本发明是申请日为2007年10月16日，申请号为201210305207.0，名 称为“用于表达MPHOSPH1或DEPDC1多肽的癌症的肽疫苗”的发明专利 申请的分案申请。
技术领域
本申请要求2006年10月17日提交的美国临时申请号60/852,575的权 益，将其全部内容通过提述并入本文。
本发明涉及生物科学领域，更具体地说，涉及癌症治疗领域。特别是， 本发明涉及可充当及其有效的癌症疫苗的新肽，还涉及用于治疗和预防的肿 瘤的含此类肽的药物。
背景技术
已经证明了CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别呈递在I类MHC分子 上的、源自肿瘤相关抗原(TAA)的表位肽，并且使肿瘤细胞溶解。自从作为 首个TAA实例的MAGE家族的发现以来，已经使用免疫学方法发现了许多 其它TAA(BoonT.(1993)IntJCancer54:177-80.；BoonT.等,(1996)JExp Med183:725-9.；vanderBruggenP等,(1991)Science254:1643-7.；BrichardV 等,(1993)JExpMed178:489-95.；KawakamiY等,(1994)JExpMed180: 347-52.)。它们中的一些目前正在临床开发中被当作免疫治疗的靶标。迄今 为止发现的TAA包括MAGE(vanderBruggenP等,(1991)Science254: 1643-7.)、gp100(KawakamiY等,(1994)JExpMed180:347-52.)、SART (ShichijoS等,(1998)JExpMed187:277-88.)、和NY-ESO-1(ChenY.T.等, (1997)Proc.Natl.Acd.Sci.USA,94:1914-8.)。另一方面，已经证明，某些已 显示在肿瘤细胞中以某种程度特异性地过表达的基因产物被识别为诱导细 胞免疫应答的靶标。这些基因产物包括p53(UmanoY等,(2001)BrJCancer, 84:1052-7.)、HER2/neu(TanakaH等,(2001)BrJCancer,84:94-9.)、CEA (NukayaI等,(1999)Int.J.Cancer80,92-7.)等等。
尽管关于TAA的基础和临床研究取得了显著进展(RosenbergSA等, (1998)NatureMed,4:321-7.；MukherjiB.等,(1995)ProcNatlAcadSciUSA, 92:8078-82.；HuX等,(1996)CancerRes,56:2479-83.)，然而目前可用的适 合于癌症治疗的候选TAA数非常有限。在癌细胞中大量表达并且其表达限 定于癌细胞的TAA将有望成为免疫治疗靶标的候选。
HLA-A24和HLA-A0201均是日本人和白人的群体中普通的HLA等位 基因(DateY等,(1996)TissueAntigens47:93-101.；KondoA等,(1995)J Immunol155:4307-12.；KuboRT等,(1994)JImmunol152:3913-24.；Imanishi 等,ProceedingoftheeleventhInternationalHistocompatibilityWorkshopand ConferenceOxfordUniversityPress,Oxford,1065(1992)；WilliamsF等,(1997) TissueAntigen49:129-33.)。因此，由这些HLA等位基因呈递的癌症的抗原 肽可能在日本人和白人患者的癌症治疗中有特定效用。另外，已知曝露于高 浓度的肽通常可导致低亲和力CTL的体外诱导，在抗原呈递细胞(APC)上生 成高水平的特异性肽/MHC复合物，这些复合物能够有效活化所述CTL (Alexander-Miller等,(1996)ProcNatlAcadSciUSA93:4102-7.)。
近来由于cDNA微阵列技术的发展，构建与正常细胞比较的恶性细胞的 基因表达综合谱已经成为了可能(Okabe,H.等,(2001)CancerRes.,61, 2129-37.；LinYM.等,(2002)Oncogene,21；4120-8.；HasegawaS.等,(2002) CancerRes62:7012-7.)。这种手段使人们能够了解癌细胞的复杂性质和癌发 生的机制，并能更容易地鉴定出肿瘤中表达失调的基因(BienzM.等,(2000) Cell103,311-20.)。在已被鉴定为在癌症中上调的转录物中，MPHOSPH1(M 期磷蛋白1(M-phasephosphoprotein1)；GenBank登录号NM_016195；SEQID Nos.1,2)和DEPDC1(含DEP结构域的蛋白1(DEPdomaincontaining1)； GenBank登录号BM683578)是新近发现的。参见WO2004/031413、WO 2006/085684和WO2007/013,665，将它们的全部内容通过提述并入本文。人 们已经描述了DEPDC1的两种不同转录变体，即DEPDC1V1(SEQIDNo.3, 4)和DEPDC1V2(SEQIDNo:5,6)。已经证明了这些基因在所分析病例的不 同癌组织的肿瘤细胞中特异性地上调(见下文)；然而，Northern印迹分析证 明这些基因产物不存在于正常生命器官中(参见PCT/JP2006/302684)。由于源 自MPHOSPH1和DEPDC1的免疫原性肽可能可以用来杀伤表达这些抗原的 肿瘤细胞，所以发明人对这些基因特别有兴趣。
由于细胞毒性药物诸如M-VAC经常引起严重副作用，所以显然基于充 分了解的作用机制精心选择新的靶分子对于开发将不良副作用风险最小化 的有效抗癌药物是重要的。为了这个目的，发明人先前对多种癌症和正常人 组织进行了表达谱分析，并且发现了在癌症中特异性过表达的多种基因(Lin YM,等,Oncogene.2002Jun13；21:4120-8.；KitaharaO,等,CancerRes.2001 May1；61:3544-9.；SuzukiC,等,CancerRes.2003Nov1；63:7038-41.；AshidaS, CancerRes.2004Sep1；64:5963-72.；OchiK,等,IntJOncol.2004 Mar；24(3):647-55.；KanetaY,等,IntJOncol.2003Sep；23:681-91.；ObamaK, Hepatology.2005Jun；41:1339-48.；KatoT,等,CancerRes.2005Jul 1；65:5638-46.；KitaharaO,等,Neoplasia.2002Jul-Aug；4:295-303.； Saito-HisaminatoA等,DNARes2002,9:35-45.)。其中，MPHOSPH1(内部编 号C2093)和DEPDC1(内部编号B5860N)是经鉴定在多种癌症中过表达的基 因。特别地，MPHOSPH1被鉴定为在膀胱癌(bladdercancer)、乳腺癌(breast cancer)、宫颈癌(cervicalcancer)、胆管细胞癌(cholangincellularcarcinoma)、 CML、结肠直肠癌(colorectalcancer)、胃癌(gastriccancer)、NSCLC、淋巴瘤 (lymphoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、前列腺癌(prostatecancer)、肾癌(renal carcinoma)、软组织肿瘤(softtissuetumor)中过表达。类似地，DEPDC1被鉴 定为在膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、NSCLC、淋巴瘤、 骨肉瘤、前列腺癌、SCLC、软组织肿瘤中过表达。
MPHOSPH1早先被鉴定为在G2/M过渡时被特异性磷酸化的蛋白质之 一，并且被表征为正端导向的驱动蛋白相关蛋白(plus-end-directedkinesin relatedprotein)(AbazaA等,JBiolChem2003,278:27844-52.)。更具体地说， 先前已经有文献记载MPHOSPH1是一种正端导向的分子马达 (plus-end-directedmolecularmotor)，它在胞质分裂中扮演重要角色，并且在 HeLa细胞中在分裂后期至分裂末期的过程中在纺锤体的中间区积累(Abaza A等,JBiolChem2003,278:27844-52；KamimotoT等,JBiolChem2001,276: 37520-8)。MPHOSPH1cDNA编码一种1780个氨基酸的蛋白质，该蛋白质 由三个结构域构成：NH2-驱动蛋白马达结构域(NH2-kinasinmotordomain)、 中心卷曲螺旋-茎结构域(centralcoiledcoil-stalkdomain)、和C-球形尾部结构 域(C-globulartaildomain)。同时，这些数据提示MPHOSPH1是NH2型驱动 蛋白相关蛋白。
关于DEPDC1，尚不清楚它的功能。这种蛋白质中包含的DEP结构域 同样存在于Dishevelled、Egl-10和Pleckstrin中。果蝇(Drosophila)Dishevelled 中的DEP结构域在拯救平面极性缺陷(planarpolaritydefect)和诱导JNK信号 传导中扮演重要角色；然而，它在人类中的功能尚不清楚。但是，如 PCT/JP2006/302684所披露的，DEPDC1siRNA能够抑制癌细胞的生长。这 些结果证明DEPDC1在大多数癌细胞的生长中发挥重要作用。
发明内容
