， CancerRes.51：1034(1991)；Borstetal.，Gynecol.Oncol.38：364(1990)； Weinereetal.，CancerRes.50：421-425(1990)；Kernetal.，CancerRes.50： 5184(1990)；Parketal.，CancerRes.49：6605(1989)；Zhauetal.，Mol.Carcinog. 3：254-257(1990)；Aaslandetal.，Br.J.Cancer57：358-363(1988)；Williamset al.，Pathobiology59：46-52(1991)；及McCannetal.，Cancer65：88-92(1990) 等。HER2可在前列腺癌中过表达(Guetal.，CancerLett.99：185-9(1996)； Rossetal.，Hum.Pathol.28：827-33(1997)；Rossetal.，Cancer79：2162-70 (1997)；及Sadasivanetal.，J.Urol.150：126-31(1993))。
已经描述了针对大鼠p185neu和人HER2蛋白质产物的抗体。Drebin及其同 事制备了针对大鼠neu基因产物，p185neu的抗体。参见例如Drebinetal.，Cell 41：695-706(1985)；Myersetal.，Meth.Enzym.198：277-290(1991)；及 WO94/22478。Drebinetal.，Oncogene2：273-277(1988)报道了与p185neu的两 个独特区域有反应性的抗体混合物对植入裸鼠的neu转化NIH-3T3细胞产生 协同的抗肿瘤作用。还可参见1998年10月20日发布的美国专利5,824,311。
Hudziaketal.，Mol.Cell.Biol.9(3)：1165-1172(1989)描述了一组HER2抗 体的生成，并利用人乳房肿瘤细胞系SK-BR-3鉴定。通过72小时后单层细胞 的结晶紫染色测定了暴露于抗体后SK-BR-3细胞的相对细胞增殖。利用此测 定法，用称作4D5的抗体获得了最大抑制，它抑制细胞增殖达56％。该组其 它抗体在此测定法中以较低程度降低细胞增殖。还发现抗体4D5使过表达 HER2的乳房肿瘤细胞系对TNF-α的细胞毒性作用变得敏感。还可参见1997 年10月14日发布的美国专利5,677,171。Hudziak等人的文章中讨论的抗体还 在以下文献中进行了鉴定：Fendlyetal.，CancerResearch50：1550-1558 (1990)；Kottsetal.，InVitro26(3)：59A(1990)；Sarupetal.，GrowthRegulation1： 72-82(1991)；Shepardetal.，J.Clin.Immunol.11(3)：117-127(1991)；Kumaret al.，Mol.Cell.Biol.11(2)：979-986(1991)；Lewisetal.，CancerImmunol. Immunother.37：255-263(1993)；Pietrasetal.，Oncogene9：1829-1838(1994)； Vitettaetal.，CancerResearch54：5301-5309(1994)；Sliwkowskietal.，J.Biol. Chem.269(20)：14661-14665(1994)；Scottetal.，J.Biol.Chem.266：14300-5 (1991)；D′souzaetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.91：7202-7206(1994)；Lewisetal.， CancerResearch56：1457-1465(1996)；及Schaeferetal.，Oncogene15： 1385-1394(1997)。
鼠HER2抗体4D5的重组人源化型式(huMAb4D5-8、rhuMAbHER2、Trastuzumab或美国专利5,821,337)在临床上对患有HER2过表达的转移性乳癌并已接受广泛的早期抗癌疗法的患者起作用(Baselgaetal.，J.Clin.Oncol.14：737-744(1996))。Trastuzumab在1998年9月25日得到了食品和药品管理局的销售许可，可用于治疗所患肿瘤过表达HER2蛋白质的转移性乳癌患者。
以下文献中描述了具有各种特性的其它HER2抗体：Tagliabueetal.，Int.J. Cancer47：933-937(1991)；McKenzieetal.，Oncogene4：543-548(1989)； Maieretal.，CancerRes.51：5361-5369(1991)；Bacusetal.，Molecular Carcinogenesis3：350-362(1990)；Stancovskietal.，PNAS(USA)88：8691-8695 (1991)；Bacusetal.，CancerResearch52：2580-2589(1992)；Xuetal.，Int.J. Cancer53：401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyketal.，CancerResearch52： 2771-2776(1992)；Hancocketal.，CancerRes.51：4575-4580(1991)；Shawver etal.，CancerRes.54：1367-1373(1994)；Arteagaetal.，CancerRes.54： 3758-3765(1994)；Harwerthetal.，J.Biol.Chem.267：15160-15167(1992)；美 国专利5,783,186；及Klapperetal.，Oncogene14：2099-2109(1997)。
同源性筛选使得HER受体家族的两个其它成员得以鉴定：HER3(美国 专利5,183,884和5,480,968以及Krausetal.，PNrAS(USA)86：9193-9197 (1989))和HER4(欧洲专利申请599,274；Plowmanetal.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA90：1746-1750(1993)；及Plowmanetal.，Nature366：473-475(1993))。这 两种受体均在至少有些乳癌细胞系中显示表达升高。
通常发现HER受体在细胞中有多种组合，而且认为它的二聚化增加了对 各种HER配体的细胞应答的多样性(Earpetal.，BreastCancerResearchand Treatment35：115-132(1995))。EGFR受到6种不同配体的结合：表皮生长因 子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、双调蛋白、肝素结合表皮生长因子 (HB-EGF)、betacellulin和epiregulin(Groenenetal.，GrowthFactors11：235-257 (1994))。由单一基因的可变剪接产生的一个调蛋白蛋白质家族是HER3和 HER4的配体。调蛋白家族包括α、β和γ调蛋白(Holmesetal.，Science256： 1205-1210(1992)；美国专利5,641,869；及Schaeferetal.，Oncogene15： 1385-1394(1997))；neu分化因子(NDF)；神经胶质生长因子(GGF)；乙酰胆 碱受体诱导活性(ARIA)；及感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)。有关综述 参见Groenenetal.，GrowthFactors11：235-257(1994)；Lemke，G，Molec.& Cell.Neurosci.7：247-262(1996)；及Leeetal.，Pharm.Rev.47：51-85(1995)。 最近还鉴定了另外三种HER配体：神经调节蛋白-2(NRG-2)，据报道它结合 HER3或HER4(Changetal.，Nature387：509-512(1997)；及Carrawayetal.， Nature387：512-516(1997))；神经调节蛋白-3，它结合HER4(Zhangetal.， PNAS(USA)94(18)：9562-7(1997))；和神经调节蛋白-4，它结合HER4(Harari etal.，Oncogene18：2681-89(1999))。HB-EGF、betacellulin和epiregulin也结 合HER4。
尽管EGF和TGFα不结合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成异二聚 体，它活化EGFR并导致异二聚体中HER2的转磷酸作用。二聚化作用和/或 转磷酸作用看来活化HER2酪氨酸激酶。参见Earpetal.，见上文。同样，当 HER3与HER2共表达时，形成有活性的信号复合物，而针对HER2的抗体能 破坏此复合物(Sliwkowskietal.，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665 (1994))。此外，在与HER2共表达时，HER3对调蛋白(HRG)的亲和力提高到 了较高的亲和力状态。关于HER2-HER3蛋白质复合物还可参见Levietal.， JournalofNeuroscience15：1329-1340(1995)；Morrisseyetal.，Proc.Natl. Acad.Sci.USA92：1431-1435(1995)；及Lewisetal.，CancerRes.56： 1457-1465(1996)。HER4，与HER3类似，与HER2形成有活性的信号复合物 (CarrawayandCantley，Cell78：5-8(1994))。
为了靶向HER信号途径，将rhuMAb2C4(Pertuzumab)开发成抑制HER2 与其它HER受体二聚化的人源化抗体，从而抑制配体驱动的磷酸化作用和活 化作用，及RAS和AKT途径的下游激活。在Pertuzumab作为治疗实体瘤的单 一药剂的I期试验中，用Pertuzumab治疗患有晚期卵巢癌的3名受试者。一人 具有持久的部分响应，而另一名受试者疾病稳定了15周。Agusetal.ProcAm SocClinOncol22：192，Abstract771(2003)。
抗体变体组合物
美国专利6,339,142描述了包含抗HER2抗体及其一种或多种酸性变体的 混合物的HER2抗体组合物，其中所述酸性变体的量少于约25％。Trastuzumab 是例示性的HER2抗体。
Reid等人在充分表征的生物技术药物会议(WellCharacterizedBiotech PharmaceuticalsConference)(2003年1月)上呈现的海报“EffectsofCell CultureProcessChangesonHumanizedAntibodyCharacteristics”描述了一种未 命名的人源化IgG1抗体组合物，它由于其重链上VHS信号肽、N-末端谷氨酰 胺和焦谷氨酸的组合而具有N-末端异质性。
Harris等人在IBC抗体生成会议(IBCAntibodyProductionConference) (2002年2月)上所做的讲话“TheIdealChromatographicAntibody CharacterizationMethod”报告了人源化抗IgE抗体E25的重链上的VHS延伸。
Rouse等人在WCBP(2004年1月6-9日)上所做的演讲“‘TopDown’ GlycoproteinCharacterizationbyHighResolutionMassSpectrometryandIts ApplicationtoBiopharmaceuticalDevelopment”描述了一种单克隆抗体组合 物，它由于其轻链上的-3AHS或-2HS信号肽残基而具有N-末端异质性。
JillPorter在IBC会议(2000年9月)上呈现的海报“StrategicUseof ComparabilityStudiesandAssaysforWellCharacterizedBiologicals”讨论了 ZENAPAXTM的晚期洗脱形式，它在其重链上具有三个额外的氨基酸残基。
US2006/0018899记载了一种包含主要种类Pertuzumab抗体及Pertuzumab 抗体的氨基末端前导延伸变体以及其它变体形式的组合物。
发明概述
依照第一个方面，本发明关注一种包含结合HER2结构域II的主要种类 HER2抗体及其酸性变体的组合物，其中所述酸性变体包括糖化变体(glycated variant)、二硫化物还原变体(disulfidereducedvariant)、或不可还原变体 (non-reduciblevariant)。优选的是，所述酸性变体包括糖化变体、脱酰胺变体 (deamidatedvariant)、二硫化物还原变体、唾液酰化变体(sialylatedvariant)、 和不可还原变体。期望的是，所述酸性变体的量少于约25％。
在另一个方面，本发明提供一种包含主要种类HER2抗体及该主要种类 抗体的酸性变体的组合物，其中所述主要种类HER2抗体包含SEQIDNo.3 和4中的可变轻链和可变重链，且其中所述酸性变体包括糖化变体、脱酰胺 变体、二硫化物还原变体、唾液酰化变体、和不可还原变体。
本发明还关注在药学可接受载体中包含所述组合物的药物配制剂。
另外，本发明涉及一种治疗患者中HER2阳性癌症的方法，包括以有效 治疗所述癌症的量对所述患者施用所述药物配制剂。就此类方法而言，如本 文实施例中所证明的，优选的是，所述主要种类抗体和酸性变体具有本质上 相同的药动学。
在另一个方面，本发明关注一种制备药物组合物的方法，包括：(1)制备 包含结合HER2结构域II的主要种类HER2抗体及其酸性变体的组合物，所述 酸性变体包括糖化变体、二硫化物还原变体、或不可还原变体，并(2)评估所 述组合物中的所述酸性变体，并确定其量少于约25％。在一个实施方案中， 通过选自下组的方法来评估所述酸性变体：离子交换层析(其中所述组合物 用唾液酸酶处理)；有十二烷基硫酸钠的还原性毛细管电泳(CE-SDS)；非还 原性CE-SDS；硼酸盐层析；和肽作图。
附图简述
图1提供了HER2蛋白质结构的示意图，及其胞外域的结构域I-IV的氨基 酸序列(分别是SEQIDNo.19-22)。
图2A和2B描绘了鼠源单克隆抗体2C4的轻链可变区(VL)(图2A)和重链 可变区(VH)(图2B)(分别是SEQIDNo.1和2)；人源化2C4型式574的VL和 VH结构域(分别是SEQIDNo.3和4)，及人VL和VH共有框架(humκ1，轻链 κ亚组I；humIII，重链亚组III)(分别是SEQIDNo.5和6)的氨基酸序列对 比。星号标示人源化2C4型式574和鼠源单克隆抗体2C4之间或人源化2C4型 式574和人框架之间的差异。互补决定区(CDR)在括号中。
图3A和3B显示了Pertuzumab轻链(SEQIDNo.15)和重链(SEQIDNo. 16)的氨基酸序列。CDR以粗体显示。碳水化合物模块(moiety)附着于重链 的Asn299。
图4A和4B显示了Pertuzumab轻链(SEQIDNo.17)和重链(SEQIDNo. 18)的氨基酸序列，各自包含完整的氨基末端信号肽序列。
图5以图描述了2C4在HER2的异二聚体结合位点处的结合，由此阻止与 活化的EGFR或HER3的异二聚化。
图6描绘了HER2/HER3与MAPK和Akt途径的偶联。
图7比较了Trastuzumab和Pertuzumab的活性。
图8A和8B显示了Trastuzumab轻链(SEQIDNo.13)和重链(SEQIDNo. 14)的氨基酸序列。
图9A和9B描绘了变体Pertuzumab轻链序列(SEQIDNo.23)和变体 Pertuzumab重链序列(SEQIDNo.24)。
图10显示了阳离子交换MP(主峰)和AV(酸性变体)的分离、细胞培 养、回收、和PK(药动学)评估和分析测试的实验设计。新鲜的培养基＝标 准培养基；用过的培养基＝细胞培养12天后的标准培养基，通过离心来除 去细胞。不控制溶解氧、pH、和其它参数。
图11显示了来自实施例1的典型DIONEXPROPACJ阳离子交换(CEX)层 析图。
图12显示了对Pertuzumab起始材料和CEX级分的分析。AV＝酸性变体； MP＝主峰；而BV＝碱性变体。
图13揭示了掺入细胞培养物并温育12天的主峰(MP)的CEX。
图14描述了主峰温育条件。
图15概述了用于表征酸性变体的方法。
图16显示了实施例1中PK研究中的Pertuzumab浓度对时间的关系。
图17提供了来自实施例1中PK研究的曲线下面积(AUC)和几何均值比。
优选实施方案的详述
I.定义
术语“主要种类抗体”在本文中指组合物中这样的抗体氨基酸序列结构， 它是该组合物中在数量上占绝大多数的抗体分子。优选的是，主要种类抗体 是HER2抗体，诸如结合HER2结构域II的抗体、比Trastuzumab更有效地抑制 HER二聚化的抗体、和/或结合HER2的异二聚体结合位点的抗体。本文中主 要种类抗体的优选实施方案是包含SEQIDNo.3和4中的轻链和重链可变区 氨基酸序列的抗体，且最优选包含SEQIDNo.15和16中的轻链和重链氨基酸 序列(Pertuzumab)。
“氨基酸序列变体”抗体在本文中指具有与主要种类抗体不同的氨基酸 序列的抗体。通常，氨基酸序列变体将与主要种类抗体具有至少约70％的同 源性，而且优选的是，它们将是与主要种类抗体至少约80％，且更优选至少 约90％同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体氨基酸序列内部或邻近的某些 位置具有替代、删除和/或添加。本文中氨基酸序列变体的例子包括酸性变体 (如脱酰胺抗体变体)、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基末端前 导延伸(如VHS-)的抗体、在其一条或两条重链上具有C-末端赖氨酸残基 的抗体、具有一个或多个氧化后甲硫氨酸残基的抗体等，且包括重链和/或轻 链氨基酸序列变异的组合。
“酸性变体”指比主要种类抗体更加酸性的主要种类抗体的变体。相对 于主要种类抗体，酸性变体已经获得了负电荷或损失了正电荷。此类酸性变 体可以使用依照电荷将蛋白质分开的分离方法(诸如离子交换层析)来解析。 在通过阳离子交换层析分离时，主要种类抗体的酸性变体比主峰先洗脱。
“二硫化物还原变体”有一个或多个形成二硫键的半胱氨酸被化学还原 成游离硫醇形式。这种变体可以通过疏水相互作用层析或通过分筛方法(诸 如有十二烷基硫酸钠的毛细管电泳(CE-SDS))来监测，例如如实施例1中所 描述的。
在本文中，“不可还原变体”指不能通过还原剂(诸如二硫苏糖醇)处 理被化学还原成重链和轻链的主要种类抗体变体。此类变体可以通过用还原 剂处理组合物并使用评估蛋白质大小的方法(诸如有十二烷基硫酸钠的毛细 管电泳(CE-SDS))评估所得组合物来评估，例如使用下文实施例1中描述的 技术。
“糖基化变体(glycosylationvariant)”抗体在本文中指有一个或多个碳水 化合物模块附着于它的抗体，所述碳水化合物与附着于主要种类抗体的一个 或多个碳水化合物模块不同。本文中糖基化变体的例子包括有G1或G2寡糖 结构代替G0寡糖结构附着于其Fc区的抗体、有一个或多个碳水化合物模块附 着于其一条或两条轻链的抗体、没有碳水化合物模块附着于其一条或两条重 链的抗体、唾液酸化的抗体等，以及这些糖基化改变的组合。
若抗体具有Fc区，则本文中诸如图14所示的寡糖结构可附着于抗体的一 条或两条重链，如位于残基299。对于Pertuzumab，G0是最主要的寡糖结构， 而在Pertuzumab组合物中发现其它寡糖结构，诸如G0-F、G-1、Man5、Man6、 G1-1、G1(1-6)、G1(1-3)和G2的量较少。
除非另有说明，“G1寡糖结构”在本文中包括G1(1-6)和G1(1-3)结构。
为本文目的，“唾液酰化变体”指如下的主要种类抗体变体，其包含附 着至其一条或两条重链的一个或多个唾液酰化碳水化合物模块。唾液酰化变 体可以通过在有或没有唾液酸酶处理的情况中评估组合物(例如通过离子交 换层析)来鉴定，例如如实施例中所描述的。
“糖化变体”指共价附着有糖(诸如葡萄糖)的抗体。这种添加可以通 过葡萄糖与蛋白质上的赖氨酸残基起反应(例如在细胞培养基)来发生。糖 化变体可以通过对还原的抗体的质谱术分析(评估重链或轻链质量的增加) 来鉴定。糖化变体还可以通过硼酸盐层析来定量，如下文实施例1中所解释 的。糖化变体与糖基化变体不同。
“脱酰胺”抗体指其中一个或多个天冬酰胺残基衍生成例如天冬氨酸、 琥珀酰亚胺或异天冬氨酸的抗体。脱酰胺抗体的一个例子是Pertuzumab变体， 其中Pertuzumab的一条或两条重链上的Asn-386和/或Asn-391是脱酰胺的。
“氨基末端前导延伸变体”在本文中指在主要种类抗体的任何一条或多 条重链或轻链的氨基末端处有一个或多个氨基酸残基的氨基末端前导序列 的主要种类抗体。例示性的氨基末端前导延伸包含三个氨基酸残基、VHS或 由其组成，它们存在于抗体变体的一条或所有两条轻链上。
