《一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法.pdf（11页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610129514.6 (22)申请日 2016.03.08 C07D 311/62(2006.01) (71)申请人 浙江省计量科学研究院 地址 310018 浙江省杭州市下沙路 300 号 (72)发明人 王智聪 沙跃兵 余笑波 陈怡 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 33100 代理人 王佳健 (54) 发明名称 一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯 CG 的方 法 (57) 摘要 本发明涉及一种制备高纯度儿茶素没食子酸 酯 CG 的方法。本发明首先取绿茶茶多酚样品， 加溶剂溶解 ； 再取茶多酚溶解样品适量于密。
2、闭容 器， 高温转化 ； 然后取转化液， 采用快速制备液相 色谱进行分离， 收集儿茶素没食子酸酯 CG 馏分 ； 馏分通过旋转蒸发浓缩制得儿茶素没食子酸酯 CG 单体化合物粗品 ； 最后取粗品适量， 加溶剂溶 解 ； 利用高压制备液相色谱分离纯化上述单体化 合物粗品， 收集儿茶素没食子酸酯 CG 馏分 ； 馏分 通过旋转蒸发浓缩、 冷冻干燥和真空干燥后制得 儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物。 本发明采 用高温转化的方法， 提高了绿茶茶多酚溶液中儿 茶素没食子酸酯 CG 的含量。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附。
3、图3页 CN 105646429 A 2016.06.08 CN 105646429 A 1.一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法， 其特征在于包括如下步骤： 步骤 （1） ： 取一定量的绿茶茶多酚样品， 加适量溶剂溶解； 步骤 （2） ： 取步骤 （1） 制备的茶多酚溶解样品适量于密闭容器， 高温转化一定时间； 步骤 （3） ： 取步骤 （2） 制备的转化液， 采用快速制备液相色谱进行分离， 收集儿茶素没食 子酸酯CG馏分； 多次进样， 收集且合并相同组分的馏分； 馏分通过旋转蒸发浓缩并除去甲 醇， 浓缩液再经冷冻干燥， 制得儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品； 步骤 （4） ： 取步骤。
4、 （3） 制得的儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品适量， 加一定溶剂溶 解； 利用高压制备液相色谱分离纯化上述单体化合物粗品， 收集儿茶素没食子酸酯CG馏分； 多次进样， 收集且合并相同组分的馏分； 馏分通过旋转蒸发浓缩并除去甲醇， 浓缩液再进行 冷冻干燥和真空干燥， 制得儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物。 2.根据权利要求1所述的一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法， 其特征在于： 步 骤 （1） 中， 绿茶茶多酚样品选择总儿茶素含量大于98%及咖啡因含量小于0.1%的产品。 3.根据权利要求1所述的一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法， 其特征在于： 步 骤 （1） 中， 所述溶。
5、剂为超纯水、 甲醇、 乙腈、 乙醇及其混合溶液， 茶多酚样品的浓度为100 1000mg/mL。 4.根据权利要求1所述的一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法， 其特征在于： 步 骤 （2） 中， 高温转化温度可选100150C， 高温转化时间可选10300min。 5.根据权利要求1所述的一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法， 其特征在于： 步 骤 （3） 中， 快速制备液相色谱的色谱填料选用硅胶键合C18、 C8、 C4； 填料粒径选择5100 m； 快速制备液相色谱分离中， 流动相体系采用水、 甲醇、 乙腈、 乙醇等， 或其它们之间适当 比例的混合液； 流动相中添加的调节剂包括甲。