如上所述，已经确定MPHOSPH1(M期磷蛋白1)和DEPDC1(含DEP 结构域的蛋白1)在多种癌症中上调。更具体地，利用以全基因组cDNA微阵 列进行的基因表达谱分析(geneexpressionprofiling)鉴定了这些基因。如上文 所讨论的，已经证明了MPHOSPH1和DEPDC1的表达在多种肿瘤细胞中特 异性地上调，包括肺癌和膀胱癌。如表1中所述，证明了MPHOSPH1的表 达在31例膀胱癌的30例中，36例乳腺癌的8例中，全部18例宫颈癌中， 17例胆管细胞癌的5例中，31例CML的25例中，11例结肠直肠癌的6例 中，14例胃癌的6例中，全部5例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，10例骨 肉瘤的6例中，22例前列腺癌的7例中，18例肾癌的10例中和21例软组 织肿瘤的15例中有效升高(validlyelevated)。同时，如表1中所述，证明了 DEPDC1的表达在25例膀胱癌的23例中，在13例乳腺癌的6例中，全部 12例宫颈癌中，全部6例胆管细胞癌中，4例CML的3例中，4例结肠直 肠癌的2例中，全部6例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，14例骨肉瘤的10 例中，24例前列腺癌的11例中，全部14例SCLC中和31例软组织瘤的22 例中有效升高。
本发明基于，至少部分地基于对这些基因的基因产物(MPHOSPH1和 DEPDC1)的特异性表位肽的鉴定，所述特异性表位肽能够诱导对相应分子有 特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。如下文将详细讨论的，使用源自 MPHOSPH1或DEPDC1的HLA-A*2402和HLA-A*0201结合性候选肽刺激 健康供体的外周血单核细胞(PBMC)。然后建立了针对用各种候选肽冲击 (pulse)过的HLA-A24或HLA-A2阳性靶细胞具有特定细胞毒性的CTL克隆 和/或细胞系。这些结果证实这些肽是HLA-A24或HLA-A2限定性表位肽 (HLA-A24orHLA-A2restrictedepitopepeptides)，其能够诱导针对表达 MPHOSPH1或DEPDC1的细胞的强效且特异性的免疫应答。
因此，本发明提供用于治疗或预防与MPHOSPH1和/或DEPDC1的过表 达相关的疾病，例如癌症。这些方法包括向需要的受试者施用本发明的 MPHOSPH1和/或DEPDC1多肽。这类肽的施用导致抗肿瘤免疫性的诱导。 因此，本发明提供用于诱导受试者体内抗肿瘤免疫性的方法，这类方法包括 向患者施用MPHOSPH1和/或DEPDC1多肽的步骤；本发明还提供用于治疗 或预防与MPHOSPH1和/或DEPDC1的过表达相关的疾病(例如癌症)的药物 组合物，所述组合物包括MPHOSPH1和/或DEPDC1多肽。示例性癌症包括， 但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃 癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、SCLC、和软组织肿瘤。
即，本申请包括以下实施方案，和它们的任意组合。
[1]一种具有细胞毒性T细胞诱导能力的分离的肽，其中所述肽源自 SEQIDNO:2、4和6的氨基酸序列。
[2]一种少于约15个氨基酸的分离的肽，其选自由包含SEQIDNO: 7、8或12的氨基酸序列的肽组成的群组；或一种具有细胞毒性T细胞诱导 能力的肽，其中所述肽包含选自SEQIDNO:7、8和12的氨基酸序列，其 中取代、缺失或添加了1个、2个或几个氨基酸。
[3]项[2]的具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽，其中从N-末端起的第 二个氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。
[4]项[2]的具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽，其中C-末端氨基酸是 苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸。
[5]一种少于约15个氨基酸的分离的肽，其选自由包含SEQIDNO: 9、10、11、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、 244、253、254和255的氨基酸序列的肽组成的群组；或一种具有细胞毒性 T细胞诱导能力的肽，其中所述肽包含选自SEQIDNO:9、10、11、192、 195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、253、254和 255的氨基酸序列，其中取代、缺失或添加了1个、2个或几个氨基酸。
[6]项[5]的具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽，其中从N-末端起的第 二个氨基酸是亮氨酸或甲硫氨酸。
[7]项[5]的具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽，其中C-末端氨基酸是 缬氨酸或亮氨酸。
[8]一种载体，其中的DNA编码[1]-[7]中任一项的肽。
[9]一种用于治疗或预防与SEQIDNO:1、3和/或5所示基因的过表 达相关的疾病的药物组合物，所述组合物包含一种或多种[1]-[7]中任一项的 肽。
[10]项[9]的药物组合物，其中所述疾病是癌症。
[11]项[10]的药物组合物，其中所述癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、 宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉 瘤、前列腺癌、肾癌、SCLC和软组织肿瘤。
[12]一种外来体(exosome)，其表面上呈现(present)包含[1]-[7]中任一项 的肽以及HLA抗原的复合物。
[13]项[12]的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A24。
[14]项[13]的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A2402。
[15]项[12]的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A2。
[16]项[13]的外来体，其中所述HLA抗原是HLA-A0201。
[17]一种诱导具有高的细胞毒性T细胞诱导能力的抗原呈递细胞的方 法，包括将抗原呈递细胞与[1]-[7]中任一项的肽接触的步骤。
[18]一种通过将T细胞与[1]-[7]中任一项的肽接触来诱导细胞毒性T 细胞的方法。
[19]一种诱导具有高的细胞毒性T细胞诱导能力的抗原呈递细胞的方 法，所述方法包括将下述基因转移至抗原呈递细胞的步骤，所述基因包含编 码[1]-[7]中任一项的肽的多核苷酸。
[20]一种分离的细胞毒性T细胞，所述细胞是通过将T细胞与权利要 求1-7中任一项的肽接触而被诱导的，或者所述细胞是用下述核酸转导的， 所述核酸编码在HLA-A24或HLA-A2的背景下与权利要求1-7中任一项的 肽结合的TCR亚基多肽。
[21]一种抗原呈递细胞，所述细胞包含HLA抗原与[1]-[7]中任一项的 肽之间形成的复合物。
[22]项[21]的抗原呈递细胞，所述细胞是通过项[17]的方法诱导的。
[23]一种用于抑制表达SEQIDNO:1、3和/或5的基因的细胞增殖的 疫苗，其中所述疫苗包含[1]-[7]中任一项的肽作为活性成分。
[24]项[23]的疫苗，其中所述细胞是癌细胞。
[25]项[24]的疫苗，其中所述癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、 胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列 腺癌、肾癌、SCLC和软组织肿瘤。
[26]项[23]的疫苗，配制成用于向HLA抗原是HLA-A24或HLA-A2 的受试者施用。
[27]一种治疗或预防受试者中与SEQIDNO:1、3和/或5所示基因的 过表达相关的疾病的方法，包括向所述受试者施用疫苗，所述疫苗包含一种 或多种[1]-[7]中任一项的肽、所述肽的免疫学活性片段、或编码所述肽或其 免疫学活性片段的多核苷酸。
[28]项[27]的方法，其中所述疾病是癌症。
[29]项[28]的方法，其中所述癌症选自下组：膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、 胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列 腺癌、肾癌、SCLC和软组织肿瘤。
或者，本发明还涉及诱导细胞毒性T细胞的方法，包括将T细胞与通过 项[19]的方法产生的抗原呈递细胞接触的步骤。
在结合附图和实施例阅读以下详述后，本发明的这些和其它目的和特征 将变得更加显而易见。然而，应该理解无论是前述的发明内容还是下文的详 述均为本发明的优选实施方案，而非对本发明或本发明的其它可供选择的实 施方案的限制。
附图简述
[图1]
图1A描述的是用于筛选表位肽的IFN-γELISPOT测定法的结果，所述 结果进而证实MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)是IFN-γ的强力生产 者。根据下文实施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了针对源自 MPHOSHP1的那些肽的CTL。所示为得到的具有可检测的特异性CTL活性 的CTL。具体而言，与对照相比，4号孔中用MPHOSPH1-A24-9-278刺激 的细胞显示了可识别用肽冲击过的(peptidepulsed)的靶细胞的强力IFN-γ产 生。图1B描述的是在有限稀释(MPHOSPH1-A24-9-278CTL克隆)之后用于 筛选CTL克隆的IFN-γELISPOT测定法的结果。扩增(expand)阳性孔中的细 胞并且进行有限稀释。如所示结果所证实，建立了与针对未用肽冲击的靶相 比针对肽冲击的靶具有较高的特异性CTL活性的CTL克隆。