“同源性”定义为在必要时对比序列和引入缺口以获取最大百分比同一 性后，氨基酸序列变体中相同残基的百分比。用于对比的方法和计算机程序 在本领域是众所周知的。一种这样的计算机程序是“Align2”，由Genentech， Inc.创作，已经在1991年12月10日与用户文档(userdocumentation)一起提交给 美国版权局(Washington，DC20559)。
为了本文的目的，“阳离子交换分析”指根据电荷差异利用阳离子交换 剂将包含两种或多种化合物的组合物分开的任何方法。阳离子交换剂通常包 含共价结合的，带负电荷的基团。优选的是，本文中的阳离子交换剂是弱阳 离子交换剂和/或包含羧酸盐/酯官能团，诸如Dionex出售的PROPAC WCX-10TM阳离子交换柱。
“HER受体”是属于HER受体家族的受体蛋白质酪氨酸激酶，包括 EGFR、HER2、HER3和HER4受体及未来将鉴定的此家族其它成员。HER受 体通常将包含胞外结构域，它可结合HER配体；亲脂性跨膜结构域；保守的 胞内酪氨酸激酶结构域；和含有几个可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基末端信 号结构域。优选的是，HER受体是天然序列人HER受体。
HER2的胞外域包含4个结构域：结构域I(大约第1-195位氨基酸残基)、 结构域II(大约第196-319位氨基酸残基)、结构域III(大约第320-488位氨基 酸残基)和结构域IV(大约第489-630位氨基酸残基)(残基编号不包括信号 肽)。参见Garrettetal.，Mol.Cell.11：495-505(2003)；Choetal.，Nature421： 756-760(2003)；Franklinetal.，CancerCell5：317-328(2004)；或Plowmanet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.90：1746-1750(1993)。还可参见本文图1。
术语“ErbB1”、“HER1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”在本文中 可互换使用，指例如Carpenteretal.，Ann.Rev.Biochem.56：881-914(1987)中 公开的EGFR，包括其天然存在的突变体形式(如Humphreyetal.，PNAS(USA) 87：4207-4211(1990)中的删除突变体EGFR)。erbB1指编码EGFR蛋白质产物 的基因。
表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用，指例如Sembaetal.，PNAS (USA)82：6497-6501(1985)和Yamamotoetal.，Nature319：230-234(1986)中 描述的人HER2蛋白(Genebank编号X03363)。术语“erbB2”指编码人ErbB2 的基因，而“neu”指编码大鼠p185neu的基因。优选的HER2是天然序列人 HER2。
“ErbB3”和“HER3”指例如美国专利5,183,884和5,480,968及Krausetal.， PNAS(USA)86：9193-9197(1989)中公开的受体多肽。
术语“ErbB4”和“HER4”在本文中指例如欧洲专利申请599,274；Plowman etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：1746-1750(1993)；及Plowmanetal.， Nature366：473-475(1993)中公开的受体多肽，包括其同种型(isoform)，例如 1999年4月22日出版的WO99/19488中所公开的。
“HER配体”指结合和/或活化HER受体的多肽。本文中特别感兴趣的 HER配体是天然序列人HER配体，诸如表皮生长因子(EGF)(Savageetal.，J. Biol.Chem.247：7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardtetal.， Science223：1079-1082(1984))；双调蛋白，又称为施旺细胞瘤(schwannoma) 或角质形成细胞自分泌生长因子(Shoyabetal.，Science243：1074-1076 (1989)；Kimuraetal.，Nature348：257-260(1990)；及Cooketal.，Mol.Cell. Biol.11：2547-2557(1991))；betacellulin(Shingetal.，Science259：1604-1607 (1993)；及Sasadaetal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.190：1173(1993))；肝 素结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyamaetal.，Science251：936-939 (1991))；epiregulin(Toyodaetal.，J.Biol.Chem.270：7495-7500(1995)；及 Komurasakietal.，Oncogene15：2841-2848(1997))；α调蛋白(见下文)；神 经调节蛋白-2(NRG-2)(Carrawayetal.，Nature387：512-516(1997))；神经调 节蛋白-3(NRG-3)(Zhangetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.94：9562-9567(1997))； 神经调节蛋白-4(NRG-4)(Hararietal.，Oncogene18：2681-89(1999))；或 cripto(CR-1)(Kannanetal.，J.Biol.Chem.272(6)：3330-3335(1997))。结合 EGFR的HER配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、betacellulin、HB-EGF和 epiregulin。结合HER3的HER配体包括调蛋白。能够结合HER4的HER配体包 括betacellulin、epiregulin、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和调蛋白。
“调蛋白”(HRG)在用于本文时指由调蛋白基因编码的多肽，如美国专 利5,641,869或Marchionnietal.，Nature362：312-318(1993)中所公开的。调蛋 白的例子包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmesetal.， Science256：1205-1210(1992)；及美国专利5,641,869)；neu分化因子(NDF) (Pelesetal.，Cell69：205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls etal.，Cell72：801-815(1993))；神经胶质生长因子(GGF)(Marchionnietal.， Nature362：312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Hoetal.， J.Biol.Chem.270：14523-14532(1995))；γ-调蛋白(Schaeferetal.，Oncogene 15：1385-1394(1997))。此术语包括天然序列HRG多肽的生物学活性片段和/ 或氨基酸序列变体，诸如其EGF样结构域片段(如HRGβ1177-244)。
“HER二聚体”在本文中指包含至少两个不同HER受体的非共价结合二 聚体。当表达两种或多种HER受体的细胞暴露于HER配体时可能形成此类复 合物，可通过免疫沉淀进行分离并通过SDS-PAGE进行分析，如例如 Sliwkowskietal.，J.Biol.Chem.269(20)：14661-14665(1994)中所述。此类 HER二聚体的例子包括EGFR-HER2、HER2-HER3和HER3-HER4异二聚体。 此外，HER二聚体可包含与诸如HER3、HER4或EGFR等不同HER受体组合 的两个或多个HER2受体。其它蛋白质，诸如细胞因子受体亚基(如gp130) 可与所述二聚体结合。
HER2上的“异二聚体结合位点”指HER2胞外域中在与EGFR、HER3 或HER4形成二聚体时，接触EGFR、HER3或HER4胞外域中某区域或与 EGFR、HER3或HER4胞外域中某区域形成介面的区域。已发现所述区域在 HER2的结构域II中。Franklinetal.，CancerCell5：317-328(2004)。
“HER活化”或“HER2活化”指任一种或多种HER受体或HER2受体的 活化或磷酸化作用。一般而言，HER活化导致信号转导(例如由HER受体胞 内激酶结构域引起的，磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基)。HER 活化可由结合包含目的HER受体的HER二聚体的HER配体介导。结合HER二 聚体的HER配体可活化二聚体中一种或多种HER受体的激酶结构域，从而导 致一种或多种HER受体中酪氨酸残基的磷酸化作用和/或其它底物多肽中酪 氨酸残基的磷酸化作用，诸如Akt或MAPK胞内激酶。
术语“抗体”在本文中使用最广的含义，具体覆盖完整的单克隆抗体、 多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、 及抗体片段，只要它们展现所需生物学活性。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由一群基本上同质的抗体获得的抗 体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的 过程中可能产生的可能变体外，诸如本文描述的那些抗体。与典型的包含针 对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，每种单克隆抗体 针对抗原上的同一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越性体 现在它们未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”指示由基本上同 质的抗体群获得的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗 体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过最初由Kohleretal.，Nature 256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备 (参见例如美国专利4,816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如Clacksonetal.， Nature352：624-628(1991)和Marksetal.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中 描述的技术从噬菌体抗体库分离。
单克隆抗体在本文中具体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部 分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同 或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗 体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现所需生物 学活性(美国专利4,816,567；及Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81： 6851-6855(1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动 物(如旧大陆猴类(OldWorldMonkey)、猿等)的可变区抗原结合序列和人 恒定区序列的“灵长类化(primatized)”抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区或可变区。 抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链 抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“完整抗体”指包含抗原结合可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定 区CH1、CH2和CH3的抗体。恒定区可以是天然序列恒定区(如人天然序列恒 定区)或其氨基酸序列变体。优选的是，完整抗体具有一项或多项效应物功 能，且包含附着于其一条或两条重链的寡糖结构。
抗体“效应物功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序 列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应物功能的例子包括C1q结合；补体依 赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞 噬作用：细胞表面受体(如B细胞受体；BCR)的下调等。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-端区域，包括天然序 列Fc区和变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG 重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的 区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以消除，例如 在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程 改造。因而，完整抗体组合物可以包括所有K447残基都被消除的抗体群、无 一K447残基被消除的抗体群、或者混合了有K447残基的抗体和没有K447残 基的抗体的抗体群。
除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabatetal.， SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thEd.PublicHealthService， NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)中的EU索引的编号方式。 “如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号方式。
根据完整抗体的重链恒定区的氨基酸序列，可将其归入不同的“类” (class)。完整抗体有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有 些可进一步分为“亚类”(subclass)(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、 IgA1和IgA2。将与不同抗体类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。 不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指由细胞介导的反应， 其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜 中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。 介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、 FcγRII和FcγRIII。RavetchandKinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)中第 464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性， 可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的。 可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK) 细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中， 诸如Clynesetal.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的。
“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应物功能的白细胞。优 选的是，该细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应物功能。介导ADCC的人 白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、 细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其 天然来源中分离，例如血液或PBMC，正如本文所述。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是与IgG抗体结合的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质域。活化受体FcγRIIA在其胞质域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见RavetchandKinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capeletal.，Immunomethods4：25-34(1994)；及deHaasetal.，J.Lab.Clin.Med.126：330-341(1995))。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体的IgG转移给胎儿(Guyeretal.，J.Immunol.117：587(1976)和Kimetal.，J.Immunol.24：249(1994))。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶物的能 力。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与关联抗原复合的分子 (如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如 Gazzano-Santoroetal.，J.Immunol.Methods202：163(1996)中所描述的。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的 约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连 接，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链中有所变化。每条重链 和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变区 (VH)，接着是多个恒定区。每条轻链在一端具有一个可变区(VL)，而另一端 是一个恒定区。轻链的恒定区与重链的第一恒定区排列在一起，而轻链的可 变区与重链的可变区排列在一起。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变 区之间形成界面。