6、酸、 乙酸、 磷酸； 快速制备液相色谱收集儿茶素没食子酸酯CG馏分旋转蒸发浓缩的温度选择4080C。 6.根据权利要求5所述的一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法， 其特征在于： 快 速制备液相色谱分离中， 采用如下分离条件： 流动相A： 甲醇， 流动相B： 体积比为0.1%的乙酸 水溶液； 流速： 50mL/min， 梯度洗脱： 15%A对应于0min20%A对应于5min25%A对应 于10min30%A对应于25min35%A对应于30min50%A对应于40min； 上样量： 3mL； 检测波长： 278nm。 7.根据权利要求1所述的一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法， 其。
7、特征在于： 步 骤 （4） 中， 溶剂采用超纯水、 甲醇、 乙腈、 乙醇或其混合溶液进行溶解， 对儿茶素没食子酸酯 CG单体化合物粗品， 配制11000mg/mL的浓度； 高压制备液相色谱柱的色谱填料， 采用硅胶键合C18填料， 填料粒径为10 m， 色谱柱尺 寸为21.5*250mm； 高压制备液相色收集儿茶素没食子酸酯CG馏分旋转蒸发浓缩的温度可选择4080C。 8.根据权利要求7所述的一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法， 其特征在于： 高 压制备液相色谱分离中， 采用如下分离条件： 流动相A： 甲醇； 流动相B： 体积比为0.1%的乙酸 水溶液； 等度洗脱： 30%A； 流速： 2。
8、5mL/min； 上样量： 2mL； 检测波长： 278nm。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105646429 A 2 一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种制备高纯度儿茶素没食子酸酯CG的方法， 尤其涉及表型儿茶素异 构体化合物的高温转化及其单体化合物的制备、 分离和纯化的方法。 背景技术 0002 茶叶中的儿茶素主要为表型儿茶素， 即表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、 表没食 子儿茶素EGC、 表儿茶素没食子酸酯ECG、 表儿茶素EC， 它们约占儿茶素总量的6080%。 其中 EGCG是绿茶茶多酚中含量最高的物质， 也是目前公认的茶叶中最主要的抗。
9、氧化成分。 然而 现有研究已经证实， 表型儿茶素的异构体如儿茶素没食子酸酯CG等 （其化学结构如附图1所 示） 在某些方面表现出较强的生理活性， 如抗氧化和清除自由基活性等。 0003 儿茶素单体化合物主要是从茶叶或茶叶提取物中进行提取， 常用的分离纯化方法 有液液萃取、 柱层析、 中低压柱色谱、 高压制备液相色谱和高速逆流色谱分离等。 儿茶素的 分离纯化不乏其他方法， 也常常采用两种或多种方法联合使用。 文献及专利中常见表没食 子儿茶素没食子酸酯EGCG、 表儿茶素没食子酸酯ECG等的分离纯化报道， 但制备儿茶素没食 子酸酯CG单体化合物的方法较少。 公开专利CN102120738A 一种非。
10、表型儿茶素单体的制 备方法 ， 以儿茶素单体化合物为原料， 经高温加压热转化和凝胶介质分离等过程制备非表 型儿茶素。 如以表儿茶素没食子酸酯ECG为原料， 制得了纯度98.6%的儿茶素没食子酸酯CG 单体化合物， 但该方法原料成本高； 同时， 在转化过程中加入钠盐或钾盐的碱金属， 引入了 无机盐等杂质， 且采用凝胶分离纯化的方法， 所制备的单体化合物纯度较低。 0004 鉴于儿茶素没食子酸酯CG良好的营养保健和生理药理作用， 在茶叶及茶叶相关制 品的质量控制、 生产工艺的优化及其基础功效学的研究过程中， 需要高纯度的儿茶素没食 子酸酯CG单体化合物。 发明内容 0005 本发明的目的是制备儿茶。
