以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的BIV指示细胞系.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101100675 B (45)授权公告日 2011.01.19 CN 101100675 B *CN101100675B* (21)申请号 200710057672.6 (22)申请日 2007.06.19 CGMCC No.2050 2007.05.16 C12N 15/65(2006.01) C12N 5/10(2006.01) (73)专利权人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路 94 号 (72)发明人 乔文涛 姚雪 陈启民 耿运琪 (74)专利代理机构 天津佳盟知识产权代理有限 公司 12002 代理人 侯力 刘国文等 . 萤火虫萤光素酶基因。

2、构建 BIV- LTR 启动子表达研究体系 .病毒学报 .1994, 第 10 卷 ( 第 4 期 ),377-380. 孔晓红等 .RU5 区对 BFV3026 基因表达的调 控 . 中国病毒学 .2004, 第 19 卷 ( 第 2 期 ), 摘 要和第 131 页第 2.3 节 . (54) 发明名称 以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的 BIV 指 示细胞系 (57) 摘要 一株指示牛免疫缺陷病毒 BIV 感染的细胞系 及其应用。该细胞系可以在 BIV 感染的特定条件 下表达增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)， 从而通过检 测该蛋白的表达来间接指示牛免疫缺陷病毒的感 染。该细胞系 ( 其保藏。

3、号为 CGMCC No.2050) 的 构建过程 ： 首先构建成一个可以应答牛免疫缺陷 病毒感染的具有序列表所示核苷酸序列的报告质 粒， 之后， 将该质粒转染 BHK-21 细胞， 筛选稳定表 达的细胞系并单克隆化 ； 挑选无本底表达但经过 BIV 病毒攻击后高表达 EGFP 的阳性克隆即为 BIV 的指示细胞系。本发明具有快速简便且可以实时 指示 BIV 感染和 BIV 反式激活因子激活作用的特 点。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 曹丙洲 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 CN 1011006。

4、75 B1/1 页 2 1. 以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的 BIV 指示细胞系， 其特征在于 ： 是一株能够指 示牛免疫缺陷病毒感染的细胞系， 其保藏号为 CGMCC No.2050。 权 利 要 求 书 CN 101100675 B1/5 页 3 以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的 BIV 指示细胞系 【技术领域】 0001 本发明涉及一种用于检测牛免疫缺陷病毒感染的细胞系， 以及该细胞系的建立方 法和它的具体应用。 【背景技术】 0002 牛免疫缺陷病毒 (Bovine immunodeficiency virus， BIV) 与人免疫缺陷病毒 (Humanimmunodeficienc。

5、y virus， HIV) 同属于反转录病毒科慢病毒属， 与 HIV 基因组高度 同源， 其遗传、 复制方式、 与宿主细胞的相互关系、 致病机理等与 HIV 极其类似， 用其作为一 种艾滋病研究模型， 用于探讨慢病毒基因表达调控、 慢病毒与其它病毒超感染后病毒间以 及病毒与宿主细胞间的相互作用， 具有很高的安全性。建立 BIV 指示细胞系是研究 BIV 的 分子生物学的有力工具。 0003 指示质粒稳定转染可以被病毒感染的细胞系， 该细胞系称为指示细胞系。该细胞 系的基因组含有被病毒反式激活因子的应答元件调控的报告基因， 病毒感染或病毒的反式 激活因子可以特异性启动病毒反式激活因子的应答元件下。

6、游的报告基因的表达， 通过检测 报告基因产物， 指示病毒的感染。传统的在细胞培养中病毒感染的识别方法主要有观察细 胞病变法。 细胞病变法测定的病毒滴度依赖实验者的肉眼观察， 主观性较大， 不同实验者可 能得出不同的结果。与传统的检测方法相比， 指示细胞系具有快速， 简便， 灵敏的特点。 【发明内容】 0004 本发明的目的是提供一株可以快速简便地检测牛免疫缺陷病毒或病毒反式激活 因子的指示细胞系以及该细胞系的应用。 0005 本发明提供的牛免疫缺陷病毒 (Bovine immunodeficiency virus， BIV) 感染的 指示细胞系， 已于 2007 年 5 月 16 日保藏于 “。