[图2]
图2A描述的是用于筛选表位肽细胞毒性的IFN-γELISPOT测定法结 果，所述结果进而证实MPHOSPH1-A24-10-278(SEQIDNO:8)是IFN-γ的 强力生产者。根据下文实施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了针 对源自MPHOSHP1的那些肽的CTL。所示为得到的具有可检测的特异性 CTL活性的CTL。具体而言，与对照相比，8号孔中用MPHOSPH1-A24-10-278 刺激的细胞显示了强的IFN-γ产生。图2B描述的是在有限稀释 (MPHOSPH1-A24-10-278CTL克隆)之后筛选CTL克隆的IFN-γELISPOT测 定法的结果。扩增阳性孔中的细胞并且进行有限稀释。如所示结果所证实的， 建立了与针对未用肽冲击过的靶相比，针对经MPHOSPH1-A24-10-278冲击 的靶具有较高特异性CTL活性的CTL克隆。
[图3]
图3A描述用MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)刺激的CTL克隆的 建立。这种CTL克隆展示出高度的针对用MPHOSPH1-A24-9-278冲击的靶 细胞(A24LCL)的特异性CTL活性，但是针对未用肽冲击的相同的靶细胞 (A24LCL)未显示显著CTL活性。图3B描述用MPHOSPH1-A24-10-278(SEQ IDNO:8)刺激的CTL克隆的建立。这种CTL克隆展示出高度的针对用 MPHOSPH1-A24-10-278冲击的靶细胞的特异性CTL活性，而该克隆针对未 用肽冲击的相同靶细胞(A24LCL)未显示显著CTL活性。
R表示应答物：CTL克隆。
S表示刺激物：用肽冲击过的A24-LCL(1x104/孔)。
[图4]
图4描述MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)在具有HLA-A24的靶 细胞表面的表达。使用由MPHOSPH1-A24-9-278激发产生的CTL克隆作为 效应细胞，测定了针对用全长MPHOSPH1基因和HLA-A*2402分子二者共 同转染的COS7的特异性CTL活性。制备用全长MPHOSPH1转染但不用 HLA-A*2402转染的COS7和用HLA-A*2402转染但不用全长MPHOSPH1 转染的COS7作为对照。CTL克隆针对用MPHOSPH1和HLA-A24二者共 同转染的COS7展示出高度的特异性CTL活性。然而，该克隆针对未用 MPHOSPH1或HLA-A24(neitherMPHOSPH1norHLA-A24)转染的COS7未 显示显著特异性CTL活性。
R表示应答物：CTL克隆。
S表示刺激物：COS7转染子(1x104/孔)。
[图5]
图5描述的是针对内源表达MPHOSPH1的膀胱癌细胞系的CTL活性。 用MPHOSPH1-A24-9-278肽诱导建立的CTL克隆识别内源表达MPHOSPH1 的肿瘤细胞。HT1376、RT-4和J82细胞分别内源表达MPHOSPH1。CTL克 隆针对具有HLA-A*2402基因型的HT1376显示了IFN-γ的产生，但是针对 非HLA-A*2402基因型的RT-4和J82未显示应答。
[图6]
图6描述的是使用MPHOSPH1-A24-9-278肽进行的体内免疫原性分析。 在第0天和第7天向BALB/c小鼠皮下注射用IFA缀合的肽。在第14天， 收集接种过的小鼠的脾细胞并用作应答细胞(respondercell)，并且使用1x104个用MPHOSPH1-A24-9-278肽冲击过的RLmale1细胞作为刺激细胞 (stimulatorcell)来进行IFN-γELISPOT测定。标明了每只小鼠的点形成计数 (spotformingcounts)(SFC)；为五只小鼠(Ani1～Ani5)接种表位肽，为三只小 鼠(nega1～nega3)注射模拟物IFA乳剂作为阴性对照。
[图7]
图7描述的是筛选表位肽的IFN-γELISPOT测定的结果，该结果进而证 实MPHOSPH1-A2-9-282(SEQIDNO:9)、MPHOSPH1-A2-9-638(SEQID NO:10)和MPHOSPH1-A2-10-1714(SEQIDNO:11)具有强力的IFN-γ产生 活性。根据下文所列实施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了针对 源自MPHOSHP1的那些肽的CTL。所示为得到的具有可检测的特异性CTL 活性的CTL。具体而言，图7A证实与对照相比用MPHOSPH1-A2-9-282刺 激的1号和5号孔中的细胞显示了足以识别用肽冲击的靶细胞的强力的 IFN-γ产生。图7B证实与对照相比用MPHOSPH1-A2-9-638刺激的8号孔中 的细胞显示了足以识别用肽冲击过的靶细胞的强力的IFN-γ产生。图7C证 实与对照相比用MPHOSPH1-A2-10-1714刺激的4号孔中的细胞显示了可识 别用肽冲击过的靶细胞的强力的IFN-γ产生。
[图8]
图8描述的是用MPHOSPH1-A02-9-282、(SEQIDNO:9) MPHOSPH1-A02-9-638(SEQIDNO:10)和MPHOSPH1-A02-10-1714(SEQ IDNO:11)刺激的CTL细胞系的建立。扩增阳性孔中的细胞，并且如所述结 果所示，建立了这样的CTL细胞系，所述细胞系针对用 MPHOSPH1-A02-9-282冲击的靶(A)、用MPHOSPH1-A02-9-638冲击的靶(B) 或用MPHOSPH1-A02-10-1714冲击的靶(C)具有更高的特异性CTL活性(相 比于针对未用肽冲击的靶的活性)。
R表示应答物：CTL细胞系。
S表示刺激物：用肽冲击过的T2(1x104个/孔)。
[图9]
图9A描述在有限稀释(MPHOSPH1-A2-9-282CTL克隆)之后用于筛选 CTL克隆的IFN-γELISPOT测定的结果。扩增阳性孔中的细胞并且进行有限 稀释。如所述结果所示，建立了这样的CTL克隆，所述CTL克隆针对用 MPHOSPH1-A2-9-282(SEQIDNO:9)冲击的靶的特异性CTL活性高于针对 未用肽冲击的靶的活性。图9B描述的是用MPHOSPH1-A02-9-282刺激的 CTL克隆的建立。所述CTL克隆针对用MPHOSPH1-A2-9-282冲击的靶细 胞(T2)展示出高度的特异性CTL活性，但是针对未用肽冲击的相同靶细胞 (T2)无显著CTL活性。
R表示应答物：CTL克隆。
S表示刺激物：用肽冲击过的T2(1x104/孔)。
[图10]
图10A描述的是用于筛选表位肽的IFN-γELISPOT测定的结果，该结 果进而证实DEPDC1-A24-9-294(SEQIDNO:12)是强的IFN-γ生产者。根据 下文所列实施例的“材料和方法”部分中描述的方案生成了针对源自 DEPDC1的那些肽的CTL。所示为得到的表现出可检测的特异性CTL活性 的CTL。用DEPDC1-A24-9-294刺激的10号孔中的细胞与对照相比显示了 可识别用肽冲击过的靶细胞的强的IFN-γ生产。图10B描述的是在有限稀释 之后(DEPDC1-A24-9-294CTL克隆)筛选CTL克隆的IFN-γELISPOT测定的 结果。扩增阳性孔中的细胞并且进行有限稀释。如所述结果所示，建立了这 样的CTL克隆，所述CTL克隆针对用DEPDC1-A24-9-294冲击的靶的特异 性CTL活性高于针对未用肽冲击过的靶的活性。
[图11]
图11描述的是用DEPDC1-A24-9-294(SEQIDNO:12)刺激的CTL克隆 的建立。所述CTL克隆显示出高度的针对用DEPDC1-A24-9-294冲击过的 靶细胞(A24LCL)的特异性CTL活性，而针对未用肽冲击的相同靶细胞 (A24LCL)未显示显著CTL活性。
R表示应答物：DEPDC-A24-9-294CTL克隆。
S表示刺激物：用肽冲击的A24-LCL(1x104个/孔)。
[图12]
图12描述的是具有HLA-A24的靶细胞表面上DEPDC1-A24-9-294(SEQ IDNO:12)的表达。使用由DEPDC1-A24-9-294激发产生的CTL克隆作为效 应细胞，测定了针对用全长DEPDC1基因和HLA-A*2402分子二者共同转 染的COS7的特异性CTL活性。制备了用全长DEPDC1转染但不用 HLA-A*2402转染的COS7和用HLA-A*2402转染但不用全长DEPDC1转染 的COS7作为对照。建立的CTL克隆针对用DEPDC1和HLA-A24二者共同 转染的COS7展示出高度的特异性CTL活性。然而，该克隆针对未用DEPDC1 或HLA-A24转染的COS7未显示显著的特异性CTL活性。
R表示应答物：DEP-A24-9-294CTL克隆。
S表示刺激物：COS7转染子(1x104个/孔)。
[图13]
图13描述的是针对内源表达DEPDC1的膀胱癌细胞系的CTL活性。用 DEPDC1-A24-9-294肽诱导的建立的CTL克隆(establishedCTLcloneinduced withDEPDC1-A24-9-294peptide)识别内源表达DEPDC1的肿瘤细胞。 HT1376、RT-4和J82细胞分别内源表达DEPDC1。所述CTL克隆针对具有 HLA-A*2402基因型的HT1376显示了IFN-γ的产生，但是针对非 HLA-A*2402基因型的RT-4和J82未显示应答。
[图14]
图14描述的是使用DEPDC1-A24-9-29肽进行的体内免疫原性分析。在 第0天和第7天向BALB/c小鼠皮下注射用IFA缀合的肽。在第14天，收 集接种过的小鼠的脾细胞并用作应答细胞，并且使用1x104个用 DEPDC1-A24-9-294肽冲击过的RLmale1细胞作为刺激细胞来进行IFN-γ ELISPOT测定。标明了每只小鼠的点形成计数(SFC)；为五只小鼠(Ani1～Ani5) 接种表位肽，为两只小鼠(nega1和nega2)注射模拟物IFA乳剂作为阴性对照。