术语“可变的”指可变区中的某些部分在抗体序列中差异广泛且用于每 种特定抗体针对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀 分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链可变区中称作高变区的三个 区段。可变区中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可 变区各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有 些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过 FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合 位点的形成(参见Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunological Interest》，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda， MD，1991)。恒定区不直接涉及抗体与抗原的结合，但展现多种效应物功能， 诸如抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)中抗体的参与。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高 变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变 区中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重链可变区中的31-35 (H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，《SequencesofProteinsof ImmunologicalInterest》，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesof Health，Bethesda，MD，1991)和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链 可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重链可变区中的 26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；ChothiaandLesk，J.Mol.Biol.196： 901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基指本文定义的高变区残基以外的 可变区残基。
用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片 段，各自具有一个抗原结合位点，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它 易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段，它具有两个抗原结合 位点，并且仍能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由 紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。正是 在这种构造中，各个可变区的三个高变区相互作用而在VH-VL二聚体表面确 定了一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而， 即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识 别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
Fab片段还包含轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab’片段因在 重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来 自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文中对其中恒定区的半 胱氨酸残基携带至少一个游离硫醇基的Fab’的称谓。F(ab′)2抗体片段最初是 作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。还知道抗体 片段的其它化学偶联。
来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”，根据其恒定区的氨基酸序列， 可归入两种截然不同类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结 构域存在于一条多肽链上。优选的是，该Fv多肽在VH和VL结构域之间还包 含多肽接头，使得scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见 Plückthun，在《ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies》中，第113卷， Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，NewYork，269-315，1994。HER2 抗体scFv片段描述于WO93/16185；美国专利5,571,894；和美国专利 5,587,458。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同 一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。通过 使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使结构域与 另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的描 述于例如EP404,097；WO93/11161；和Hollingeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA90：6444-6448(1993)。
非人(如啮齿类)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免 疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受 体抗体)中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供 体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。 在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。 此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这 些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体将包含基本上不少 于至少一个、通常两个如下可变区，其中所有或基本上所有的高变环对应于 非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的 FR。任选的是，人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通 常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jonesetal.，Nature321：522-525 (1986)；Riechmannetal.，Nature332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op. Struct.Biol.2：593-596(1992)。
人源化HER2抗体包括huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或Trastuzumab如美国专利5,821,337的表3中所述，明确收入本文作为参考；人源化520C9(WO93/21319)和人源化2C4抗体，如本文所述。
为了本文的目的，“Trastuzumab”、和“huMAb4D5-8”指包含分别在SEQIDNo.13和14中的轻链和重链氨基酸序列的抗体。
在本文中，“Pertuzumab”和“rhuMAb2C4”指包含分别在SEQIDNo.3 和4中的轻链和重链可变区氨基酸序列的抗体。若Pertuzumab是完整抗体，则 它优选包含分别在SEQIDNo.15和16中的轻链和重链氨基酸序列。
“裸抗体”指未偶联异源分子，诸如细胞毒性模块或放射性标记物的抗 体(如本文所定义的)。
“分离的”抗体指已经由其天然环境的成分鉴别和分离和/或回收的抗 体。其天然环境的污染成分指将会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可包 括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案 中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量 超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内 部氨基酸序列的程度，或(3)通过使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原 条件下的SDS-PAGE达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存 在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将 通过至少一个纯化步骤来制备。
“比Trastuzumab更有效的抑制HER二聚化的”HER2抗体指比 Trastuzumab更有效(例如有效性提高至少约2倍)的减少或消除HER二聚体 的抗体。优选的是，这样的抗体至少大约像选自下组的抗体那样有效的抑制 HER二聚化：鼠单克隆抗体2C4、鼠单克隆抗体2C4的Fab片段、完整的 Pertuzumab、和Pertuzumab的Fab片段。可直接通过研究HER二聚体，或者通 过评估由HER二聚化引起的HER活化或下游信号传导，和/或通过评估抗体 -HER2结合位点等来评估对HER二聚化的抑制。用于筛选有能力比 Trastuzumab更有效的抑制HER二聚化的抗体的测定法见Agusetal.，Cancer Cell2：127-137(2002)和WO01/00245(Adamsetal.)。只是作为例示，可通过 评估例如下列各项来分析对HER二聚化的抑制：对HER二聚体形成的抑制 (参见例如Agusetal.，CancerCell2：127-137(2002)的附图1A-B和 WO01/00245)；表达HER二聚体的细胞中HER配体活化的降低(例如 WO01/00245和Agusetal.，CancerCell2：127-137(2002)的附图2A-B)；对 HER配体结合表达HER二聚体的细胞的阻断(例如WO01/00245和Agusetal.， CancerCell2：127-137(2002)的附图2E)；在存在(或缺乏)HER配体时对表 达HER二聚体的癌细胞(如MCF7、MDA-MD-134、ZR-75-1、MD-MB-175、 T-47D细胞)的细胞生长的抑制(例如WO01/00245和Agusetal.，CancerCell2： 127-137(2002)的附图3A-D)；对下游信号传导的抑制(例如对HRG依赖性 AKT磷酸化的抑制或对HRG或TGFα依赖性MAPK磷酸化的抑制)(参见例如 WO01/00245和Agusetal.，CancerCell2：127-137(2002)的附图2C-D)。还可 通过研究抗体-HER2结合位点来评估抗体是否抑制HER二聚化，例如通过评 估与HER2结合的抗体的结构或模型，诸如晶体结构(参见例如Franklinetal.， CancerCell5：317-328(2004))。
HER2抗体可比Trastuzumab更有效(例如有效性提高至少2倍)的“抑制 HRG依赖性AKT磷酸化”和/或抑制“HRG或TGFα依赖性MAPK磷酸化”(参 见例如Agusetal.，CancerCell2：127-137(2002)和WO01/00245)。
HER2抗体可以是“不抑制HER2胞外域切割”的抗体(Molinaetal.， CancerRes.61：4744-4749(2001))。
“结合HER2的异二聚体结合位点的”HER2抗体结合结构域II中的残基 (且任选还结合HER2的胞外域以外的其它结构域，诸如结构域I和III中的残 基)，且至少在一定程度上能在空间上阻碍HER2-EGFR、HER2-HER3或 HER2-HER4异二聚体的形成。Franklinetal.，CancerCell5：317-328(2004)表 征了存放在RCSB蛋白质数据库(IDCodeIS78)的HER2-Pertuzumab晶体结 构，举例说明了结合HER2的异二聚体结合位点的例示性抗体。
“结合HER2结构域II的”抗体结合结构域II中的残基和任选HER2的其 它结构域，诸如结构域I和III中的残基。
“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是表达 HER的癌细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低S 期的表达HER细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进 (处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典 的M期阻断剂包括长春花生物碱类(长春新碱和长春碱)、紫杉醇、和拓扑 异构酶II抑制剂诸如多柔比星、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。 那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂诸如他莫昔芬、泼 尼松、达卡巴嗪、双氯乙基甲胺、顺铂、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其 它信息可参见在《TheMolecularBasisofCancer》中，Mendelsohn和Israel编， 第1章，题为“Cellcycleregulation，oncogenes，andantieioplasticdrugs”， Murakaini等人，WBSaunders，Philadelphia，1995，尤其是第13页。
“生长抑制性”抗体的例子是那些结合HER2并抑制过表达HER2的癌细 胞生长的抗体。优选的生长抑制性HER2抗体在约0.5-30μg/ml的抗体浓度对 细胞培养中SK-BR-3乳房肿瘤细胞的生长抑制大于20％，优选大于50％(例 如从约50％至约100％)，其中生长抑制是在SK-BR-3细胞暴露于抗体后6天测 定的(参见1997年10月14日发布的美国专利5,677,171)。该专利及下文中更 详细的描述了SK-BR-3细胞生长抑制测定法。优选的生长抑制性抗体是鼠单 克隆抗体4D5的人源化变体，例如Trastuzumab。
“诱导凋亡”的抗体指那些根据膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞收缩、 内质网膨胀、细胞破裂和/或膜囊形成(称作凋亡小体)的测定，诱导程序性 细胞死亡的抗体。所述细胞通常是过表达HER2受体的细胞。优选的是，所 述细胞是肿瘤细胞，例如乳房、卵巢、胃、子宫内膜、唾液腺、肺、肾、结 肠、甲状腺、胰或膀胱细胞。在体外，所述细胞可以是SK-BR-3、BT474、 Calu3细胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3细胞。有多种方法可用 于评估与凋亡有关的细胞事件。例如，可通过膜联蛋白结合来测量磷脂酰丝 氨酸(PS)易位；可通过DNA梯化(laddering)来评估DNA断裂；而可通过亚二 倍体细胞的任何增加来评估伴随着DNA断裂的核/染色质浓缩。优选的是， 诱导凋亡的抗体是在使用BT474细胞的膜联蛋白结合测定法(见下文)中导 致对膜联蛋白结合的诱导相对于未处理细胞提高约2至50倍，优选约5至50 倍，最优选约10至50倍的抗体。诱导凋亡的HER2抗体的例子是7C2和7F3。
“表位2C4”指HER2胞外域中抗体2C4所结合的区域。为了筛选结合2C4 表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如《Antibodies，ALaboratory Manual》，ColdSpringHarborLaboratory，EdHarlow和DavidLane，1988中所 描述的。或者，可使用本领域知道的方法进行表位作图以评估抗体是否结合 HER2的2C4表位，和/或可研究抗体-HER2结构(Franklinetal.，CancerCell5： 317-328(2004))以了解抗体结合HER2的哪个/些结构域。表位2C4包含来自 HER2胞外域中结构域II的残基。2C4和Pertuzumab在结构域I、II和III的连接 处结合HER2的胞外域。Franklinetal.，CancerCell5：317-328(2004)。
“表位4D5”指HER2胞外域中抗体4D5(ATCCCRL10463)和 Trastuzumab所结合的区域。此表位接近HER2的跨膜域，且在HER2的结构域 IV之内。为了筛选结合4D5表位的抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸 如《Antibodies，ALaboratoryManual》，ColdSpringHarborLaboratory，Ed Harlow和DavidLane，1988中所描述的。或者，可进行表位作图以评估抗体 是否结合HER2的4D5表位(例如大约第529位残基至大约第625位残基区域内 的任何一个或多个残基，含；见图1)。
“表位7C2/7F3”指HER2胞外域的结构域I内N末端处7C2和/或7F3抗体 (各自保藏于ATCC，见下文)所结合的区域。为了筛选结合7C2/7F3表位的 抗体，可进行常规的交叉阻断测定法，诸如《Antibodies，ALaboratory Manual》，ColdSpringHarborLaboratory，EdHarlow和DavidLane，1988中所 描述的。或者，可进行表位作图以确定抗体是否结合HER2上的7C2/7F3表位 (例如图1中HER2的大约第22位残基至大约第53位残基区域内的任何一个 或多个残基)。
“治疗”指治疗性处理和预防性措施二者。需要治疗的受试者包括早就 患有疾病的受试者以及要预防疾病的受试者。因此，本文中待治疗的患者可 能已经诊断为患有疾病或者可能有患上疾病的倾向性或易感性。
术语“癌症”和“癌的”指的是或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长 不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包 括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、 神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、施旺细 胞瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病或淋巴样恶性肿 瘤。这些癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌(如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包 括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌、腹膜的癌症、肝细胞 癌症、胃癌包括胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、 膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜 或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝的癌、肛门 癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆管肿瘤、及头和颈癌。
术语“有效量”指在患者中有效治疗疾病的药物量。若疾病是癌症，则 药物的有效量可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即减缓到一定 程度和优选阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即减缓到一定程度和优 选阻止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一 种或多种与癌症有关的症状。在药物可阻止生长和/或杀死现有癌细胞的程度 上，它可以是抑制细胞的和/或细胞毒性的。有效量可延长无进展存活，导致 客观响应(包括部分响应，PR或完全响应，CR)，增加总体存活时间，和/ 或改善癌症的一种或多种症状。