11、素没食子酸酯CG纯度大于99%的高纯单体化合物。 本发 明研制的高纯度儿茶素没食子酸酯CG单体化合物， 可用于茶叶及其制品中相关物质含量监 测的质量控制， 相关物质基础营养、 保健、 生理、 药理学功效的研究， 以及相关物质对照品和 标准物质的研制等领域。 0006 本发明是通过如下技术方案实现的， 其制备流程如附图2所示。 0007 步骤1.茶多酚溶液的配制 步骤1-1.茶多酚样品的筛查 绿茶茶多酚中儿茶素的含量较高， 优选绿茶茶多酚。 市售绿茶茶多酚中儿茶素 （总量） 的含量有20%、 40%、 60%、 80%、 90%、 95%、 98%等诸多品种， 优选儿茶素 （总量） 含量较高的品。
12、种。 市售绿茶茶多酚中咖啡因的含量为0%50%不等， 优选咖啡因含量较低的品种。 0008 步骤1-2.料液的配制 称取步骤1-1优选的一定量的绿茶茶多酚样品， 加适量溶剂， 搅拌超声溶解， 配制一定 说明书 1/6 页 3 CN 105646429 A 3 浓度的料液。 溶剂可选择超纯水、 甲醇、 乙腈、 乙醇等或其混合溶液， 优选超纯水作为溶剂； 料液浓度可以配制1001000mg/mL， 优选300mg/mL。 0009 步骤2.料液的高温转化 取适量配制的料液， 于适当温度转化一定时间。 转化温度可选100150C， 优选130C。 转化时间可选10300min， 优选120min。 。
13、0010 步骤3.转化液的快速制备液相色谱分离 步骤3-1.快速制备液相色谱分离 快速制备液相色谱可以选择多种类型的色谱填料， 如C18、 C8、 C4等， 优选C18填料。 填料 粒径可以选择5100 m， 优选2040 m的填料。 快速色谱柱的尺寸规格以及填料装填质量 可以选择多种， 本发明使用装填质量为120g的填料。 0011 快速制备液相色谱分离中， 可以选择多种流动相体系， 如水、 甲醇、 乙腈、 乙醇等， 或其适当比例的混合液， 本发明中采用甲醇-水体系。 流动相中可以添加不同种类及不同含 量的调节剂， 如甲酸、 乙酸、 磷酸等， 或其相应的缓冲盐体系， 本发明采用水相中添加0.。
14、1% （体积比） 的乙酸。 0012 快速制备液相色谱分离中， 可以优化多种分离条件， 如上样量、 流速、 等度或梯度 洗脱方式等。 本发明采用粒径为2040 m， 填料质量120g的快速制备液相色谱柱， 优化的 快速制备液相色谱分离条件如下： 流动相A： 甲醇， 流动相B： 含0.1% （体积比） 乙酸的水溶液； 流速： 50mL/min； 梯度洗脱： 15%A(0min)20%A(5min)25%A(10min)30%A (25min)35%A(30min)50%A(40min)； 上样量： 3mL； 检测波长： 278nm。 0013 取适量步骤2制备的转化液， 用0.22 m微孔滤膜过。
15、滤， 在步骤3-1优选的快速制备 液相色谱分离条件下， 收集33.234.7min的儿茶素没食子酸酯CG馏分。 多次进样， 收集合 并儿茶素没食子酸酯CG馏分。 0014 步骤3-2.快速制备液相色谱收集儿茶素没食子酸酯CG馏分纯度的检测 采用高效液相色谱法检测快速制备液相色谱收集儿茶素没食子酸酯CG馏分的纯度， 结 果显示纯度大于95%。 0015 所使用的高效液相色谱分析方法如下： 色谱柱： C18， 5 m,4.6*250mm； 色谱柱温 度： 35C； 流动相A： 甲醇； 流动相B： 含0.1% （体积比） 乙酸的水溶液； 等度洗脱： 30%A； 流速： 1 mL/min； 检测波长：。
16、 278nm； 进样量： 10 L。 0016 步骤3-3.对步骤3-1快速制备液相色谱收集的儿茶素没食子酸酯CG馏分， 采用旋 转蒸发的方法去除甲醇， 浓缩液再经过冷冻干燥， 制得儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗 品。 0017 步骤4.儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品的高压制备液相色谱分离 步骤4-1.高压制备液相色谱上样液的配制 称取一定量步骤3-3制备的儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品， 加适量溶剂溶解， 配 制一定浓度的溶液。 本发明中， 浓度为40mg/mL， 溶剂为30% （体积比） 甲醇水溶液。 0018 步骤4-2.高压制备液相色谱分离 高压制备液相色谱分离中， 可选择不。