[图15]
图15描述了用于筛选表位肽的IFN-γELISPOT测定中 DEPDC1-A02-10-644、-10-575、-10-506、-10-765、-10-395、-10-224、-9-297、 -10-296和-10-302的强力IFN-γ产生。以“材料和方法”中描述的方式生成 了针对源自DEPDC1的那些肽的CTL。与对照相比，用DEPDC1-A02-10-644 刺激的4号和7号孔中的细胞，用DEPDC1-A02-10-575刺激的2号孔中的 细胞，用DEPDC1-A02-10-506刺激的7号孔中的细胞，用 DEPDC1-A02-10-765刺激的1号孔中的细胞和用DEPDC1-A02-10-395刺激 的1号孔中的细胞，用DEPDC1-A02-10-224刺激的1号和2号孔中的细胞， 用DEPDC1-A02-9-297刺激的4号孔中的细胞，用DEPDC1-A02-10-296刺 激的3号和4号孔中的细胞和用DEPDC1-A02-10-302刺激的2号、3号、5 号和7号孔中的细胞显示了强力的IFN-γ产生。
[图16]
图16描述的是用DEPDC1-A02-10-296肽生成的CTL细胞系的IFN-γ 产生。通过DEPDC1-A02-10-296肽激发产生的建立的CTL细胞系具有强力 的IFN-γ产生活性。该图显示，针对用肽刺激的靶细胞产生了IFN-γ，但是 针对未用肽刺激的靶细胞未显示IFN-γ产生。使用的靶细胞是在细胞表面表 达HLA-A2分子的T2细胞。
[图17]
图17描述的是针对内源表达DEPDC1和HLA-A2分子的靶的CTL活性。 上方图中显示的是，用DEPDC1-A02-10-296肽产生的、建立的CTL细胞系， 针对内源表达DEPDC1V2和HLA-A2的靶细胞具有IFN-γ产生活性。使用 DEPDC1-A02-10-296肽的情况在下方图中显示。制备了用DEPDC1V1-9-674 或DEP-9-462肽刺激的、仅表达DEPDC1V2和仅表达HLA-A2的靶细胞， 作为阴性对照。靶细胞是从稳定表达HLA-A2或模拟物(mock)的HEK293转 染子制备的。
[图18]
图18描述的是病例2中的抗原表达。在病例2中，MPHOSPH1和 DEPDC1均强力表达。因此，接种了源自MPHOSPH1和DEPDC1的两类表 位肽。
[图19]
图19描述的是对病例2中膀胱癌局部复发的临床评估。根据RECIST 标准评估病例2为SD。
[图20]
图20描述的是病例3中的抗原表达。在病例3中，DEPDC1强力表达。 因此，我们仅接种了源自DEPDC1的表位肽。
[图21]
图21描述的是对病例3中转移性肺右叶的临床评估。在接种之后进展 速度被降低。特别的是，肿瘤大小在第三个疗程之后减小。
[图22]
图22描述的是对病例3中转移性肺左叶的临床评估。进展速度在接种 之后被降低。特别的是，肿瘤大小在第三个疗程之后减小。
[图23]
图23描述的是病例3中的抗肿瘤效果。在接种之后转移性肿瘤的进展 速度被降低。
[图24]
图24描述的是病例3中的特异性CTL应答。在接种之后强烈地表现特 异性CTL应答。
[图25]
图25描述的是病例4中的抗原表达。在病例4中，MPHOSPH1和 DEPDC1被表达。因此，接种了源自MPHOSPH1和DEPDC1的两种表位肽。
[图26]
图26描述的是对病例4中膀胱癌局部复发的临床评估。在第一接种疗 程之后，根据RECIST标准肿瘤大小降低了20％。
发明详述
除非另有特定的说明，本说明书中使用的术语“一个(a)”或“一种(an)” 和“该/所述(the)”是指至少一个或至少一种。
除非另有定义，本说明书中使用的所有技术和科学术语的意思与本发明 所属技术领域普通技术人员所通常理解的意思相同。
新的TAA的鉴定，特别是对诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的那 些TAA的鉴定，为人们进一步开发肽接种策略在多种类型的癌症中的临床 应用提供了保证(BoonT等,(1996)JExpMed183:725-9.；vanderBruggenP 等,(1991)Science254:1643-7.；BrichardV等,(1993)JExpMed178:489-95.； KawakamiY等,(1994)JExpMed180:347-52.；ShichijoS等,(1998)JExp Med187:277-88.；ChenYT等,(1997)Proc.Natl.Acd.Sci.USA,94:1914-8.； HarrisCC,(1996)JNatlCancerInst88:1442-55.；ButterfieldLH等,(1999) CancerRes59:3134-42.；VissersJL等,(1999)CancerRes59:5554-9.；vander BurgSH等,(1996)J.Immunol156:3308-14.；TanakaF等,(1997)CancerRes 57:4465-8.；FujieT等,(1999)IntJCancer80:169-72.；KikuchiM等,(1999)Int JCancer81:459-66.；OisoM等,(1999)IntJCancer81:387-94.)。如上所述， 人们先前使用cDNA微阵列技术确定了MPHOSPH1(M期磷蛋白1；GenBank 登录号NM_016195；SEQIDNos.1,2)和DEPDC1(含DEP结构域的蛋白1； GenBank登录号BM683578)，更具体而言是它的两种变体DEPDC1V1(SEQ IDNos.3,4)和DEPDC1V2(SEQIDNo.5,6)在多种癌症中过表达。 MPHOSPH1先前被鉴定为G2/M过渡时被特异性磷酸化的蛋白质之一，并 且被表征为正端导向的驱动蛋白相关蛋白(AbazaA等,JBiolChem2003,278: 27844-52.)。更具体地，先前已经有文献记载MPHOSPH1是一种正端导向的 分子马达，在胞质分裂中扮演重要角色，并且在HeLa细胞中在分裂后期至 分裂末期的过程中在纺锤体的中间区积累(AbazaA等,JBiolChem2003,278: 27844-52；KamimotoT等,JBiolChem2001,276:37520-8.)。MPHOSPH1 cDNA编码一种1780个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质由三个结构域构成： NH2-驱动蛋白马达结构域(NH2-kinasinmotordomain)，中心卷曲螺旋-茎结 构域，和C-球形尾部结构域。这些数据提示MPHOSPH1是NH2型驱动蛋 白相关蛋白。
DEPDC1蛋白的功能尚不清楚。在Dishevelled、Egl-10和Pleckstrin中 发现了这种蛋白质中包括的DEP结构域。具体而言，果蝇Dishevelled中的 DEP结构域在平面极性缺陷的拯救和JNK信号传导的诱导中扮演重要角色； 然而，它在人类中的功能尚不清楚。但是，如PCT/JP2006/302684中所公开 的，DEPDC1(内部编号B5860N)具有由12和11个外显子组成的两种不同的 转录变体，分别对应于DEPDC1V1和V2。注意到V1第8外显子中的可选 变异，并发现其它剩余的外显子为两种变体所共有。V2变体没有V1的第8 外显子，但是在最后一个外显子内产生相同的终止密码子。B5860NV1和 B5860NV2变体的全长cDNA序列分别由5318和4466个核苷酸组成。这些 变体的ORF始于各自的第1外显子内。最终，V1和V2转录物分别编码811 个和527个氨基酸。siRNA抑制了癌细胞的生长。这些结果证实DEPDC1 在大多数癌细胞的生长中发挥重要作用。
如PCT/JP2006/302684中所公开的，MPHOSPH1和DEPDC1在膀胱癌 中过表达，但是在正常组织中显示最低表达(minimalexpression)。此外，发 现这些基因具有与细胞增殖相关的重要功能。
在本发明中，证明了源自MPHOSPH1或DEPDC1的肽是限定于 HLA-A24和HLA-A2的TAA表位，HLA-A24和HLA-A2是在日本人和白 人群体中常见的HLA等位基因。具体而言，利用它们对HLA-A24和HLA-A2 的结合亲和力，鉴定了源自MPHOSPH1或DEPDC1的HLA-A24和HLA-A2 结合肽的候选物。在通过装载有这些肽的树突细胞(DC)体外刺激T细胞之 后，成功地使用MPHOSPH1-A24-9-278(IYNEYIYDL(SEQIDNO:7))、 MPHOSPH1-A24-10-278(IYNEyIYDLF(SEQIDNO:8))、 MPHOSPH1-A2-9-282(YIYDLFVPV(SEQIDNO:9))、MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV(SEQIDNO:10))、MPHOSPH1-A2-10-1714(TMSSsKLSNV (SEQIDNO:11))、DEPDC1-A24-9-294(EYYELFVNI(SEQIDNO:12))、 DEPDC1-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQIDNO:240))、 DEPDC1-A02-10-575(SLLPaSSMLT(SEQIDNO:241))、 DEPDC1-A02-10-506(QLCRsQSLLL(SEQIDNO:243))、 DEPDC1-A02-10-765(KQFQkEYPLI(SEQIDNO:244))、DEPDC1- A02-10-395(IMGGSCHNLI(SEQIDNO:249)、DEPDC1-A02-10-224 (NMANtSKRGV(SEQIDNO:253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL (SEQIDNO:226))、DEPDC1-A02-10-296(YELFvNILGL(SEQIDNO:254))、 DEPDC1-A02-10-301(NILGlLQPHL(SEQIDNO:255))、DEPDC1-A2-9-589 (LLQPHLERV(SEQIDNO:192))、DEPDC1-A2-9-619(LLMRMISRM(SEQ IDNO:195))、DEPDC1-A2-9-290(LLTFEYYEL(SEQIDNO:197))、 DEPDC1-A2-9-563(RLCKSTIEL(SEQIDNO:209))、DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV(SEQIDNO:225))、DEPDC1-A2-10-674(FLMDhHQEIL(SEQ IDNO:228))和DEPDC1-A2-10-302(ILVVcGYITV(SEQIDNO:230))建立了 CTL。