7、中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心” ( 北京市海淀区中关村北一条 13 号中国科学院微生物研究所 )， 其保藏号为 CGMCC No.2050。 0006 本发明提供的细胞系的制备方法如下 ： 0007 首先构建成一个可以应答牛免疫缺陷病毒感染的指示质粒， 其具体核苷酸序列如 序列表1所示， 即将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因插入到一种特异应答牛免疫缺陷病 毒反式激活因子的应答元件下游， 质粒含有 G418 抗性基因。所述的特异应答牛免疫缺陷病 毒反式激活因子的应答元件是 BIV LTR 中 U3 和 TAR 区， 不含有负调控区域 U5 区。 0008 将该质粒转染幼仓鼠肾。

8、细胞 (Baby Hamster Kidney cell， BHK-21)， 加入 G418 进 行筛选稳定表达的细胞系， 初筛三周后， 将抗性细胞进行单克隆化 ； 通过转染 BIV 反式激活 因子 24 小时后用荧光显微镜观测绿色荧光来分别鉴定每个单克隆特异响应 BIV 反式激活 因子的能力， 最终挑选无本底表达但经过 BIV 病毒攻击后 EGFP 表达量高的阳性克隆即为 BIV 的指示细胞系。 0009 本发明的检测牛免疫缺陷病毒或病毒反式激活因子的新方法是 ： BIV 感染或 说 明 书 CN 101100675 B2/5 页 4 BIV 反式激活因子 Tat 转染 BIV 指示细胞系，。

9、 BIV 指示细胞系的增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreen fluorescent protein， EGFP) 基因表达， 使细胞发出绿色荧光， 在荧光显 微镜下观察绿色荧光间接指示 BIV 的感染或 BIV Tat 的激活， 激活作用也可以用流式细胞 仪定量检测。 0010 该细胞系应用可示例于如下 ： 研究BIV Tat及JDV Tat的激活机制， 研究BIV原克 隆的感染性， 研究病毒的超感染， 检测 BIV 病毒在上清或冻融裂解液中的感染性， 鉴定某种 因子对 BIV 复制的抑制或促进作用， 鉴定某种因子对 BIV Tat 的抑制或促进作用。 0011 本发明的优点和积极。

10、效果 ： 0012 本发明细胞系具有以下优点 ： 以 EGFP 为报告基因， 无需外加底物或裂解细胞， 操 作简便易行 ； 可以通过荧光显微镜实时观察， 了解感染的动态过程 ； 可以通过流式细胞仪 定量检测 ； 在病毒感染或反式因子转染 12 小时后细胞即可观察到绿色荧光， 即使一两个绿 色荧光细胞也可以检测出来， 灵敏快速。 0013 本发明的应用价值在于 ： 0014 (1)BIV 分子生物学研究的有力工具。对 BIV 的深入了解， 有助于了解同属反转录 病毒的 HIV 的分子特性， 推动慢病毒的基础研究。 0015 (2) 应用于 JDV 的分子生物学的研究。JDV 是近年新发现的一种使。

11、牛急性发病的 反转录病毒， 但目前对其了解甚少。JDV 基因组与 BIV 有很高同源性。JDV Tat 同样能够激 活 BIV LTR， 应用指示细胞系可以指示 JDV Tat 的激活作用。 0016 (3)BIV 与 HIV 的分子生物学特性相近， 但 BIV 不感染人， 可以不用在 P3 实验室操 作。应用该指示细胞系和 BIV 病毒建立抗反转录病毒感染的药物筛选模型， 对有抗 AIDS 活 性的药物进行初筛， 从而降低研究的安全风险， 操作简便。 【具体实施方式】 0017 实施例 1 0018 以 EGFP 为报告基因的 BIV 指示细胞系的建立 0019 1. 构建指示质粒 0020。

12、 以 BIV 原克隆质粒 BIV127 为模板， PCR 反应扩增 BIV LTR 中 U3+TAR 区段， 不含有 负调控区 U5， 这一段启动子可以更好地响应 Tat 激活。将其连接到去除 CMV 启动子的真核 表达载体 pEGFP-N1 中， 构建成 BIV 指示质粒。pEGFP-N1 载体上含有 neo 基因， 可以使转染 该质粒的细胞具有 G418 抗性。该质粒中， U3+TAR 区在报告基因 EGFP 上游， 直接调控报告 基因的表达。BIV 反式激活因子 Tat 可以结合在 TAR 上， 从而起始下游报告基因的转录， 通 过观察 EGFP 蛋白的绿色荧光可以判断 BIV 感染水平。