“HER2阳性癌症”是包含在其细胞表面存在HER2蛋白质的细胞的癌 症。
“过表达”HER受体的癌症是与同一组织类型的非癌细胞相比，在其细 胞表面具有显著更高水平的HER受体诸如HER2的癌症。这样的过表达可以 是由基因扩增或者转录或翻译增加引起的。可在诊断或预后测定法中通过评 估细胞表面上存在的HER蛋白质水平的增加(例如通过免疫组化测定法， IHC)来确定HER受体的过表达。或者/另外，可测量细胞中编码HER的核酸 的水平，例如通过荧光原位杂交(FISH；参见1998年10月公布的 WO98/45479)、Southern印迹或聚合酶链式反应(PCR)技术，诸如实时定量 PCR(RT-PCR)。还可通过测量生物学流体诸如血清中的脱落抗原(例如HER 胞外域)来研究HER受体过表达(参见例如1990年6月12日发布的美国专利 4,933,294；1991年4月18日发布的WO91/05264；1995年3月28日发布的美国 专利5,401,638；及Siasetal.，J.Immunol.Methods132：73-80(1990))。除了上 述测定法之外，熟练技术人员还可利用多种体内测定法。例如，可将患者体 内细胞暴露于任选用可检测标记物例如放射性同位素标记的抗体，并且可评 估抗体与患者体内细胞的结合，例如通过外部扫描放射性或通过分析取自事 先已暴露于所述抗体的患者的活组织检查切片。
相反，“不过表达HER2受体”的癌症是与同一组织类型的非癌细胞相比， 不表达高于正常水平的HER2受体的癌症。
“过表达”HER配体的癌症是与同一组织类型的非癌细胞相比，产生显 著更高水平的该配体的癌症。这样的过表达可以是由基因扩增或者转录或翻 译增加引起的。可通过评估患者体内，例如肿瘤活组织检查切片中所述配体 (或编码它的核酸)的水平，或者通过各种诊断测定法诸如IHC、FISH、 Southern印迹、PCR或上文所述体内测定法在诊断上确定HER配体的过表达。
术语“胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏 的物质。该术语意欲包括放射性同位素(如At211、I131、I125、y90、Re186、Re188、 Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如小分子毒素或 细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类，诸如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)烷基磺酸酯类，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(曲大麻酚(dronabinol)，)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicine)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)CPT-11(伊立替康(irinotecan)，)、乙酰喜树碱、东莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；硝基脲类，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类(dynemicin)抗生素，包括dynemicinA；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂脂质体多柔比星TLCD-99PEG化脂质体多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤、吉西他滨(gemcitabine)替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)epothilone和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；醋酸羟吡咔唑(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHSNaturalProducts，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurinA、杆孢菌素A(roridinA)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；噻替哌；类紫杉醇(taxoid)，例如紫杉醇(paclitaxel)紫杉醇的清蛋白改造纳米颗粒剂型(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel)苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂剂，诸如顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂；阻止微管蛋白聚合形成微管的长春花生物碱类(vincas)，包括长春碱(vinblastine)长春新碱(vincristine)长春地辛(vindesine)和长春瑞宾(vinorelbine)依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovovin)；诺安托(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊拜膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸，诸如视黄酸，包括贝沙罗汀(bexarotene)二碳磷酸盐类(bisphosphonate)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或)、etidronateNE-58095、唑来膦酸(zoledronicacid)/唑来膦酸盐/酯(zoledronate)阿仑膦酸盐/酯(alendronate)pamidronate替鲁膦酸盐/酯(tiludronate)或利塞膦酸盐/酯(risedronate)曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制涉及粘着性细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Ralf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如疫苗和基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(如)；rmRHBAY439006(sorafenib；Bayer)；SU-11248(Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂(如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib))，蛋白体抑制剂(如PS341)；bortezomibCCI-779；tipifamib(R11577)；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersensodiumpixantrone；EGFR抑制剂(见下文定义)；酪氨酸激酶抑制剂(见下文定义)；及上述任何物质的药学可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸(leucovovin)的治疗方案的缩写)。
该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如具有混合的激动剂/拮抗剂特性(profile)的抗雌激素类，包括他莫昔芬(tamoxifen)4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene，及选择性雌激素受体调节剂(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯粹的抗雌激素，诸如氟维司群(fulvestrant)和EM800(此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化，抑制DNA结合，提高ER周转，和/或遏制ER水平)；芳香酶抑制剂，包括类固醇芳香酶抑制剂，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)及非类固醇芳香酶抑制剂，诸如阿那曲唑(anastrozole)来曲唑(letrozole)和氨鲁米特(aminoglutethimide)，及其它芳香酶抑制剂，包括伏罗唑(vorozole)醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)法倔唑(fadrozole)、咪唑(imidazole)；lutenizinghormone释放激素激动剂，包括亮丙瑞林(leuprolide)戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性类固醇类，包括孕激素，诸如醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)，雌激素，诸如乙烯雌酚(diethylstilbestrol)和倍美力(premarin)，及雄激素/类维A酸，诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式维A酸(transretionicacid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；雌激素受体下调调节剂(ERD)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；睾内酯(testolactone)；及上述任何物质的药学可接受的盐、酸或衍生物；以及两种或多种上述物质的组合。
在用于本文时，术语“EGFR靶向药物”指结合EGFR并任选抑制EGFR活化的治疗剂。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括MAb579(ATCCCRLHB8506)、MAb455(ATCCCRLHB8507)、MAb225(ATCCCRL8508)、MAb528(ATCCCRL8509)(参见Mendelsohn等人的美国专利4,943,533及其变体，诸如嵌合化225(C225或Cetuximab；)和重构人225(H225)(参见ImcloneSystemsInc.的WO96/40210)；IMC-11F8，完全人的EGFR靶向抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体，如美国专利5,891,996中所述；及结合EGFR的人抗体，诸如ABX-EGF或Panitumumab(参见Abgenix/Amgen的WO98/50433)；EMD55900(Stragliottoetal.，Eur.J.Cancer32A：636-640(1996))；EMD7200(matuzumab)，针对EGFR且与EGF和TGF-α竞争EGFR结合的人源化EGFR抗体(EMD/Merck)；人EGFR抗体，HuMax-EGFR(GenMab)；称为E1.1、E2.4、E2.5、E6.2、E6.4、E2.11、E6.3和E7.6.3和US6,235,883中描述的完全人的抗体；MDX-447(MedarexInc.)；及mAb806或人源化mAb806(Jonesetal.，J.Biol.Chem.279(29)：30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可与胞毒剂偶联，由此产生免疫偶联物(参见例如EP659,439A2，MerckPatentGmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子，诸如美国专利5,616,582、5,457,105、5,475,001、5,654,307、5,679,683、6,084,095、6,265,410、6,455,534、6,521,620、6,596,726、6,713,484、5,770,599、6,140,332、5,866,572、6,399,602、6,344,459、6,602,863、6,391,874、6,344,455、5,760,041、6,002,008和5,747,498以及PCT出版物WO98/14451、WO98/50038、WO99/09016和WO99/24037中描述的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774，erlotinib，Genentech/OSIPharmaceuticals)；PD183805(CI1033，2-propenamide，N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-，二盐酸化物，PfizerInc.)；ZD1839，gefitinib(IRESSATM，4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉，AstraZeneca)；ZM105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉，Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5，4-d]嘧啶-2，8-二胺，BoehringerIngelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-基]-酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺(butynamide))；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺(butenamide)，Wyeth)；AG1478(Sugen)；AG1571(SU5271；Sugen)；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如lapatinib(GW572016或N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]6[5[[[2-甲基磺酰基]乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺(quinazolinamine)；Glaxo-SmithKline)或氰基胍喹唑啉(cyanoguanidinequinazoline)和氰基脒喹唑胺(cyanoamidinequinazolamine)衍生物。
“酪氨酸激酶抑制剂”指抑制酪氨酸激酶诸如HER受体的酪氨酸激酶活 性的分子。这样的抑制剂的例子包括上一段中提到的EGFR靶向药物；小分 子HER2酪氨酸激酶抑制剂，诸如可从Takeda购买的TAK165；CP-724,714， 一种口服ErbB2受体酪氨酸激酶选择性抑制剂(PfizerandOSI)；优先结合 EGFR但抑制HER2和EGFR过表达细胞的双重HER抑制剂，诸如EKB-569(可 从Wyeth购买)；lapatinib(GW572016；可从Glaxo-SmithKline购买)，一种口 服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Novartis购买)；泛HER (pan-HER)抑制剂，诸如canertinib(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂，诸 如可从ISISPharmaceuticals购买的，抑制Raf-1信号传导的反义剂ISIS-5132； 非HER靶向TK抑制剂，诸如可从Glaxo购买的Imatinibmesylate (GLEEVACTM)；MAPK胞外调控激酶I抑制剂CI-1040(可从Pharmacia购买)； 喹唑啉类，诸如PD153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并 嘧啶类；吡咯并嘧啶类，诸如CGP59326、CGP60261和CGP62706；吡唑并 嘧啶类，4-(苯氨基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶；姜黄素(二阿魏酰甲烷，4，5-双(4- 氟苯胺基)-酞亚胺)；含硝基噻吩模块的tyrphostines；PD-0183805 (Warner-Lambert)；反义分子(例如那些结合HER编码核酸的反义分子)； 喹喔啉类(美国专利5,804,396)；tryphostins(美国专利5，804,396)；ZD6474 (AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/ScheringAG)；泛HER抑制剂，诸如 CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS3521；Isis/Lilly)；Imatinibmesylate(Gleevec； Novartis)；PKI166(Novartis)；GW2016(GlaxoSmithKline)；CI-1033(Pfizer)； EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787 (Novartis/ScheringAG)；INC-1C11(Imclone)；氰基胍喹唑啉和氰基脒喹 唑胺衍生物；或任何如下专利出版物中所记载的：美国专利5,804,396；WO 99/09016(AmericanCyanimid)；WO98/43960(AmericanCyanamid)；WO 97/38983(WarnerLambert)；WO99/06378(WarnerLambert)；WO99/06396 (WarnerLambert)；WO96/30347(Pfizer，Inc.)；WO96/33978(Zeneca)； WO96/3397(Zeneca)；WO96/33980(Zeneca)；及US2005/0101617。
“抗血管生成剂”指阻断或在某种程度上干扰血管发育的化合物。抗血管生成因子可以是例如结合涉及促进血管生成的生长因子或生长因子受体的小分子或抗体。在本文中优选的抗血管生成因子是结合血管内皮生长因子(VEGF)的抗体，诸如Bevacizumab
术语“细胞因子”指由一种细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一 细胞的蛋白质的通称。这样的细胞因子的例子是淋巴因子、单核因子和传统 的多肽激素。细胞因子包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长 激素、和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素； 松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促 黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素； 肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关 肽；抑制素；激活素(activin)；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成 素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子；转化生长因 子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素 (EPO)；骨诱导因子(osteoinductivefactor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ； 集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；肿瘤坏死因子， 诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文 时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质和天然 序列细胞因子的生物学活性等效物。
II.HER2抗体变体组合物
本发明至少部分关注某些HER2抗体组合物。优选的是，所述HER2抗体 (主要种类HER2抗体及其抗体变体其中任一或二者)是结合HER2结构域II， 比Trastuzumab更有效的抑制HER二聚化，和/或结合HER2的异二聚体结合位 点的抗体。本文中主要种类抗体的优选实施方案是包含SEQIDNo.3和4中的 轻链和重链可变区氨基酸序列，且最优选包含SEQIDNo.15和16中的轻链和 重链氨基酸序列(Pertuzumab)的抗体。