这些CTL针对用肽冲击过的A24LCL和T2细胞展现出强力的细胞毒 活性。此外，源自这些细胞的CTL克隆还分别展现出针对表达MPHOSPH1 或DEPDC1的HLA-A24或HLA-A2阳性细胞的特异性细胞毒性。然而，这 些CTL克隆针对仅表达这些肽(包括HLA-A24、HLA-A2、MPHOSPH1和 DEPDC1)中的一种的细胞不表现细胞毒活性。这些结果合起来提示 MPHOSPH1和DEPDC1作为癌细胞的TAA是有用的，并且 MPHOSPH1-A24-9-278(IYNEYIYDL(SEQIDNO:7))、 MPHOSPH1-A24-10-278(IYNEyIYDLF(SEQIDNO:8))、 MPHOSPH1-A2-9-282(YIYDLFVPV(SEQIDNO:9))、MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV(SEQIDNO:10))、MPHOSPH1-A2-10-1714(TMSSsKLSNV (SEQIDNO:11))、DEPDC1-A24-9-294(EYYELFVNI(SEQIDNO:12))、 DEPDC1-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQIDNO:240))、 DEPDC1-A02-10-575(SLLPaSSMLT(SEQIDNO:241))、 DEPDC1-A02-10-506(QLCRsQSLLL(SEQIDNO:243))、 DEPDC1-A02-10-765(KQFQkEYPLI(SEQIDNO:244))、DEPDC1- A02-10-395(IMGGSCHNLI(SEQIDNO:249)、DEPDC1-A02-10-224 (NMANtSKRGV(SEQIDNO:253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL (SEQIDNO:226))、DEPDC1-A02-10-296(YELFvNILGL(SEQIDNO:254))、 DEPDC1-A02-10-301(NILGlLQPHL(SEQIDNO:255))、DEPDC1-A2-9-589 (LLQPHLERV(SEQIDNO:192))、DEPDC1-A2-9-619(LLMRMISRM(SEQ IDNO:195))、DEPDC1-A2-9-290(LLTFEYYEL(SEQIDNO:197))、 DEPDC1-A2-9-563(RLCKSTIEL(SEQIDNO:209))、DEPDC1-A2-9-653 (CVLCCAEEV(SEQIDNO:225))、DEPDC1-A2-10-674(FLMDhHQEIL(SEQ IDNO:228))和DEPDC1-A2-10-302(ILVVcGYITV(SEQIDNO:230))是限定 于HLA-A24或HLA-A2的各TAA的表位肽。由于这些抗原在大多数癌症中 过表达，并且与肿瘤细胞增殖相关，它们作为针对癌症的免疫治疗靶是有用 的。示例性癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、 CML、结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、 SCLC、软组织肿瘤。
因此，本发明进一步提供治疗或预防受试者中与MPHOSPH1和/或 DEPDC1过表达相关的疾病例如癌症的方法，这样的方法包括向需要的患者 施用免疫原性肽的步骤，所述肽小于约40个氨基酸，经常小于约20个氨基 酸，通常小于约15个氨基酸，并且具有SEQIDNOs:7、8、9、10、11、12、 192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、 253、254或255的氨基酸序列。或者，所述免疫原性肽可以由SEQIDNOs: 7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、 241、243、244、249、253、254或255的序列构成，其中取代、缺失或添加 了1个、2个或几个(例如，多至5个)氨基酸，条件是所得变体肽保留所述 免疫原性(即，诱导对表达MPHOSPH1和/或DEPDC1的细胞例如癌症有特 异性的CTL的能力)。取代、缺失或添加的残基数通常是5个氨基酸或更少， 优选4个氨基酸或更少，更优选3个氨基酸或更少，甚至更优选一个或两个 氨基酸。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞 癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾 癌、SCLC、软组织肿瘤。
已知变体肽(即氨基酸序列经修饰的肽，所述修饰是通过对原始氨基酸 序列进行一个、两个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加来进行的)保留 原始生物学活性(MarkDF等,(1984)ProcNatlAcadSciUSA81:5662-6.； ZollerMJandSmithM,(1982)NucleicAcidsRes10:6487-500.； Dalbadie-McFarlandG等,(1982)ProcNatlAcadSciUSA79:6409-13.)。在本 发明的上下文中，优选氨基酸修饰导致对原始氨基酸侧链性质的保留(该过 程被称为保守氨基酸取代)。氨基酸侧链性质的实例包括疏水氨基酸(A、I、 L、M、F、P、W、Y、V)，亲水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、 S、T)，以及共同具有以下官能团或特征的侧链：脂族侧链(G、A、V、L、I、 P)；含羟基侧链(S、T、Y)；含硫原子的侧链(C、M)；含羧酸和酰胺的侧链 (D、N、E、Q)；含碱侧链(basecontainingside-chain)(R、K、H)；和含芳基 侧链(aromaticcontainingside-chain)(H、F、Y、W)。注意，圆括号内的字母 表示氨基酸的单字母编码。
在优选的实施方案中，免疫原性肽是九肽(9聚体)或十肽(10聚体)。
本发明进一步提供对受试者中与MPHOSPH1和/或DEPDC1过表达相关 的疾病(例如癌症)诱导抗肿瘤免疫性的方法，这样的方法包括向需要的受试 者施用本发明的免疫原性肽，即具有SEQIDNO:7、8、9、10、11、12、192、 195、197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、 254或255的氨基酸序列或其变体(即，包括1个、2个或几个氨基酸的取代、 缺失或添加)的肽，的步骤。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、 宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉 瘤、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤。
在本发明的上下文中，受试者优选是哺乳动物。示例性哺乳动物包括， 但不限于，例如，人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛(cow)。
在本发明中，可以藉由体内或回体(exvivo)方案向受试者施用所述肽。 此外，本发明还提供使用九肽或十肽制造用于治疗或预防与MPHOSPH1和/ 或DEPDC1过表达相关的疾病(例如癌症)的免疫原性组合物的用途，所述九 肽或十肽选自下组：具有SEQIDNOs:7、8、9、10、11、12、192、195、 197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254和 255的氨基酸序列(及其变体)的肽。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、 乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴 瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤。