13、。瞬时转染 BIV Tat 和指示质粒， 观察 绿色荧光， 鉴定指示质粒具有指示 BIV 感染的功能。 0021 2. 建立稳定整合指示质粒的指示细胞系 0022 将指示质粒转染BHK-21细胞， 转染后第二天， 在培养基中加入600g/ml的G418， 一星期后细胞开始大量死亡， 到第14天对照孔细胞全部死亡， 至20天， 细胞开始成簇生长， 此时生长的细胞即为细胞基因组中已经整合了质粒的阳性克隆 ； 经过初筛后， 有限稀释法 进行单克隆化进行单克隆操作， 将分离到的单克隆细胞株扩大培养， 转染BIV Tat进行指示 功能的鉴定， 筛选无本底表达但相应BIV Tat蛋白的激活发出较强绿色荧光。

14、的阳性克隆， 再 说 明 书 CN 101100675 B3/5 页 5 用 FBL-R29 共培养检测其对 BIV 病毒的响应。 0023 实施例 2 0024 应用 BIV 指示细胞系指示 BIV 病毒的感染 0025 将 BIV R29 感染的 FBL 与 BIV 指示细胞系以 1 1 的比例共培养， 使用荧光显微 镜观察绿色荧光， 感染 12 小时后即可看见微弱荧光， 荧光的强度随时间而增强， 发绿色荧 光的细胞和合胞体也逐渐增多， 在 24 小时后即可明显看到绿色荧光的细胞和合胞体。BIV 指示细胞系的指示功能长期有效， 长期培养感染 BIV 后的指示细胞系， 感染两周后仍可见 绿色。

15、荧光。 0026 实施例 3 0027 应用 BIV 指示细胞系指示反式激活因子的激活 0028 1. 指示 BIV Tat 的激活 0029 以 105接种量将 BIV 指示细胞系铺到 12 孔板的两个孔， 24 小时后以 PEI 为转染试 剂进行转染， BIV Tat 真核表达质粒和 pCDNA3.1 为负对照各 500ng， 12 小时后转染 BIV Tat 的孔即可观察到绿色荧光， 24 小时后绿色荧光明显可见， 而转染空载体的负对照孔无绿色 荧光。 0030 2. 指示 JDV Tat 的激活 0031 JDV 反式激活因子 JDV Tat 也能够激活 BIV LTR， 而且 JDV。

16、 Tat 对 BIV LTR 的激活 作用更加强烈。 0032 同上述方法， 转染 JDV Tat 的真核质粒， 以 pCDNA3.1 为负对照， 以 BIV Tat 为正对 照， JDV Tat 转染细胞系 24 小时后后绿色荧光明显可见， 且比 BIV Tat 转染后细胞发出更 强的绿色荧光， 而转染空载体的负对照孔无绿色荧光。 0033 研究 JDV Tat 的分子机理有助于了解 JDV 的致病机制， 解释为什么与 BIV 同是反 转录病毒中的慢病毒， JDV 引起牛的病变更加强烈。而 JDV 目前尚不能体外培养， BIV 指示 细胞系是研究 JDV Tat 的有力工具。 0034 实施。

17、例 4 0035 指示 BIV 原克隆的感染性 0036 在病毒的分子生物学研究中经常用到病毒的原克隆。BIV127 是 BIV 的原克隆质 粒。将 BIV127 转染指示细胞系， 每天在荧光显微镜下观察， 转染 3 天后个别细胞呈现绿色 荧光， 之后绿色荧光细胞逐渐增多， 开始出现绿色的合胞体。而负对照转染 pCDNA3.1(-) 则 不产生荧光。利用指示细胞系观察绿色荧光的方法检测原克隆的感染性， 比观察病变的方 法更灵敏快速， 观察病变的方法在 5 天后能够看到典型合胞体。 0037 实施例 5 0038 应用 BIV 指示细胞系研究病毒超感染 0039 病毒携带者伴随有其它病毒的交叉感。

18、染， 称为超感染 (superinfection)。HIV 与 其它病毒的超感染不但能激活处于潜伏态的 HIV 病毒， 使已表现 AIDS 症状的个体症状加 剧， 而且可能使处于潜伏期的携带者突发成为 AIDS 患者 ； 同时 HIV 又可以相同的效应反作 用于超感染的病毒， 比如加剧超感染病毒的症状等， 这使得病毒病的治疗更加扑朔迷离， 困 难重重。 0040 以 BIV 为模型研究其它病毒与 BIV 的超感染是研究超感染的良好模型。 说 明 书 CN 101100675 B4/5 页 6 0041 已知牛泡沫病毒 BFV 能够激活 BIV LTR， 在病毒的超感染中起到重要作用。应用 BI。