17、同种类和不同粒径的色谱填料， 以及不同尺寸规 格和填料质量的色谱柱。 本发明中， 在优选条件下， 采用C18填料， 填料粒径为10 m， 色谱柱 尺寸为21.5*250mm。 说明书 2/6 页 4 CN 105646429 A 4 0019 对优选的高压制备液相色谱柱， 可以优化多种分离条件， 如上样量、 流速、 等度或 梯度洗脱方式等。 本发明中优化的高压制备液相色谱分离条件如下： 流动相A： 甲醇； 流动相 B： 含0.1% （体积比） 乙酸的水溶液； 等度洗脱： 30%A； 流速： 25mL/min； 上样量： 2mL； 检测波 长： 278nm。 0020 在优化的高压制备液相色谱分。
18、离条件下， 收集儿茶素没食子酸酯CG馏分。 多次进 样， 收集并合并儿茶素没食子酸酯CG馏分。 0021 步骤4-3.高压制备液相色谱收集儿茶素没食子酸酯CG馏分纯度的检测 对高压制备液相色谱收集的儿茶素没食子酸酯CG馏分， 进行高效液相色谱分析， 分析 方法如步骤3-2， 结果显示儿茶素没食子酸酯CG的含量大于99%。 0022 步骤4-4.高压制备液相色谱收集儿茶素没食子酸酯CG馏分的浓缩干燥 对步骤4-2高压制备液相色谱收集的儿茶素没食子酸酯CG馏分， 通过旋转蒸发、 冷冻干 燥和真空干燥， 制得儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物。 0023 步骤4-5.儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合。
19、物纯度的检验 分别称取一定量步骤4-4制备的儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物， 加适量50% （体 积比） 甲醇溶液溶解， 配制浓度为0.5mg/mL的溶液， 进行高效液相色谱分析检测， 分析方法 如步骤3-2所示。 采用面积归一化法计算相应主成分的含量， 结果显示儿茶素没食子酸酯CG 的HPLC纯度大于99%。 0024 本发明以绿茶茶多酚为原料， 经过高温转化、 快速制备液相色谱和高压制备液相 色谱分离纯化， 制备了高纯度儿茶素没食子酸酯CG单体化合物， 本发明具有如下有益效果： 本发明所用原料市场供应充足， 绿茶茶多酚中儿茶素含量较高， 适于作为原料制备本 发明所述的儿茶素没食子酸酯C。
20、G高纯单体化合物。 0025 本发明采用高温转化的方法， 提高了绿茶茶多酚溶液中儿茶素没食子酸酯CG的含 量。 0026 本发明采用快速制备液相色谱的方法进行料液的初步分离， 茶多酚转化液中组成 成分复杂， 含有大量的表型儿茶素及其他化合物， 快速制备液相色谱采用C18填料， 分离效 率较高， 采用粒径2040 m的填料， 上样量大， 制备效率高。 0027 本发明采用高压制备液相色谱的方法， 产物的杂质含量少， HPLC纯度高。 0028 本发明制备的产物含量高， HPLC纯度大于99%， 无机金属、 水分及挥发性等杂质含 量低。 0029 本发明可同时制备儿茶素C、 表儿茶素EC、 表没食。
21、子儿茶素EGC、 表儿茶素没食子酸 酯ECG、 表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG、 没食子儿茶素没食子酸酯GCG和没食子儿茶素GC 等高纯单体化合物。 0030 本发明技术路线简单， 采用快速制备液相色谱结合高压制备液相色谱分离纯化， 单次分离时间短， 方法优化过程便捷。 0031 本发明易于放大， 高温转化、 快速制备液相色谱及高压制备液相色谱分离等过程 单元均可进行克级至公斤级的制备。 0032 本发明绿色环保， 避免了传统提取、 萃取分离中使用乙酸乙酯、 二氯甲烷、 正己烷 等有机溶剂； 本发明制备分离中使用的甲醇在旋转蒸发过程中可以回收； 本发明未引入无 机盐、 重金属等杂质。 说明书。