本文中的组合物包含结合HER2结构域II的主要种类HER2抗体及其酸性 变体，其中所述酸性变体包括糖化变体、二硫化物还原变体、和不可还原变 体中的一项、两项、或三项。所述组合物中的酸性变体可以包括糖化变体、 脱酰胺变体、二硫化物还原变体、唾液酰化变体、和不可还原变体中的一项、 两项、三项、四项、或五项。优选的是，所述组合物中所有酸性变体的总量 少于约25％。在一个实施方案中，糖化变体、脱酰胺变体、二硫化物还原变 体、唾液酰化变体、和不可还原变体构成所述组合物中酸性变体的至少约 75-80％。
本发明还关注包含主要种类HER2抗体及主要种类抗体的酸性变体的组 合物，其中所述主要种类HER2抗体包含SEQIDNo.3和4中的可变轻链和可 变重链序列，且其中所述酸性变体包括糖化变体、脱酰胺变体、二硫化物还 原变体、唾液酰化变体、和不可还原变体中的一项、两项、三项、四项、或 五项。
本发明提供一种制备药物组合物的方法，包括：(1)制备包含结合HER2 结构域II的主要种类HER2抗体及其酸性变体的组合物，所述酸性变体包括糖 化变体、二硫化物还原变体、或不可还原变体，并(2)评估所述组合物中的酸 性变体，并确定其量少于约25％。所述方法涵盖将步骤(2)之前、期间、或之 后的组合物与药学可接受载体组合。在一个实施方案中，在步骤(2)中评估的 组合物在药学可接受载体中。
在一个实施方案中，至少约75-80％的酸性变体(构成组合物的少于约 25％)选自：糖化变体、脱酰胺变体、二硫化物还原变体、唾液酰化变体、 和不可还原变体。
酸性变体可以通过多种方法来评估，但是优选的是所述方法包括下述一 项、两项、三项、四项、或五项：离子交换层析(IEC)，其中在IEC之前、之 后、和/或期间用唾液酸酶处理组合物(例如用于评估唾液酰化变体)；还原 性CE-SDS(例如用于评估二硫化物还原变体)；非还原性CE-SDS(例如用 于评估不可还原变体)；硼酸盐层析(例如用于评估糖化变体)；和肽作图(例 如用于评估脱酰胺变体)。
在一个实施方案中，通过离子交换层析来分析总的酸性变体，例如使用 弱阳离子交换剂和/或具有羧酸根官能团的阳离子交换剂(例如使用DIONEX PROPACJWCX-10层析柱)。在此类层析的一个实施方案中，层析条件涉及： 缓冲液A为20mMBisTris，pH6.0；缓冲液B为20mMBisTris，200mMNaCl，pH 6.0；和1.0mL/min的0.5％缓冲液B梯度。
所述组合物任选包含氨基末端前导延伸变体。优选的是，所述氨基末端 前导延伸位于抗体变体的轻链上(例如位于抗体变体的一条或两条轻链上)。 所述主要种类HER2抗体或抗体变体可以是完整抗体或抗体片段(如Fab或 F(ab’)2片段)，但优选二者都是完整抗体。本文中的抗体变体可以在其任何 一条或多条重链或轻链上包含氨基末端前导延伸。优选的是，所述氨基末端 前导延伸位于抗体的一条或两条轻链上。所述氨基末端前导延伸优选包含 VHS-或由其组成。组合物中氨基末端前导延伸的存在可通过多种分析技术 来检测，包括但不限于N-末端序列分析、电荷异质性的测定法(例如阳离子 交换层析或毛细管区带电泳)、质谱等。组合物中抗体变体的量通常在如下 范围内，即从构成用于检测变体的任何测定法(优选阳离子交换分析)的检 测下限的量到少于主要种类抗体量的量的范围。通常，组合物中约20％或更 少(例如从约1％至约15％，例如从5％至约15％，且优选从约8％至约12％) 的抗体分子包含氨基末端前导延伸。这样的百分比量优选通过阳离子交换分 析来测定。
涵盖主要种类抗体和/或变体的其它氨基酸序列改变，包括但不限于在其 一条或所有两条重链上包含C-末端赖氨酸残基的抗体(这样的抗体变体可以 以约1％至约20％的量存在)、具有一个或多个氧化后甲硫氨酸残基的抗体(例 如包含氧化后met-254的Pertuzumab)等。
此外，在上文讨论的唾液酰化变体之外，主要种类抗体或变体可包含别 的糖基化变异，其非限制性例子包括包含附着于其Fc区的G1或G2寡糖结构 的抗体、包含附着于其轻链的碳水化合物模块的抗体(例如一个或多个碳水 化合物模块，诸如葡萄糖或半乳糖附着于抗体的一条或两条轻链，例如附着 于一个或多个赖氨酸残基)、包含一条或两条非糖基化重链的抗体等。
任选的是，包含一条或两条轻链的抗体，其中两条轻链其中任一或二者 包含SEQIDNo.23中的氨基酸序列(包括其变体，诸如本文中公开的那些)。 所述抗体还包含一条或两条重链，其中两条重链其中任一或二者包含SEQID No.16或SEQIDNo.24中的氨基酸序列(包括其变体，诸如本文中公开的那 些)。
组合物可从表达HER2抗体的基因工程细胞系回收，从例如中国仓鼠卵 巢(CHO)细胞系回收，或者可通过肽合成来制备。
III.HER2抗体的生成
下文描述了用于生成依照本发明使用的抗体的例示性技术。用于生成抗 体的HER2抗原可以是例如可溶形式的HER2胞外域或其含有所需表位的部 分。或者，在其细胞表面表达HER2的细胞(例如经转化而过表达HER2的 NIH-3T3细胞；或癌细胞系，诸如SK-BR-3细胞，参见Stancovskietal.，PNAS (USA)88：8691-8695(1991))可用于生成抗体。可用于生成抗体的其它形式 HER2对于本领域技术人员是显而易见的。
(i)单克隆抗体
单克隆抗体是从一群基本上同质的抗体获得的，即构成群体的各个抗体 相同和/或结合相同表位，除了单克隆抗体生产过程中可能产生的可能突变 外，诸如本文所述那些变体。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征，即 不是分立抗体的混合物。
例如，单克隆抗体可通过最初由Kohleretal.，Nature256：495(1975)描述 的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利 4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠， 以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免 疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸 如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding， 《MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice》，59-103，AcademicPress， 1986)。
将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优 选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如， 如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或 HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT 培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水 平生成抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的骨髓瘤细胞。在这些细胞 中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤系，诸如那些可从SalkInstituteCell DistributionCenter(SanDiege，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11 小鼠肿瘤的衍生系，及可从AmericanTypeCultureCollection(Rockville， Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体 的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.133： 3001(1984)；及Brodeur等人，《MonoclonalAntibodyProductionTechniquesand Applications》，51-63，MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)。
可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的 生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测 定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆 抗体的结合特异性。
单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munsonetal.，Anal.Biochem.107： 220(1980)的Scatchard分析来测定。
在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞 后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并通过标准方法进行培养 (Goding，《MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice》，59-103， AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或 RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。
可通过常规抗体纯化流程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、 凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或 血清适当分开。
编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如使用能够特 异性结合编码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞 作为所述DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将 该表达载体转染到宿主细胞中，诸如不另外产生抗体蛋白质的大肠杆菌细 胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主 细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的 综述性论文包括Skerraetal.，Curr.OpinioninImmunol.5：256-262(1993)和 Plückthun，Immunol.Revs.130：151-188(1992)。
在另一个实施方案中，可从使用McCaffertyetal.，Nature348：552-554 (1990)所述技术构建的噬菌体抗体库中分离单克隆抗体或抗体片段。 Clacksonetal.，Nature352：624-628(1991)和Marksetal.，J.Mol.Biol.222： 581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠源和人源抗体。后续出版物 描述了通过链改组(Marksetal.，Bio/Technology10：779-783(1992))，以及组 合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouseetal.， Nuc.AcidsRes.21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人源抗体。 因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行 替代方法。
还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定区的编码序列代 替同源鼠源序列(美国专利4,816,567；及Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci. USA81：6851(1984))，或通过共价接合免疫球蛋白编码序列和非免疫球蛋白 多肽的整个或部分编码序列。
通常，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区，或者用它们替代抗 体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体，它包含对一种抗原 具有特异性的一个抗原结合位点及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结 合位点。
(ii)人源化抗体
本领域已经描述了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗 体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常 称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上依照 Winter及其同事的方法进行(Jonesetal.，Nature321：522-525(1986)； Riechmannetal.，Nature332：323-327(1988)；Verhoeyenetal.，Science239： 1534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类 “人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中本质上少于整个人 可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中 一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基 替代的人抗体。
用于制备人源化抗体的人可变区的选择，包括轻链和重链，对于降低抗 原性非常重要。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变区序 列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的 人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Simsetal.，J.Immunol.151：2296 (1993)；Chothiaetal.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻 链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于 数种不同的人源化抗体(Carteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285 (1992)；Prestaetal.，J.Immunol.151：2623(1993))。
更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生 物学特性。为了实现这一目的，依照一种优选的方法，通过使用亲本和人源 化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人 源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员 所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构 的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使 功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。 这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特 征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对 抗原结合的影响。
美国专利第6,949,245号描述了结合HER2并阻断HER受体的配体活化的 例示性人源化HER2抗体的生成。本文中特别感兴趣的人源化抗体基本上像 完整鼠单克隆抗体2C4(或其Fab片段)一样有效的阻断EGF、TGF-α和/或 HRG介导的MAPK激活，和/或基本上像完整鼠单克隆抗体2C4(或其Fab片 段)一样有效的结合HER2。本文中的人源化抗体可例如包含掺入人重链可 变区的非人高变区残基，而且还可在选自69H、71H和73H的位置包含框架区 (FR)替代，采用的是Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunological Interest》，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda， MD，1991中给出的可变区编号系统。在一个实施方案中，人源化抗体在69H、 71H和73H的两个或所有位置包含FR替代。
本文中的例示性目的人源化抗体包含重链可变区互补决定残基 GFTFTDYTMX，其中X优选是D或S(SEQIDNO：7)； DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQIDNO：8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQIDNO： 9)，任选包含那些CDR残基的氨基酸修饰，例如其中修饰基本上保持或改善 抗体的亲和力。例如，目的抗体变体可在上述重链可变区CDR序列中具有约 1个至约7个或者约5个氨基酸替代。这样的抗体变体可通过亲和力成熟来制 备，例如如下文所述。最优选的人源化抗体包含SEQIDNO：4中的重链可变 区氨基酸序列。
例如，除了前一段落中的那些重链可变区CDR残基之外，人源化抗体还 可包含轻链可变区互补决定残基KASQDVSIGVA(SEQIDNO：10)； SASYX1X2X3，其中X1优选是R或L，X2优选是Y或E，而X3优选是T或S(SEQ IDNO：11)；和/或QQYYIYPYT(SEQIDNO：12)。这样的人源化抗体任选 包含上述CDR残基的氨基酸修饰，例如其中修饰基本上保持或改善抗体的亲 和力。例如，目的抗体变体可在上述轻链可变区CDR序列中具有约1个至约7 个或者约5个氨基酸替代。这样的抗体变体可通过亲和力成熟来制备，例如 如下文所述。最优选的人源化抗体包含SEQIDNO：3中的轻链可变区氨基酸 序列。
本申请还设想了亲和力成熟的抗体，它结合HER2并阻断HER受体的配 体活化。亲本抗体可以是人抗体或人源化抗体，例如包含轻链和/或重链可变 区序列分别为SEQIDNO：3和4的抗体(即变体574)。亲和力成熟的抗体优 选以高于完整鼠2C4或完整变体574的亲和力结合HER2受体(例如根据采用 HER2胞外域(ECD)ELISA的评估，例如亲和力提高约2倍或约4倍至约100倍 或约1000倍)。例示性的用于替代的重链可变区CDR残基包括H28、H30、H34、 H35、H64、H96、H99，或者两个或多个的组合(例如这些残基中的2、3、 4、5、6或7个)。用于改变的轻链可变区CDR残基的例子包括L28、L50、L53、 L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97，或者两个或多个的组合(例如这些 残基中的2至3、4、5或直到约10个)。
还设想了各种形式的人源化抗体或亲和力成熟的抗体。例如，人源化抗 体或亲和力成熟的抗体可以是抗体片段，诸如Fab，它任选与一种或多种胞 毒剂偶联以产生免疫偶联物。或者，人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是 完整抗体，诸如完整的IgG1抗体。
(iii)人抗体
作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏 内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因 动物(如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区 (JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中 转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如 Jakobovitsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovitsetal.， Nature362：255-258(1993)；Bruggermannetal.，YearinImmuno.7：33(1993)； 及美国专利5,591,669、5,89,369和5,545,807。