19、V 指示细胞系验证 BFV 能够激活 BIV LTR。将牛泡沫病毒原克隆质粒 pCMV-BFV 转染 BIV 指示细胞系， 每天在荧光显微镜下观察， 转染 3 天后个别细胞呈现绿色荧光， 之后绿色荧光 细胞逐渐增多， 而负对照转染 pCDNA3.1(-) 则不产生荧光。 0042 这种较微弱的超感染作用只有以 EGFP 为报告基因， 才能在细胞水平显示出来， 并 且实时观察。 0043 实施例 6 0044 利用 BIV 指示细胞系鉴定 BIV 上清感染性 0045 某些情况下， 需要得到无细胞病毒储液 (cell free virus stock)， 排除因共培养 加入的已经感染病毒的细胞的。

20、影响。而 BIV 的无细胞储液的获得一直是个难题， 研究 BIV 病毒的方法都是将病毒感染的细胞与待测细胞共培养。利用 BIV 指示细胞系可以实时观察 上清的感染性。 0046 收集 BIV 感染 FBL 后的培养基上清， 2800rpm 离心 3 分钟， 取上清， 经过 0.45um 滤 膜过滤， 去除细胞或细胞碎片， 制得 BIV 上清。 0047 将上清加入BIVE指示细胞系， 每天观察绿色荧光， 经过7天后细胞发出绿色荧光， 说明上清具有感染性。 0048 通过超速离心或蔗糖密度梯度离心从上清中制备高浓度的病毒颗粒， 加入 BIV 指 示细胞系检测， 观察绿色荧光， 看能否富集上清中有。

21、感染性的病毒颗粒。 0049 实施例 7 0050 指示细胞系与 CPE 方法的比较 0051 传统的病毒测定是基于细胞病变， 其中一种经典的方法就是 TCID50(Tissue CultureInfectious Dose 50 )， 即 50组织细胞感染量的测定。在免疫缺陷病毒滴度的 测定中， 这种方法被广泛应用， 直到指示细胞系的出现。 0052 BIV R29 与 FBL 共培养， 待细胞出现典型的核胞体后， 将细胞用 0.25胰酶消化， 分成等份。 将FBL(P10)和指示细胞系分别按1104细胞铺96孔板， 按照110的稀释倍 比接入 BIV R29 感染的 FBL。从第二天开始每。

22、天观测细胞病变 (FBL) 和绿色荧光蛋白的表 达情况， 一直记录到病毒维持最高滴度。指示细胞系检测到的最大滴度出现在感染后 4 天， 而基于细胞病变的检测到的最大滴度出现在感染后 6-7 天。此外， 指示细胞系检测到的病 毒滴度要比病变检测到的病毒滴度高 2 个数量级， 即前者是后者的 100 倍。由此可见， BIV 指示细胞系方法比 CPE 的方法更灵敏。 0053 序列表 0054 南开大学 0055 以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的 BIV 指示细胞系 0056 1 0057 1 0058 488 0059 DNA 0060 牛免疫缺陷病毒 (Bovine Immunodeficien。

23、cy Virus， BIV) 0061 1 说 明 书 CN 101100675 B5/5 页 7 0062 cgagctctta cgcgtgctag cccgtagcta gccttaaaag ggtggactgt 50 0063 ggggcagggt gggacctcag gacaacagca gcccccggac ttcccatatg 100 0064 tgaattggac tggatccagg gaacaaaata acccagaagg gggattagac 150 0065 tctggggctt ggtatgaagg cctgagaggt tctcagtaga ttgtaagtct。

24、 200 0066 tcggcgagac tgcatgtctg cacgtagaca ggaaatgttt atcttctcag 250 0067 ctgattgtgg ttaggccgat tactggaaac tagacaacct gattcattag 300 0068 tggttaagat tatgcataag tgctcgcaat gatgtagctg cttacgcttg 350 0069 cttactccgc cctgaaacgc ctaccttaac acgcaacacg cccacctgta 400 0070 agaatatata aaccatatct tcactctgta cttcagctcg tgtagctcat 450 0071 tagctccgag ctccccaacc tacagcctga gaggcaca 488 说 明 书 。