22、 3/6 页 5 CN 105646429 A 5 附图说明 0033 图1为儿茶素没食子酸酯CG的化学结构。 0034 图2为儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物的制备技术流程。 0035 图3为快速制备液相色谱分离绿茶茶多酚高温转化液的色谱图。 0036 图4为高压制备液相色谱分离儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品的色谱图。 0037 图5为儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物高效液相色谱法纯度检测的色谱图， HPLC纯度为99.80%。 具体实施方式 0038 以下结合附图对本发明作进一步说明。 0039 如图2所示， 茶叶及其制品中儿茶素没食子酸酯CG的含量较低， 本发明中采用绿茶 茶多酚。
23、为原料， 料液经高温转化， 茶多酚中表儿茶素没食子酸酯ECG部分地转化为相应的异 构体儿茶素没食子酸酯CG， 提高了料液中儿茶素没食子酸酯CG的含量。 在儿茶素单体化合 物的制备分离中， 需要考虑分离纯化效率、 成本以及是否环境友好等。 传统的方法如液液萃 取技术虽然操作简单， 但提纯效率差， 有时还需要使用有毒溶剂等； 硅胶柱层析等方法， 虽 然上样量较大， 但也存在分离提纯效率低， 制备的单体化合物纯度较低； 高速逆流色谱可以 得到较高纯度的化合物， 但制备量低。 而柱色谱分离的方法选择空间较大， 根据不同的分离 纯化目的， 可以选择不同类型及规格的填料， 如硅胶以及键合不同的官能团等， 。
24、不同粒径如 1.7100m等， 不同柱尺寸规格如2.150mm甚至更大的内径， 色谱柱长度也可根据需要进 行调整， 如301000mm甚至更长。 因此， 使用一定的填料及色谱柱规格， 即可进行低压、 中压 和高压制备液相色谱分离。 中低压柱色谱如快速制备液相色谱分离效率稍差， 但其上样量 大， 高压制备液相色谱分离效率高， 但上样量稍低； 结合中低压快速制备液相色谱及高压制 备液相色谱即可实现大量粗品化合物的分离及高纯单体化合物的精制等。 0040 实施例1 称取30g绿茶茶多酚 （总儿茶素含量98%， 咖啡因含量98%， 咖啡因含量98%， 咖啡因含量0.05%） 样品， 加1000mL超纯。
25、水 搅拌超声溶解， 置于密闭容器于150C烘箱高温转化10min。 取适量高温转化液， 用0.22 m 微孔滤膜过滤， 进行快速制备液相色谱分离。 快速制备液相色谱柱为C18型填料， 填料质量 为120g， 粒径为2040 m。 分离条件为： 流动相A： 甲醇， 流动相B： 含0.1% （体积比） 乙酸的水 溶液； 流速： 50mL/min； 梯度洗脱： 15%A(0min)20%A(5min)25%A(10min) 30%A(25min)35%A(30min)50%A(40min)； 上样量： 3mL； 检测波长： 278nm。 收 集33.234.7min的儿茶素没食子酸酯CG馏分， 采用。
26、高效液相色谱法检测馏分纯度， 为 96.27%。 多次进样， 收集合并儿茶素没食子酸酯CG馏分， 于60C旋转蒸发除去甲醇并回收， 浓缩液再经过冷冻干燥， 制得儿茶素没食子酸酯CG单体化合物粗品。 称取适量儿茶素没食 子酸酯CG单体化合物粗品， 用30% （体积比） 甲醇水溶液稀释， 配制浓度为40mg/mL的溶液， 进行高压制备液相色谱分离。 高压制备液相色谱分离条件为： 色谱柱： C18， 10 m， 21.5*250 mm； 流动相A： 甲醇； 流动相B： 含0.1% （体积比） 乙酸的水溶液； 等度洗脱： 30%A； 流速： 25mL/ min； 上样量： 2mL； 检测波长： 278。
27、nm。 多次进样， 收集并合并儿茶素没食子酸酯CG馏分， 采 用高效液相色谱法检测馏分纯度， 为99.93%。 儿茶素没食子酸酯CG馏分于60C旋转蒸发除 去甲醇并回收， 浓缩液再经过冷冻干燥和真空干燥， 制得儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化 合物。 对上述制备的儿茶素没食子酸酯CG高纯单体化合物， 再次进行高效液相色谱纯度检 说明书 5/6 页 7 CN 105646429 A 7 测， 为99.93%。 说明书 6/6 页 8 CN 105646429 A 8 图1 图2 说明书附图 1/3 页 9 CN 105646429 A 9 图3 图4 说明书附图 2/3 页 10 CN 105646429 A 10 图5 说明书附图 3/3 页 11 CN 105646429 A 11 。