对MPHOSPH1-A24-9-278(IYNEYIYDL(SEQIDNO:7))、 MPHOSPH1-A24-10-278(IYNEyIYDLF(SEQIDNO:8))、 MPHOSPH1-A2-9-282(YIYDLFVPV(SEQIDNO:9))、MPHOSPH1-A2-9-638 (RLAIFKDLV(SEQIDNO:10))、MPHOSPH1-A2-10-1714(TMSSsKLSNV (SEQIDNO:11))、DEPDC1-A24-9-294(EYYELFVNI(SEQIDNO:12))、 DEPDC1-A2-9-589(LLQPHLERV(SEQIDNO:192))、DEPDC1-A2-9-619 (LLMRMISRM(SEQIDNO:195))、DEPDC1-A2-9-290(LLTFEYYEL(SEQ IDNO:197))、DEPDC1-A2-9-563(RLCKSTIEL(SEQIDNO:209))、 DEPDC1-A2-9-653(CVLCCAEEV(SEQIDNO:225))、DEPDC1-A2-10-674 (FLMDhHQEIL(SEQIDNO:228))、DEPDC1-A2-10-302(ILVVcGYITV(SEQ IDNO:230))DEPDC1-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQIDNO:240))、 DEPDC1-A02-10-575(SLLPaSSMLT(SEQIDNO:241))、 DEPDC1-A02-10-506(QLCRsQSLLL(SEQIDNO:243))、 DEPDC1-A02-10-765(KQFQkEYPLI(SEQIDNO:244))、DEPDC1- A02-10-395(IMGGSCHNLI(SEQIDNO:249)、DEPDC1-A02-10-224 (NMANtSKRGV(SEQIDNO:253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL (SEQIDNO:226))、DEPDC1-A02-10-296(YELFvNILGL(SEQIDNO:254)) 和DEPDC1-A02-10-301(NILGlLQPHL(SEQIDNO:255))的同源性分析显示 它们不与源自任何已知的人基因产物的肽具有显著同源性。因此，显著降低 了针对这些分子的免疫治疗产生未知的或不期望的免疫应答的可能性。
关于HLA抗原，本文所示数据证实使用A-24型或A-2型抗原(据称在 日本人中高表达)有利于获得有效的结果。使用诸如A-2402和A-0201等亚 型是更优选的。通常，在临床上，预先调查需要治疗的患者的HLA抗原类 型，进而能够选择对患者抗原具有高结合亲和力水平或具有通过抗原呈递而 诱导细胞毒性T细胞(CTL)的能力的适合的肽。此外，为了获得具有高结合 亲和力和CTL诱导能力的肽，可以基于天然存在的MPHOSPH1和DEPDC1 部分肽进行1个、2个或几个氨基酸的取代、缺失或添加。在本文中，术语 “几个”意指5个或更少，更优选3个或更少。此外，除了天然呈现的肽， 由于呈现的肽序列与HLA抗原结合的规律性是已知的(KuboRT,等,(1994)J. Immunol.,152,3913-24.；RammenseeHG,等,(1995)Immunogenetics. 41:178-228.；KondoA,等,(1995)J.Immunol.155:4307-12.)，所以可以基于这 种规律性对本发明的免疫原性肽进行修饰。例如，可优选使用这样的具有高 HLA-24结合亲和力的肽，其中将N末端起的第二个氨基酸用苯丙氨酸、酪 氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代。同样，C-末端氨基酸被取代为苯丙氨酸、亮 氨酸、异亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸的肽也可优选使用。另一方面，可以优 选使用具有高HLA-A2结合亲和力并且N末端起的第二个氨基酸被取代为 亮氨酸或甲硫氨酸取代的肽，以及C末端氨基酸被取代为缬氨酸或亮氨酸的 肽。此外，可以向所述肽的N末端和/或C末端添加1至2个氨基酸。
然而，当所述肽序列与具有其它不同功能的内源或外源蛋白质的部分氨 基酸序列相同时，可能引发副作用，诸如针对具体物质的自身免疫病或变应 性症状等。因此，优选避免所述免疫原性序列与已知蛋白质的氨基酸序列匹 配的情况。这种情况可以通过使用可用数据库进行同源性搜索来避免。如果 同源性搜索确认自然界中不存在1个、2个或几个氨基酸不同的肽(peptidesin which1,2orseveraldifferentaminoacidsdonotexistinnature)，那么可以避免 上述氨基酸序列被修饰(例如增加HLA抗原的结合亲和力和/或增加CTL诱 导能力的修饰)的危险(thedangerthatmodificationsoftheabove-mentioned aminoacidsequencethat,forexample,increasethebindingaffinitywithHLA antigens,and/orincreasetheCTLinducibilitycanbeavoided)。
尽管预期如上所述对HLA抗原具有高结合亲和力的肽可作为高效的癌 症疫苗，但是对于候选肽——它们是以高结合亲和力的存在作为指标选择 的——而言，必须考察它们CTL诱导能力是否确实存在CTL诱导能力。CTL 诱导能力可以通过常规方法加以确认：通过诱导携带人MHC抗原的抗原呈 递细胞(例如，B淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞)，或更具体地说，源自人 外周血单个核白细胞的树突细胞，并且，在用感兴趣的肽刺激之后，与CD8 阳性细胞混合，再测量针对所述靶细胞的细胞毒活性。作为反应体系，可以 使用制备为表达人HLA抗原的转基因动物(例如，在BenMohamedL,等, (2000)Hum.Immunol.；61(8):764-79RelatedArticles,Books,Linkout.中描述的 那些)。例如，可以用51Cr等对靶细胞进行放射标记，并且可以根据从靶细 胞释放的放射性来计算细胞毒活性。或者可以这样检查，通过测量在携带固 定化肽的抗原呈递细胞的存在下由CTL产生并释放的IFN-γ，并且使用抗 IFN-γ单克隆抗体使培养基上的抑制区可视化。
如上所述对肽的CTL诱导能力的检查结果发现，对HLA抗原具有高结 合亲和力的那些肽不一定具有高诱导能力。然而，选自下述肽的九肽或十肽 显示出特别高的CTL诱导能力，所述肽具有IYNEYIYDL(SEQIDNO:7)、 IYNEyIYDLF(SEQIDNO:8)、YIYDLFVPV(SEQIDNO:9)、RLAIFKDLV (SEQIDNO:10)、TMSSsKLSNV(SEQIDNO:11)、EYYELFVNI(SEQIDNO: 12)、LLQPHLERV(SEQIDNO:192)、LLMRMISRM(SEQIDNO:195)、 LLTFEYYEL(SEQIDNO:197)、RLCKSTIEL(SEQIDNO:209)、 CVLCCAEEV(SEQIDNO:225)、FLMDhHQEIL(SEQIDNO:228)、 ILVVcGYITV(SEQIDNO:230)、DEPDC1-A02-10-644(SLMIhTFSRC(SEQ IDNO:240))、DEPDC1-A02-10-575(SLLPaSSMLT(SEQIDNO:241))、 DEPDC1-A02-10-506(QLCRsQSLLL(SEQIDNO:243))、 DEPDC1-A02-10-765(KQFQkEYPLI(SEQIDNO:244))、DEPDC1- A02-10-395(IMGGSCHNLI(SEQIDNO:249)、DEPDC1-A02-10-224 (NMANtSKRGV(SEQIDNO:253))、DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL (SEQIDNO:226))、DEPDC1-A02-10-296(YELFvNILGL(SEQIDNO:254)) 和DEPDC1-A02-10-301(NILGlLQPHL(SEQIDNO:255))所示的氨基酸序 列。
如上所述，本发明提供具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽，即具有SEQ IDNOs:7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、 240、241、243、244、249、253、254或255的氨基酸序列或其变体(即，其 中取代、缺失或添加了1个、2个或几个氨基酸)的那些肽。因此，优选的是， 所述由SEQIDNOs:7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、 228、230、240、241、243、244、249、253、254或255或其变体中所示的 9个或10个氨基酸构成的氨基酸序列不匹配于另一内源蛋白相关的氨基酸 序列。具体而言，在N末端起的第二个氨基酸处取代为亮氨酸或甲硫氨酸的 氨基酸取代，在C末端氨基酸处取代为缬氨酸或亮氨酸的氨基酸取代，和在 N末端和/或C末端处添加1至2个氨基酸的氨基酸添加是优选变体的实例。 本领域技术人员将认识到除了氨基酸取代和添加，所述肽的免疫学活性片段 也可以在本发明的方法中使用。用于测定活性片段的方法是本领域熟知的。 通过用这些经修饰的肽进行刺激而获得的CTL克隆能够识别原来的肽并且 引起表达所述原始肽的细胞的损害。
本发明的肽能够使用公知的技术制备。例如，可以使用重组DNA技术 或化学合成以合成方法制备所述肽。本发明的肽可以个别地合成或作为更长 的包含两个或多个肽的多肽合成。本发明的肽优选是分离的，即，基本上不 含其它天然存在的宿主细胞蛋白及其片段。
本发明的肽可以含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化；只要所述 修饰不破坏如本文所述的肽的生物学活性，即与HLA抗原结合并诱导CTL 的能力。其它修饰包括掺入例如可以用于增加肽的血清半衰期的D-氨基酸 或其它氨基酸模拟物。