或者，噬菌体展示技术(McCaffertyetal.，Nature348：552-553(1990)) 可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人抗 体和抗体片段。依照这种技术，将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13 或fd的主要或次要外壳蛋白基因的读码框中，并在噬菌体颗粒表面上展示为 功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体 的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选 择。因此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行； 有关综述参见例如Johnson，KevinS.andChiswell，DavidJ.，CurrentOpinionin StructuralBiology3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展 示。Clacksonetal.，Nature352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型 V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可本质上依照Marks etal.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffithetal.，EMBOJ.12：725-734 (1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗 原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利5,565,332和5,573,905。
还可通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)来生成 人抗体。
1998年6月30日发布的美国专利5,772,997和1997年1月3日出版的WO 97/00271中描述了人HER2抗体。
(iv)抗体片段
已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化 完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimotoetal.，JournalofBiochemical andBiophysicalMethods24：107-117(1992)及Brennanetal.，Science229：81 (1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文 讨论的噬菌体抗体库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH 片段，并通过化学方法偶联形成F(ab′)2片段(Carteretal.，Bio/Technology10： 163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它 实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专 利5,571,894；和美国专利5,587,458。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如 如美国专利5,641,870中所述。所述线性抗体片段可以是单特异性的或双特异 性的。
(v)双特异性抗体
双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的 双特异性抗体可结合HER2蛋白质的两种不同表位。其它此类抗体可将HER2 结合位点与EGFR、HER3和/或HER4的结合位点进行组合。或者，HER2臂 可与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(如CD2或CD3)或IgG的Fc 受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂 组合，使得细胞防御机制聚焦于HER2表达细胞。双特异性抗体还可用于将 胞毒剂定位于表达HER2的细胞。这些抗体拥有HER2结合臂及结合胞毒剂 (如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶 呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体 片段(如F(ab′)2双特异性抗体)。
WO96/16673描述了一种双特异性HER2/FcγRIII抗体，而美国专利 5,837,234公开了一种双特异性HER2/FcγRI抗体IDM1(Osidem)。WO 98/02463显示了一种双特异性HER2/Fcα抗体。美国专利5,821,337教导了一种 双特异性HER2/CD3抗体。MDX-210是一种双特异性HER2-FcγRIII抗体。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传 统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的 特异性(Millsteinetal.，Nature305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和 轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体 分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和 层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产量低。WO93/08829及 Trauneckeretal.，EMBOJ.10：3655-3659(1991)中公开了类似的流程。
依照一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点) 的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰 链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区。优选的是，在至少一种融合物 中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球 蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载 体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时 提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大 的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比 率没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个 载体。
在该方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结 合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻 链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性 分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需 双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Sureshetal.，Methods inEnzymology121：210(1986)。
依照美国专利5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间 的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界 面包含至少部分CH3抗体恒定区。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个 或多个小氨基酸侧链用较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小氨 基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面 上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它 不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一 种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用 于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，和用于治疗HIV 感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。可使用任何便利的交联方 法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多 交联技术一起公开于美国专利4,676,980。
文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化 学连接来制备双特异性抗体。Brennanetal.，Science229：81(1985)描述了通 过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的方法。将这些片段在存在二硫 醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键 的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然 后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等 摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异 性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最近的进展使得从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段变得更加容易，这些 片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalabyetal.，J.Exp.Med.175： 217-225(1992)描述了生成完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子。每个Fab′ 片段由大肠杆菌分开分泌，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗 体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T 细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶的溶解活性。
还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种 技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelnyetal.，J.Immunol. 148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合 与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体， 然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。 由Hollingeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993)描述的“双 抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头 相连的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述接头太短使得同一条链上的 两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一 个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道 了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见 Gruberetal.，J.Immunol.152：5368(1994)。
设想了具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tuttetal.， J.Immunol.147：60(1991)。
(vi)其它氨基酸序列修饰
设想了本文所述HER2抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗 体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将适当的核苷酸改变引入HER2 抗体核酸或者通过肽合成来制备HER2抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包 括例如HER2抗体氨基酸序列中的残基删除和/或插入和/或替代。只要最终的 构建物具有所需特性，可进行删除、插入和替代的任何组合以获得最终的构 建物。氨基酸变化还可改变HER2抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化位点 的数目或位置。
可用于鉴定HER2抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种方 法称作“丙氨酸扫描突变”，如CunninghamandWells，Science244：1081-1085 (1989)所述。这里，鉴定了一个或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如精 氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)，并用中性或带负电荷的氨基 酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影响氨基酸与HER2抗原的相互作 用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲那些对替代显示功 能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预先决定 的，但是突变本身的性质不需要预先决定。例如，为了分析在指定位点处的 突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描诱变或随机突变，并对所表 达的HER2抗体变体筛选所需活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，长度范围从一个残基 至包含上百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。 末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰残基的HER2抗体或与细胞毒性多 肽融合的抗体。HER2抗体分子的其它插入变体包括在HER2抗体的N-或C- 末端融合酶(例如用于ADEPT)或提高抗体血清半衰期的多肽。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在HER2抗体分子中有至少一 个氨基酸残基用不同残基替换。最感兴趣进行替代诱变的位点包括高变区或 CDR，但也考虑了FR或Fc区改变。保守替代在表1中显示在标题“优选替代” 下。如果此类替代导致生物学活性的改变，那么可以引入表1中称为“例示 替代”的更实质性改变，或如下文中关于氨基酸种类的进一步描述，并筛选 产物。
表1
原始残基 例示替代 优选替代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln Asp(D) Glu；Asn Glu Cys(C) Ser；Ala Ser Gln(Q) Asn；Glu Asn Glu(E) Asp；Gln Asp Gly(G) Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val；Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
对抗体生物学特性的实质性修饰通过选择在保持以下方面的效果上显 著不同的替代来完成：(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或 螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧 链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger，在《Biochemistry》 中，第2版，73-75，WorthPublishers，NewYork，1975)： (1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、 Met(M)
(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn (N)、Gln(Q)
(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)
(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)
或者，根据共同的侧链特性，可将天然存在残基如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性的：Asp、Glu；
(4)碱性的：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。
非保守替代将需要用这些类别之一中的一个成员交换另一个类别的。
任何不涉及保持HER2抗体正确构象的半胱氨酸残基也可替代，通常用 丝氨酸，以改进分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可向抗体中添加 半胱氨酸键以改善其稳定性(特别是当抗体是抗体片段诸如Fv片段时)。
特别优选的一类替代变体牵涉替代亲本抗体(如人源化或人抗体)的一 个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它 们的亲本抗体将具有改进的生物学特性。产生此类替代变体的一种便利方法 牵涉使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如e6-7 个位点)突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此产生的抗体变 体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的M13基因 III产物的融合物。然后如本文所公开的对噬菌体展示的变体筛选其生物学活 性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨 酸扫描诱变以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析 抗原-抗体复合物的晶体结构，以鉴定抗体和人HER2之间的接触点可能是有 益的。所述接触残基及邻近残基是依照本文详述的技术进行替代的候选位 点。一旦产生这样的变体，如本文所述对该组变体进行筛选，可选择在一种 或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。
抗体的另一类氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化样式。改变意味着删 除在抗体中发现的一个或多个碳水化合物模块，和/或添加抗体中不存在的一 个或多个糖基化位点。