本发明的肽可以作为组合制备，所述组合包括两个或更多个本发明的 肽，用作与MPHOSPH1和/或DEPDC1过表达相关的疾病例如癌症所用的疫 苗，这样的疫苗在体内诱导CTL。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳 腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、 骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤。所述肽可以是鸡尾酒混合 物(cocktail)或者可以使用标准技术使其彼此缀合(conjugate)。例如，可以将 所述肽表达成单一多肽序列。组合中的肽可以是相同的或不同的。通过施用 本发明的肽，使所述肽以高密度呈现于抗原呈递细胞的HLA抗原上，进而 诱导CTL，所述CTL特异性地针对所展示的肽和HLA抗原之间形成的复合 物起反应。或者，可以用本发明的肽来刺激表面具有固定化的本发明的肽的 抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞是通过从受试者取出树突细胞来获得的。 向对应的(respective)受试者再施用这些细胞可诱导CTL，并且由此能够增加 对靶细胞的进攻性。
更具体地，本发明提供用于治疗和/或预防与MPHOSPH1和/或DEPDC1 过表达相关的疾病(例如癌症)的增殖、转移等的药物，所述药物包括一种或 多种本发明的肽。本发明的肽在治疗与MPHOSPH1和/或DEPDC1相关的疾 病(例如癌症)方面尤其有用。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、 宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉 瘤、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤。
本发明的肽可以作为通过常规配制方法配制好的药物组合物直接向受 试者施用。在这类情况下，除了本发明的肽，可以适当地包括通常用于药物 的载体(carrier)、赋形剂等，不对此进行具体限制。本发明的免疫原性组合物 可以用于治疗和预防与MPHOSPH1和/或DEPDC1相关的疾病例如癌症。预 期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、 结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、SCLC、 软组织肿瘤。
包含一种或多种本发明的肽作为活性成分、用于治疗和/或预防与 MPHOSPH1和/或DEPDC1过表达相关的疾病例如癌症的免疫原性组合物， 可以进一步包括佐剂以有效建立细胞免疫。或者，它们可以与其它活性成分 一起施用，诸如抗癌剂。预期的癌症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫 颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、 前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤。合适的剂型包括颗粒。合适的佐剂 在文献中有述(JohnsonAG.(1994)C1in.Microbio1.Rev.,7:277-89.)。示例性佐 剂包括，但不限于，磷酸铝、氢氧化铝和明矾。此外，可以方便地使用脂质 体制剂、其中将药物与几微米直径的珠子结合的颗粒制剂、和其中将脂质与 所述肽结合的制剂。施用的方法可以是口服(oral)、真皮内(intradermal)、皮 下(subcutaneous)、静脉内(intravenous)注射等，并且可以包括系统施用或对 靶向的肿瘤附近的局部施用。本发明的肽的剂量可以根据所治疗的疾病、患 者的年龄、体重、施用方法等进行适当调整。尽管剂量通常为0.001mg至 1000mg，优选0.01mg至100mg，更优选0.1mg至10mg，优选每几天至 几个月施用一次，但是本领域技术人员能够容易地选择适当的剂量和施用方 法，因为对这些参数的选择和优化完全属于常规技术。
本发明进一步提供称作外来体(exosome)的胞内泡囊，其表面提呈由本发 明的肽和HLA抗原形成的复合物。外来体可以通过，例如，使用在国际公 布的日文翻译公布特表平11-510507号和特表2000-512161号中详细描述的 方法来制备，并且优选使用从治疗和/或预防的目标受试者获得的抗原呈递细 胞制备。本发明的外来体可以作为癌症疫苗接种，类似于本发明的肽。
所用HLA抗原的类型必须与需要治疗和/或预防的受试者匹配。例如， 在日本人群体中，HLA-A24或HLA-A2，尤其是HLA-A2402或HLA-A0201， 通常是适合的。
在一些实施方案中，本发明的疫苗组合物包括致敏(prime)细胞毒性T淋 巴细胞的成分。已经确定脂质是能够在体内使CTL针对病毒抗原致敏的作 用物。例如，可以将棕榈酸残基附接于赖氨酸残基的ε-和α-氨基，再与本发 明的免疫原性肽连接。然后所述脂质化的肽(lapidatedpeptide)可以直接施用、 在微团或颗粒中施用、并入脂质体中施用、或在佐剂中乳化施用。作为脂质 致敏CTL应答的另一实例，大肠杆菌脂蛋白诸如三棕榈酰-S-甘油基半胱氨 酰丝氨酰-丝氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine)(P3CSS)当共价 附接于适当的肽时可以用于致敏CTL(参见，例如，DeresK,等,(1989)Nature 342:561-4.)。
本发明的免疫原性组合物还可包括编码一种或多种本文公开的免疫原 性肽的核酸。参见，例如，WolffJA等,(1990)Science247:1465-8；美国专利 第5,580,859；5,589,466；5,804,566；5,739,118；5,736,524；5,679,647号； 和WO98/04720。基于DNA递送技术的实例包括“裸DNA”、协助 (bupivicaine、聚合物、肽介导的)递送、阳离子脂质复合物、和颗粒介导的 递送(“基因枪”)或压力介导的递送(参见，例如，美国专利第5,922,687号)。
本发明的免疫原性肽也可以通过病毒载体或细菌载体来表达。合适的表 达载体的实例包括减毒的病毒宿主，诸如痘苗或禽痘。这种方法涉及痘苗病 毒的使用，例如，用作表达编码所述肽的核苷酸的载体。当引入宿主时，所 述重组痘苗病毒表达所述免疫原性肽，并且由此引发免疫应答。可用于免疫 方案的痘苗载体和方法在美国专利第4,722,848号中描述。另一合适载体是 BCG(卡介苗(BacilleCalmetteGuerin))。BCG载体在StoverCK,等,(1991) Nature351:456-60中描述。可用于治疗施用或免疫的多种其它载体，例如， 腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi) 载体、脱毒炭疽毒素载体等是本领域已知的。参见，例如，ShataMT,等,(2000) Mol.Med.Today6:66-71；ShedlockDJandWeinerDB.,等,(2000)J.Leukoc. Biol.68:793-806；和HippJD,等,(2000)InVivo14:571-85。
本发明还提供使用一种或多种本发明的肽诱导抗原呈递细胞的方法。所 述抗原呈递细胞可以这样诱导，通过从外周血单核细胞诱导树突细胞，再用 一种或多种本发明的肽在体外、回体或在体内接触(刺激)它们。当向受试者 施用本发明的肽时，受试者体内诱导生成固定有本发明的肽的抗原呈递细 胞。或者，可以在将本发明的肽固定至抗原呈递细胞之后，将所述细胞作为 疫苗施用于受试者。例如，回体的施用可以包括下列步骤：
a:从受试者收集抗原呈递细胞，和
b:将步骤a的抗原呈递细胞与本发明的肽接触。
可以将通过步骤b获得的抗原呈递细胞作为疫苗施用给受试者。
本发明还提供用于诱导具有高水平的细胞毒性T细胞诱导能力的抗原 呈递细胞的方法，其中所述方法包括在体外向抗原呈递细胞转移基因的步 骤，所述基因由编码一种或多种本发明的肽的多核苷酸构成。引入的基因可 以是DNA或RNA的形式。关于引入的方法，没有特殊的限制，本领域常规 进行的多种方法，诸如脂质转染法、电穿孔和磷酸钙方法可以适用。更具体 地，转染可以如ReevesME,等,(1996)CancerRes.,56:5672-7.；ButterfieldLH, 等,(1998)J.Immunol.,161:5607-13.；BoczkowskiD,等,(1996)J.Exp.Med., 184:465-72.；国际公布的日文翻译公布特表2000-509281号中所述来进行。 通过将基因转移至抗原呈递细胞中，基因在所述细胞中进行转录、翻译等， 然后由I类或II类MHC加工获得的蛋白，再通过呈递途径以呈递部分肽。
本发明进一步提供使用一种或多种本发明的肽诱导CTL的方法。当本 发明的肽被施用给受试者时，受试者体内诱导出CTL，由此增强靶向表达 MPHOSPH1和/或DEPDC1的细胞例如癌细胞的免疫系统的强度。预期的癌 症包括，但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直 肠癌、胃癌、NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织 肿瘤。或者，本发明的肽可以在回体的治疗方法的背景下使用，其中用一种 或多种本发明的肽在体外接触(刺激)源自受试者的抗原呈递细胞和CD8阳 性细胞或外周血单个核白细胞，然后，在诱导CTL之后，将细胞返回受试 者。例如，所述方法可以包括以下步骤：
a:从受试者收集抗原呈递细胞，
b:将步骤a的抗原呈递细胞与本发明的肽接触，
c:将步骤b的抗原呈递细胞与CD8+T细胞混合并且进行共培养从而诱 导细胞毒性T细胞，和
d:从步骤c的共培养物收集CD8+T细胞。
步骤d获得的具有细胞毒活性的CD8+T细胞可以作为疫苗向受试者施 用。
本发明进一步提供使用本发明的肽产生活化的细胞毒性T细胞的方法。 例如，所述方法可以包括以下步骤：
a:从受试者收集T细胞，和
b:将T细胞与以下肽接触。