抗体的糖基化通常或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模 块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X- 苏氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着 于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列其中任一的存在产 生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖 或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5- 羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
向抗体中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列使其包含一个或多个 上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通 过向原始抗体的序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行 (用于O-连接的糖基化位点)。
若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的任何寡糖结构。例如，美国专利 申请US2003/0157108A1(Presta，L.)中描述了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合 物结构附着于抗体Fc区的抗体。还可参见US2004/0093621A1(KyowaHakko KogyoCo.，Ltd.)。WO03/011878(Jean-Mairet等人)和美国专利6,602,684 (Umana等人)中提到了在附着于抗体Fc区的寡糖结构中有等分N-乙酰葡糖 胺(GlcNAc)的抗体。WO97/30087(Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区 的寡糖结构中有至少一个半乳糖残基的抗体。关于有更改碳水化合物附着于 其Fc区的抗体还可参见WO98/58964(Raju，S.)和WO99/22764(Raju，S.)。 本文还设想了包含有此类碳水化合物结构附着于Fc区一条或两条重链上的 主要种类抗体的抗体组合物
编码HER2抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域已知的多种方 法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变 体的情况中)，或者通过对早期制备的变体或非变体型式的HER2抗体进行寡 核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。
(vii)筛选具有期望特性的抗体
上文已经描述了用于生成抗体的技术。如果需要，还可以选择具有某些 生物学特征的抗体。
为了鉴定阻断HER受体的配体活化的抗体，可测定抗体阻断HER配体结 合表达HER受体(例如偶联另一种HER受体，该HER受体与目的HER受体形 成HER异寡聚体)的细胞的能力。例如，可将天然表达或者经转染而表达HER 异寡聚体的HER受体的细胞与抗体一起温育，然后暴露于经标记的HER配 体。然后可评估HER2抗体阻断配体结合HER异寡聚体中的HER受体的能力。
例如，可以基本上如WO01/00245中所述，以24孔板的形式在冰上使用 单层MCF7培养物进行HER2抗体对HRG结合MCF7乳房肿瘤细胞系的抑制。 可将HER2单克隆抗体添加到各个孔中并温育30分钟。然后可加入125I标记的 rHRGβ1177-224(25pm)，并可继续温育4-16小时。可绘制剂量-应答曲线，并 可计算目的抗体的IC50值。在一个实施方案中，阻断HER受体的配体活化的 抗体在此测定法中抑制HRG结合MCF7细胞的IC50为约50nM或更低，更优选 10nM或更低。当抗体是抗体片段诸如Fab片段时，在此测定法中抑制HRG结 合MCF7细胞的IC50可以是例如约100nM或更低，更优选50nM或更低。
或者/另外，可评估HER2抗体阻断HER异寡聚体中存在的HER受体的 HER配体刺激的酪氨酸磷酸化的能力。例如，可将内源表达或者经转染而表 达HER受体的细胞与抗体一起温育，然后使用抗磷酸酪氨酸单克隆(任选偶 联有可检测标记物)测定HER配体依赖性酪氨酸磷酸化活性。美国专利 5,766,863中描述的激酶受体活化测定法也可用于测定HER受体活化和抗体 对该活性的阻断。
在一个实施方案中，可以基本上如WO01/00245中所述，筛选在MCF7 细胞中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的抗体。例如，可将MCF7细胞铺到 24孔板中，并将HER2的单克隆抗体加入每个孔中，于室温温育30分钟；然 后可向每个孔中加入rHRGβ1177-244至终浓度0.2nM，并可继续温育8分钟。从 每个孔中吸走培养基，通过加入100μlSDS样品缓冲液(5％SDS，25mMDTT， 25mMTris-HCl，pH6.8)来终止反应。可在4-12％梯度凝胶(Novex)上对每 一份样品(25μl)进行电泳，然后通过电泳转移到聚偏二氟乙烯膜上。可对 抗磷酸酪氨酸(以1μg/ml)免疫印迹显影，并通过反射密度法(reflectance densitometry)量化Mr约180,000的主要反应性条带的强度。在此测定法中，所 选抗体优选将HRG刺激p180酪氨酸磷酸化显著抑制至对照的约0-35％。可绘 制通过反射密度法测定的对HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的抑制作用的剂量- 应答曲线，并可计算目的抗体的IC50。在一个实施方案中，阻断HER受体的 配体活化的抗体在此测定法中抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的IC50为约 50nM或更低，更优选10nM或更低。当抗体是抗体片段诸如Fab片段时，在此 测定法中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的IC50可以是例如约100nM或更 低，更优选50nM或更低。
还可评估抗体对MDA-MB-175细胞的生长抑制作用，例如基本上如 Schaeferetal.，Oncogene15：1385-1394(1997)中所述。依照此测定法，可将 MDA-MB-175细胞用HER2单克隆抗体(10μg/mL)处理4天，并用结晶紫染 色。与HER2抗体的温育对此细胞系显示的生长抑制作用可能与使用单克隆 抗体2C4相似。在还有一个实施方案中，外源HRG不会显著逆转这种抑制作 用。优选的是，无论是否存在外源HRG，该抗体将能够以大于单克隆抗体4D5 的程度(并且任选以大于单克隆抗体7F3的程度)抑制MDA-MB-175细胞的 细胞增殖。
在一个实施方案中，根据免疫共沉淀实验的测定，诸如WO01/00245中 所述，目的HER2抗体可在MCF7和SK-BR-3细胞中阻断调蛋白依赖性的 HER2与HER3结合，实质上比单克隆抗体4D5更有效，且优选实质上比单克 隆抗体7F3更有效。
为了鉴定生长抑制性HER2抗体，可筛选抑制过表达HER2的癌细胞生长 的抗体。在一个实施方案中，在约0.5-30μg/ml的抗体浓度，所选生长抑制性 抗体能够将细胞培养中的SK-BR-3细胞生长抑制约20-100％，优选约 50-100％。为了鉴定这样的抗体，可进行美国专利5,677,171中描述的SK-BR-3 测定法。依照此测定法，在添加了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素链霉素 的，F12和DMEM培养基的1∶1混合液中培养SK-BR-3细胞。以20,000个细胞 将SK-BR-3细胞铺入35mm细胞培养皿(2ml/35mm培养皿)。每个培养皿加入 0.5-30μg/mlHER2抗体。6天后，使用电子COULTERTM细胞计数器对细胞数 计数，与未处理细胞比较。可选择那些将SK-BR-3细胞生长抑制约20-100％ 或约50-100％的抗体作为生长抑制性抗体。关于用于筛选生长抑制性抗体， 诸如4D5和3E8的测定法，参见美国专利5,677,171。
为了选择诱导凋亡的抗体，可利用使用BT474细胞的膜联蛋白结合测定 法。如前一段落所讨论的，在培养皿中培养和接种BT474细胞。然后除去培 养基，只用新鲜培养基或者含有10μg/ml单克隆抗体的培养基替换。在3天温 育期后，用PBS洗涤细胞单层，通过胰蛋白酶消化脱离。然后如上文关于细 胞死亡测定法所讨论的，离心细胞，重悬于Ca2+结合缓冲液中，并等分到试 管中。然后往试管中加入经标记的膜联蛋白(如膜联蛋白V-FTIC)(1μg/ml)。 可使用FACSCANTM流式细胞计数仪和FACSCONVERTTMCellQuest软件 (BectonDickinson)来分析样品。选择那些相对于对照诱导统计学显著水平 的膜联蛋白结合的抗体作为诱导凋亡的抗体。除了膜联蛋白结合测定法，还 可利用使用BT474细胞的DNA染色测定法。为了进行此测定法，将已经如前 面两段所述用目的抗体处理过的BT474细胞与9μg/mlHOECHST33342TM于 37℃温育2小时，然后使用MODFITLTTM软件(VeritySoftwareHouse)在 EPICSELITETM流式细胞计数仪(CoulterCorporation)上进行分析。可选择 在此测定法中诱导的凋亡细胞百分比变化比未处理细胞高2倍或更高(优选3 倍或更高)(直到100％凋亡细胞)的抗体作为促凋亡(pro-apoptotic)抗体。用 于筛选诱导凋亡抗体诸如7C2和7F3的测定法参见WO98/17797。
为了筛选结合HER2上目的抗体所结合的表位的抗体，可进行常规交叉 阻断测定法，诸如《Antibodies，ALaboratoryManual》，ColdSpringHarbor Laboratory，EdHarlow和DavidLane，1988中所述，以评估所述抗体是否交 叉阻断诸如2C4或Pertuzumab等抗体与HER2的结合。或者/另外，可通过本领 域已知的方法进行表位作图，且/或可研究抗体-HER2结构(Franklinetal.， CancerCell5：317-328(2004))以了解抗体结合HER2的哪个/哪些结构域。
(viii)免疫偶联物
本发明还涉及包含偶联有胞毒剂的抗体的免疫偶联物，所述胞毒剂诸如 化疗剂、毒素(如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素， 包括其片段和/或变体)或放射性同位素(即放射偶联物)。
上文已经描述了可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂。本文还设想了抗 体与一种或多种小分子毒素的偶联物，诸如加利车霉素、美登素(美国专利 5,208,020)、单端孢菌毒素和CC1065。
在本发明的一个优选实施方案中，将抗体与一个或多个美登素分子偶联 (例如每个抗体分子偶联约1个至约10个美登素分子)。例如可将美登素转变 为May-SS-Me，后者可还原为May-SH3并与经修饰抗体反应(Charietal.， CancerResearch52：127-131(1992))以产生美登木素生物碱-抗体免疫偶联 物。
另一种目的免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的HER2 抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。可使 用的加利车霉素的结构类似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙酰基-γ1I、PSAG 和θI1(Hinmanetal.，CancerResearch53：3336-3342(1993)和Lodeetal.， CancerResearch58：2925-2928(1998))。还可参见美国专利5,714,586； 5,712,374；5,264,586；和5,773,001，明确收入本文作为参考。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性 片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋 白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲毒素(sarcin)、 油桐(Aleuritesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制 物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis) 抑制物、白树毒素(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、 酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌毒素(tricothecenes)。参 见例如1993年10月28日出版的WO93/21232。
本发明还设想了抗体与具有核酸水解活性的化合物(如核糖核酸酶或 DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
有多种放射性同位素可用于生成放射偶联HER2抗体。例子包括At211、 I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和胞毒剂的偶联物，诸如 3-(2-吡啶基二巯基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环 己胺-1-羧酸琥珀酰亚胺酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚 胺二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛类(诸如戊二醛)、 双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对 重氮苯甲酰基)己二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性 氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta etal.，Science238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的 1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性 核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在 细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、 肽酶敏感接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Charietal.，CancerResearch 52：127-131(1992))。
或者，可例如通过重组技术或肽合成来制备包含HER2抗体和胞毒剂的 融合蛋白。
在另一个实施方案中，可将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联， 用于肿瘤的预定位，其中对患者施用抗体-受体偶联物，随后使用清除剂从 循环中除去未结合的偶联物，然后施用与胞毒剂(如放射性核苷酸)偶联的 “配体”(例如亲合素)。
(ix)其它抗体修饰
本文还设想了抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚 合物中的一种连接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二 醇和聚丙二醇的共聚物。还可将抗体包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚 合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯 酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微 乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于 《Remington′sPharmaceuticalSciences》，第16版，Osol，A.编，1980。
可能希望在效应物功能方面修饰本发明的抗体，例如增强抗体的抗体依 赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可通 过在抗体Fc区中引入一个或多个氨基酸替代来实现。或者/另外，可在Fc区中 引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此产生的同二聚 体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依 赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见Caronetal.，J.Exp.Med.176：1191-1195 (1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活 性的同二聚体抗体还可使用如Wolffetal.，CancerResearch53：2560-2565 (1993)中描述的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区， 由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevensonetal.，Anti-Cancer DrugDesign3：219-230(1989)。
WO00/42072(Presta，L.)描述了在存在人效应细胞时具有改进的ADCC 功能的抗体，其中所述抗体在其Fc区中包含氨基酸替代。优选的是，具有改 进的ADCC的抗体在Fc区的位置298、333和/或334包含替代。优选的是，改 变的Fc区是在一个、两个或三个这些位置处包含替代或由其组成的人IgG1 Fc区。
WO99/51642、美国专利6,194,551B1、美国专利6,242,195B1、美国专 利6,528,624B1和美国专利6,538,124(Idusogie等人)中描述了具有改变的C1q 结合和/和补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体。这些抗体在其Fc区的氨基酸位 置270、322、326、327、329、313、333和/或334其中一个或多个处包含氨基 酸替代。
为了提高抗体的血清半衰期，可如例如美国专利5,739,277中所述将补救 受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受 体结合表位”指IgG分子(如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc区中负责提高IgG 分子体内血清半衰期的表位。WO00/42072(Presta，L.)中还描述了在其Fc区 中具有替代且血清半衰期延长的抗体。
还设想了具有三个或更多(优选四个)功能性抗原结合位点的改造抗体 (美国专利申请US2002/0004587A1，Miller等人)。
本文公开的HER2抗体还可配制成脂质体。可通过本领域已知的方法来 制备包含抗体的脂质体，诸如Epsteinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：3688 (1985)；Hwangetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4030(1980)；美国专利 4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日出版的WO97/38731中所述。美国 专利5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。
特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙 醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有设定孔 径的滤器，以产生具有所需直径的脂质体。可如Martinetal.，J.Biol.Chem. 257：286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与 脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂。参见Gabizonetal.，J.National CancerInst.81(19)：1484(1989)。
IV.药物配制剂
制备本发明组合物的治疗用配制剂，即将组合物与任选的药学可接受的 载体、赋形剂或稳定剂混合(《Remington′sPharmaceuticalSciences》，第16 版，Osol，A.编，1980)，以冻干配制剂或水溶液的形式贮存。可接受的载体、 赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，还包括缓冲剂， 诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸； 防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索 氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或 丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少 于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水 性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰 胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、 甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或 山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/ 或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。 WO97/04801中描述了冻干HER2抗体配制剂。US20006/088523中记载了对于 本发明组合物而言特别优选的配制剂。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化 合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，可能还希望 在配制剂中提供结合EGFR、HER2(例如结合HER2上不同表位的抗体)、 HER3、HER4或血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。或者/另外，配制剂中还 可包含化疗剂、胞毒剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、EGFR靶向药 物、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和/或心脏保护剂。此类分子适于以有 效用于所需目的的量而联合存在。
活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊 中，例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊、 在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和 纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏 水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。 持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或 聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的 共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如 LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微 球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过 滤来实现。
V.使用HER2抗体的治疗
依照本发明，HER2抗体可用于治疗癌症。所述癌症通常是HER2阳性的， 使得本文的HER2抗体能够结合所述癌细胞。在一个实施方案中，所述癌症 表达低HER3(例如卵巢癌)或具有升高的HER2∶HER3比(例如卵巢癌)。上 文定义部分列出了可用本发明组合物治疗的癌症。
本文中要治疗的优选的癌症包括：乳腺癌，包括HER2阳性乳腺癌，任 选与trastuzumab和类紫杉烷诸如多西他赛组合，而且包括乳腺癌的新辅助疗 法；卵巢癌(包括铂耐受性和铂敏感性卵巢癌)(参见例如US2006/0013819)； 肺癌(包括非小细胞肺癌，NSCLC)，任选与EGFR抑制剂组合(参见例如US 2007/0020261)；结肠直肠癌等。
本文中HER2抗体可用于治疗各种非恶性疾病或病症，诸如自身免疫性 疾病(如银屑病)；子宫内膜异位；硬皮病；再狭窄；息肉，诸如结肠息肉、 鼻息肉或胃肠息肉；纤维腺瘤；呼吸疾病；胆囊炎；神经纤维瘤病；多囊性 肾病；炎性疾病；皮肤病症，包括银屑病和皮炎；脉管疾病；牵涉脉管上皮 细胞异常增殖的状况；胃肠溃疡；门内特里埃氏(Menetrier)病，分泌型腺瘤 或蛋白质流失综合征(proteinlosssyndrome)；肾病症；血管生成性病症；眼 病，诸如年龄相关黄斑变性、假定的眼组织胞浆菌病综合症(presumedocular histoplasmosissyndrome)、来自增殖性糖尿病性视网膜病、视网膜血管形成、 糖尿病性视网膜病或年龄相关的黄斑变性的视网膜新血管形成；骨相关病理 学，诸如骨关节炎、佝偻病和骨质疏松；脑缺血事件后的损伤；纤维变性或 水肿(edema)疾病，诸如肝硬化、肺纤维化、carcoidosis、throiditis、系统性 高粘滞综合症、奥斯勒-韦伯-朗迪(Osler-Weber-Rendu)病、慢性阻塞性肺病， 或者烧伤、外伤、辐射、中风、组织缺氧或缺血后的水肿；皮肤的超敏反应； 糖尿病性视网膜病变和糖尿病性肾病；格-巴二氏(Guillain-Barre)综合征；移 植物抗宿主病或移植排斥；佩吉特氏(Paget)病；骨或关节发炎；光老化(例 如由UV照射人皮肤引起的)；良性前列腺肥大；某些微生物感染，包括选自 腺病毒、汉坦病毒(hantaviruses)、布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、耶 尔森氏菌属(Yersiniaspp.)和百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的微 生物病原体；由血小板聚集引起的血栓；生殖疾患，诸如子宫内膜异位、卵 巢过刺激综合征、先兆子痫、功能障碍性子宫出血或月经频多；滑膜炎；粥 样斑；急性和慢性肾病(包括增生性肾小球肾炎和糖尿病诱发的肾病)；湿 疹；肥厚性瘢痕形成；内毒素性休克和真菌感染；家族性腺瘤息肉病；神经 变性疾病(如阿尔茨海默氏(Alzheimer)病、AIDS相关痴呆、帕金森氏 (Parkinson)病、肌萎缩侧索硬化、视网膜色素变性、脊髓性肌萎缩和小脑变 性)；骨髓发育异常综合症(myelodysplasticsyndrome)；再生障碍性贫血；缺 血性损伤；肺、肾或肝的纤维化；T细胞介导的超敏性疾病；婴儿肥厚性幽 门狭窄；泌尿阻塞综合症；银屑病关节炎；和桥本氏(Hasimoto)甲状腺炎。 本文疗法优选的非恶性适应症包括银屑病、子宫内膜异位、硬皮病、脉管疾 病(如再狭窄、动脉粥样硬化、冠状动脉病或高血压)、结肠息肉、纤维腺 瘤或呼吸疾病(如哮喘、慢性支气管炎、支气管扩张或囊性纤维化)。
使用HER2抗体的治疗将导致疾病的体征或症状改善。例如，若所治疗 疾病是癌症，则此类疗法可导致存活(总体存活和/或无进展存活)有所提高 和/或可导致客观临床响应(部分的或完全的)。
优选的是，所施用组合物中的HER2抗体是裸抗体。然而，所施用的HER2 抗体可偶联胞毒剂。优选的是，免疫偶联物和/或其所结合的HER2蛋白质受 到细胞的内在化，导致免疫偶联物杀伤其所结合的癌细胞的治疗功效提高。 在一个优选的实施方案中，胞毒剂靶向或干扰癌细胞中的核酸。此类胞毒剂 的例子包括美登木素生物碱、加利车霉素、核糖核酸酶和DNA内切核酸酶。
依照已知方法对人类患者施用HER2抗体，诸如静脉内施用，例如推注 或一段时间的连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、 滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径。优选静脉内施用抗体组合物。
对于疾病的预防或治疗，HER2抗体的适当剂量将取决于如上定义的待 治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、施用HER2抗体是为了预防还是 治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对HER2抗体的响应、及主治医师 的判断。适当的在某一时间或者通过一系列治疗对患者施用HER2抗体。根 据疾病的类型和严重程度，对患者施用的初始候选剂量是约1μg/kg至 50mg/kg(如0.1-20mg/kg)HER2抗体，无论是通过例如一次或多次分开的施 用，或者通过连续输注。在一个实施方案中，HER2抗体的初始输注时间可 长于后续输注时间，例如初始输注为约90分钟，而后续输注为约30分钟(如 果初始输注耐受良好的话)。优选的HER2抗体剂量将在约0.05mg/kg至约 10mg/kg的范围内。因此，可对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或 10mg/kg(或其任意组合)的一剂或多剂。这样的剂量可间歇施用，例如每 周或每三周(例如使得患者接受约2剂至约20剂，例如约6剂HER2抗体)。可 首先施用较高的加载剂量，后续较低的一剂或多剂。在一个实施方案中，首 先以约840mg的加载剂量施用HER2抗体，然后大约每三周施用约420mg。在 另一个实施方案中，首先以约1050mg的加载剂量施用HER2抗体，然后大约 每三周施用约525mg。
其它治疗剂可与HER2抗体联合。这样的联合施用包括使用分开的配制 剂或单一的药用配制剂的共施用或同时施用，以及任一次序的连续施用，其 中优选有一段时间所有两种(或多种)活性剂同时发挥其生物学活性。因此， 可在施用HER2抗体之前或之后施用其它治疗剂。在此实施方案中，至少一 次其它治疗剂的施用和至少一次HER2抗体的施用之间的计时优选为约1个 月或更短，且最优选约2周或更短。或者，以单一的配制剂或分开的配制剂 同时对患者施用其它治疗剂和HER2抗体。
可与HER2抗体联合的其它治疗剂的例子包括以下任一种或多种：化疗剂，诸如抗代谢物，如吉西他滨；第二种不同的HER2抗体(例如生长抑制性HER2抗体诸如Trastuzumab或诱导HER2过表达细胞凋亡的HER2抗体诸如7C2、7F3或其人源化变体)；靶向另一种肿瘤相关抗原诸如EGFR、HER3、HER4的第二种抗体；抗激素化合物，例如抗雌激素化合物诸如他莫昔芬，或芳香酶抑制剂；心脏保护剂(以预防或减轻与治疗有关的任何心肌功能障碍)；细胞因子；EGFR靶向药物(诸如Erlitonib、Gefitinib、或Cetuximab)；抗血管生成剂(尤其是Genentech销售的Bevacizumab，商标为AVASTINTM)；酪氨酸激酶抑制剂；COX抑制剂(例如COX-1或COX-2抑制剂)；非类固醇抗炎药，Celecoxib法呢基转移酶抑制剂(例如可从JohnsonandJohnson购买的R115777或可从Schering-Plough购买的LonafamibSCH66336)；结合癌胚蛋白CA125的抗体，诸如Oregovomab(MoAbB43.13)；HER2疫苗(诸如Pharmexia的HER2AutoVac疫苗，或Dendreon的APC8024蛋白质疫苗，或GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；其它HER靶向疗法(如trastuzumab、cetuximab、gefitinib、erlotinib、CI1033、GW2016等)；Raf和/或ras抑制剂(参见例如WO2003/86467)；Doxil；托泊替康(Topetecan)；紫杉烷；GW572016；TLK286；EMD-7200；治疗恶心的药物，诸如血清素拮抗剂、类固醇或苯并二氮卓类(benzodiazepien)；预防或治疗皮疹的药物或标准痤疮疗法，包括局部或口服抗生素；降体温药物，诸如醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)或哌替啶(meperidine)；造血生长因子，等等。
任何上述共施用药剂的合适剂量就是那些目前所使用的剂量，并且可由 于该药剂与HER2抗体的联合作用(协同作用)而降低。联合HER2抗体组合 物和其它治疗剂的治疗可对患者产生协同的、或者大于累加的治疗效益。
如果施用化疗剂，通常以对此已知的剂量施用，或者任选由于所述药物 的联合作用或可归于施用化疗剂的不良副作用而降低。所述化疗剂的制备和 给药方案可依照制造商的说明书进行或由熟练从业人员根据经验确定。所述 化疗的制备和给药方案还可参阅《ChemotherapyService》，Ed.，M.C.Perry， Williams&Wilkins，Baltimore，MD(1992)。
除了上述治疗方案，还可对患者进行手术去除癌细胞和/或放疗。
VII.材料保藏
以下杂交瘤细胞系已保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanType CultureCollection，ATCC，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA 20110-2209，USA)：
抗体名称 ATCC编号 保藏日期 7C2 ATCC HB-12215 1996年10月17日 7F3 ATCC HB-12216 1996年10月17日 4D5 ATCC CRL 10463 1990年5月24日 2C4 ATCC HB-12697 1999年4月8日
下面的非限制性实施例例示了本发明的更多细节。说明书中所有引用文 献的内容均明确收入本文作为参考。
实施例1
此实施例描述一种包含结合HER2结构域II的主要种类HER2抗体 (Pertuzumab)及其酸性变体的组合物的表征。
Pertuzumab是在人IgG1(κ)框架基础上产生的重组人源化单克隆抗体。它包含两条重链(448个残基)和两条轻链(214个残基)。两条重链由两个链间二硫键连接，且各轻链通过一个链间二硫键附着于重链。在Pertuzumab的Fc区中在两条重链的Asn-299处有一个N-连接糖基化位点。Pertuzumab与(Trastuzumab)的不同在于轻链(12个氨基酸差异)和重链(30个氨基酸差异)的表位结合区。由于这些差异，Pertuzumab结合HER2受体上完全不同的表位。Pertuzumab与人上皮细胞上HER2受体的结合阻止了它与HER受体家族的其它成员形成复合物(Agusetal.，CancerCell2：127-137(2002))。通过阻断复合物的形成，Pertuzumab阻止了所述复合物的配体(例如EGF和heregulin)的生长刺激作用。体外实验证明了Pertuzumab和Pertuzumab-Fab都抑制heregulin(HRG)与MCF7细胞的结合，并且HRG刺激的HER2-HER3复合物的磷酸化作用可被Pertuzumab和Pertuzumab-Fab二者所抑制(Agusetal.，CancerCell2：127-137(2002))。此外，发现Pertuzumab和Pertuzumab的聚乙二醇衍生化Fab在体内对肿瘤生长的抑制作用在鼠前列腺癌异种移植模型中是相当的(Agusetal.，CancerCell2：127-137(2002))。这些资料表明所述抗体的Fc区不是抑制肿瘤生长所必需的，而且二价性和Fc介导的效应物功能也不是体内或体外生物学活性所必需的。
在此实施例中，自阳离子交换柱收集Pertuzumab的主峰，并在细胞培养 基中温育或使用标准抗体纯化操作来加工。在主峰与细胞培养基成分一起温 育时形成酸性变体。单克隆抗体的酸性变体是想要的产物的修饰形式，它们 在通过阳离子交换层析分开时比主峰早洗脱。在工艺变化之前和之后常常观 察到酸性变体的量和/或分布的微小差异，而且对证明产物可比性提出挑战。 纯化操作对酸性变体形成的影响较小。在酸性变体级分中鉴定出的变体包括 糖化变体、脱酰胺变体，二硫化物还原变体、唾液酰化变体、和不可还原变 体。总之，酸性变体是完全有效力的。
此项研究的目的是：更好地了解细胞培养和回收工艺对Pertuzumab酸性 变体形成的影响，表征Pertuzumab的主要酸性变体，及评估酸性变体对药动 学(PK)的影响，等。
大鼠药动学研究显示酸性变体级分和主峰级分的曲线下面积等同于 Pertuzumab起始材料(几何均值比分别为0.96和0.95)。这些结果证明虽然酸 性变体在化学上与主峰不同，但是它们具有等同的药动学。
方法和结果
图10描绘了阳离子交换MP(主峰)和AV(酸性变体)的分离、细胞培 养、回收、和PK(药动学)评估和分析测试的实验设计。新鲜的培养基＝标 准培养基；用过的培养基＝细胞培养12天后的标准培养基，通过离心来除 去细胞。不控制溶解氧、pH、和其它参数。
A.主峰和酸性变体的分离
在4.0x250mmDIONEXPROPACWCX-10J阳离子交换(CEX)柱上使 用下述条件将Pertuzumab的电荷变体分开：
缓冲液A：20mMBisTris，pH6.0
缓冲液B：20mMBisTris，200mMNaCl，pH6.0
梯度：0.5％B/min，以1.0mL/min运行
柱温度：35℃
检测：280nm
图11显示了一幅典型的层析图。收集了AV(酸性变体)和MP(主峰) 级分。
效力和单体含量在pertuzmab起始材料、主峰、和酸性变体间是相似的(图 12)。根据通过CEX测得的90％纯度标准，主峰和酸性变体CEX级分的纯度 是药动学研究可接受的(图12)。
B.主峰掺入实验
将通过CEX分离的Pertuzumab主峰掺入新鲜的或用过的细胞培养基(没 有细胞)，并于37℃温育12天，如图10所概述的。各个时间点的样品直接地 或在通过蛋白A分离后通过CEX来分析。还将主峰掺入培养基+/-各种培养 基成分，诸如葡萄糖和蛋白胨。另外，经由标准回收操作诸如蛋白A层析 (ProA)、低pH处理、和SPSepharoseFastFlow(SPFF)加工主峰数个循环并通 过CEX来分析。
在新鲜的或用过的培养基中温育12天的主峰的CEX图谱是相似的(图13 和图14)。主峰在新鲜的培养基中温育后比在用过的培养基中缩小得更多。 消除各种培养基成分不影响主峰的缩小。温育样品中的百分比主峰在有和没 有蛋白A分离的情况中是相同的。在单独的培养基缓冲液中温育引起主峰损 失。
自培养基蛋白A分离主峰不影响CEX图，证明了温育期间的更改不影响 蛋白A结合或洗脱。回收操作对百分比CEX主峰有较小的影响或没有影响。
C.酸性变体的表征
通过CEX自在细胞培养基中温育的主峰或Pertuzumab起始材料分离 Pertuzumab酸性变体。通过图15中列举的方法来分析分离的酸性变体。酸性 变体占总峰面积的21％，因此鉴定了约80％(21％中的17％)的酸性变体。 脱酰胺形式不能被定量。
在通过将主峰与培养基一起温育生成的酸性变体中鉴定的形式与在 Pertuzumab起始材料中鉴定的那些相同。检测到下述形式：唾液酰化变体、 二硫化物还原变体、糖化变体、不可还原变体、和脱酰胺变体。还原和PNGase 处理后通过电喷雾电离质谱术(ESI-MS)鉴定出高级糖化形式。
D.药动学(PK)研究
单剂静脉内(IV)10mg/kg，每组12只大鼠，3组(酸性变体、主峰、 Pertuzumab起始材料)。广泛的PK采样进行35天。酸性变体、主峰、和 Pertuzumab起始材料间AUC(第0-14天)的几何均值比。几何均值比＝GM 样品/GMIgG1起始材料。Pertuzumab起始材料、酸性变体、和主峰的 Pertuzumab浓度对时间曲线是相似的(图16和图17)。在酸性变体、主峰、和 Pertuzumab起始材料之间没有观察到暴露的显著差异。GMR为约1.0，90％CI 介于0.80至1.25之间。
结论
多项细胞培养因素有助于酸性变体形成，但是回收没有显示出影响酸性 变体形成。在酸性级分中鉴定出二硫化物还原变体、不可还原变体、唾液酰 化变体、糖化变体、和脱酰胺变体。自Pertuzumab起始材料分离的酸性级分 和通过温育CEX主峰生成的那些含有相同的形式。酸性变体、主峰、和 Pertuzumab起始材料具有相同的药动学。
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表格修正日期：2006年2月8日