(1)选自下组的小于约15个氨基酸的分离的肽：具有SEQIDNOs:7、8、 9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、240、241、 243、244、249、253、254和255的氨基酸序列的肽。
(2)具有细胞毒性T细胞诱导能力的肽，其中所述肽具有选自SEQID NOs:7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、 240、241、243、244、249、253、254和255的氨基酸序列，其中取代、缺 失或添加了1个、2个或几个氨基酸。
本发明还提供使用本发明的肽产生APC的方法，所述APC具有诱导活 化T细胞的能力。例如，所述方法可以包括将抗原呈递细胞与所述肽接触以 产生在表面呈递所述肽和HLA抗原的抗原呈递细胞的步骤。
在本发明的上下文中，“活化的细胞毒性T细胞”诱导IFN-γ产生、IFN-γ 释放和肿瘤细胞的死亡。
本发明进一步提供使用本发明的肽诱导的分离的细胞毒性T细胞。所述 细胞毒性T细胞是通过用呈递一种或多种本发明的肽的抗原呈递细胞进行 刺激而被诱导的，优选源自作为治疗和/或预防的靶的受试者，并且可以单独 施用或与其它药物组合施用，所述其它药物包括一种或多种本发明的肽或具 有抗肿瘤活性的外来体。获得的细胞毒性T细胞特异性地针对呈递本发明的 肽、或优选呈递与诱导所用的肽相同的肽的细胞起作用。靶细胞可以是内源 表达MPHOSPH1和/或DEPDC1的细胞，或是用MPHOSPH1和/或DEPDC1 基因转染的细胞。由于本发明的肽的刺激而在细胞表面呈递这些肽的细胞也 可成为攻击的靶。
本发明还提供呈递HLA抗原与一种或多种本发明的肽形成的复合物的 抗原呈递细胞。这些抗原呈递细胞是通过与本发明的肽或编码这些肽的核苷 酸接触而获得的，优选源自作为治疗和/或预防的靶的受试者，并且能够作为 疫苗单独施用或与其它药物组合施用，所述其它药物包括本发明的肽、外来 体或细胞毒性T细胞。
本发明还提供组合物和使用该组合物的方法，所述组合物包含编码能够 形成T细胞受体(TCR)亚基的多肽的核酸。TCR亚基能够形成TCR，TCR 赋予T细胞对呈递MPHOSPH1或DEPDC1的肿瘤细胞的特异性。通过使用 本领域已知的方法，可以鉴定用一种或多种本发明的肽诱导的CTL的TCR 亚基α链和β链的核酸(WO2007/032255和Morgan等,JImmunol,171,3288 (2003))。衍生的TCR优选以高亲和力(avidity)结合展示MPHOSPH1或 DEPDC1肽的靶细胞，并且任选地在体内和体外介导对呈递MPHOSPH1或 DEPDC1肽的靶细胞的有效杀伤。
可以将编码TCR亚基的核酸纳入合适的载体例如逆转录病毒载体。这 些载体是本领域熟知的。通常可以将所述核酸或包含它们的载体转移至T细 胞中，所述T细胞优选来自患者。有利地，本发明提供现成组合物(off-the-shelf composition)，利用该组合物能够快速地修饰患者自身的T细胞(或另一哺乳 动物的T细胞)以迅速且简单地产生具有卓越的癌细胞杀伤性质的修饰T细 胞。
同样，本发明提供通过用核酸转导来制备的CTL，所述核酸编码与 MPHOSPH1或DEPDC1肽(例如在HLA-A24或HLA-A2的背景下，SEQID NOs:7、8、9、10、11、12、192、195、197、209、225、226、228、230、 240、241、243、244、249、253、254或255)结合的TCR亚基多肽。经转导 的CTL能够在体内归巢于(hometo)癌细胞，并且通过已知的体外培养方法 扩增(例如，Kawakami等,JImmunol.,142,3452-3461(1989))。可以使用本发 明的T细胞来形成可用于在需要治疗或保护的患者中治疗或预防癌症的免 疫原性组合物(WO2006/031221)。
在本发明的上下文中，术语“疫苗”(也称为免疫原性组合物)指当接种 入动物中时诱导抗肿瘤免疫性或抑制癌症的物质。根据本发明，提出具有 SEQIDNO:7、8或12的氨基酸序列的多肽是HLA-A24限定性表位肽 (restrictedepitopepeptide)，并且提出具有SEQIDNO:9、10、11、192、195、 197、209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或 255的氨基酸序列的多肽是HLA-A2限定性表位肽，所述限定性表位肽可以 诱导针对表达MPHOSPH1和/或DEPDC1的细胞例如表达MPHOSPH1和/ 或DEPDC1的癌细胞的强力且特异性的免疫应答。预期的癌症包括，但不限 于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、 NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤。因此， 本发明还包括使用具有SEQIDNO:7、8、9、10、11、12、192、195、197、 209、225、226、228、230、240、241、243、244、249、253、254或255 的氨基酸序列或其变体(即，包括1个、2个或几个氨基酸的取代、缺失或添 加)的多肽诱导抗肿瘤免疫的方法。概括而言，抗肿瘤免疫包括以下列为例 的免疫应答：
-针对包含表达MPHOSPH1和/或DEPDC1的细胞的肿瘤的细胞毒性淋巴细 胞的诱导，
-识别包含表达MPHOSPH1和/或DEPDC1的细胞的肿瘤的抗体的诱导，和
-抗肿瘤细胞因子产生的诱导。
因此，当某种肽在接种至动物中时诱导这些免疫应答中的任何一种，则 判定所述肽具有诱导抗肿瘤免疫的效果。肽对抗肿瘤免疫的诱导可以通过在 体内或体外观察宿主中免疫系统对所述肽的应答来检测。
例如，用于检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是公知的。进入活体 的外来物质通过抗原呈递细胞(APCs)的作用被呈递给T细胞和B细胞。以抗 原特异性方式响应于由APC呈递的抗原的T细胞由于所述抗原的刺激而分 化成细胞毒性T细胞(也称为细胞毒性T淋巴细胞或CTL)，然后增殖；这种 过程在本文称为T细胞的“活化”。因此，由特定肽造成的CTL诱导，可以 通过将所述肽由APC呈递给T细胞并且检测对CTL的诱导来加以评估。此 外，APC具有活化CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞 和NK细胞的效果。由于CD4+T细胞在抗肿瘤免疫中也很重要，可以利用 这些细胞的活化作用作为指示(indicator)来评估所述肽的抗肿瘤免疫诱导作 用。
使用树突细胞(DC)作为APC来评估CTL诱导作用的方法是本领域熟知 的。DC是在APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在这种方法中， 最初将受试多肽与DC接触，然后将这种DC与T细胞接触。在与DC接触 之后检测到对感兴趣的细胞具有细胞毒性作用的T细胞，表明受试多肽具有 诱导细胞毒性T细胞的活性。针对肿瘤的CTL活性可以，例如，使用51Cr- 标记的肿瘤细胞的裂解作为指示来检测。或者，公知使用3H-胸苷摄取活性 或LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指示项来评估肿瘤细胞的损害程度。此外，也 可以通过测量在携带固定化肽的抗原呈递细胞的存在下由CTL产生并释放 的IFN-γ来检测，所述测量通过用抗IFN-γ抗体使IFN-γ显现来进行，诸如 ELISPOT测定法。
除了DC之外，外周血单个核细胞(PBMCs)也可用作APC。据报道通过 在GM-CSF和IL-4存在下培养PBMC使其对CTL的诱导增强。类似地，已 经证明CTL可通过在钥孔血蓝蛋白(KLH)和IL-7存在下培养PBMC来诱导。
通过这些方法确认具有CTL诱导活性的受试多肽是具有DC活化作用并 且继而具有CTL诱导活性的多肽。因此，诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽 可用作针对与MPHOSPH1和/或DEPDC1过表达相关的疾病(例如癌症)的疫 苗。此外，通过与所述多肽接触而获得了诱导针对与MPHOSPH1和/或 DEPDC1相关的疾病(例如癌症)的CTL的能力的APC可用作针对所述疾病 的疫苗。此外，由于APC呈递多肽抗原而获得了细胞毒性的CTL也可用作 针对与MPHOSPH1和/或DEPDC1相关的疾病(例如癌症)的疫苗。这些利用 APC和CTL所致的抗肿瘤免疫，用于治疗与MPHOSPH1和/或DEPDC1相 关的疾病(例如癌症)的治疗方法，称作细胞免疫疗法。预期的癌症包括，但 不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管细胞癌、CML、结肠直肠癌、胃癌、 NSCLC、淋巴瘤、骨肉瘤、前列腺癌、肾癌、SCLC、软组织肿瘤。
通常，在将多肽用于细胞免疫疗法时，可以通过组合多种具有不同结构 的多肽并且将它们与DC接触来增加CTL诱导的效率。因此，当用蛋白片段 刺激DC时，使用多种类型片段的混合物是有利的。
多肽对抗肿瘤免疫的诱导可以通过观察抗肿瘤抗体产生的诱导来进一 步确认。例如，当在用多肽免疫的实验动物中诱导产生了抗所述多肽的抗体， 并且肿瘤细胞的生长、增殖和/或转移受到这些抗体的抑制时，则确定所述多 肽可诱导抗肿瘤免疫性。
抗肿瘤免疫性可以通过施用本发明的疫苗来诱导，并且抗肿瘤免疫的诱 导可用于治疗和预防与MPHOSPH1和/或DEPDC1过表达相关的疾病，例如 癌症。与MPHOSPH1和/或DEPDC1过表达相关的疾病(例如癌症)的发病的 治疗或预防可以包括抑制表达MPHOSPH1和/或DEPDC1的细胞(例如癌细 胞)的生长，使这些细胞退化(involution)，和抑制这些细胞例如癌细胞的发生。 患有与MPHOSPH1和/或DEPDC1相关疾病(例如癌症)的个体的病死率的降 低，血液中疾病标志物(marker)的减少，伴随疾病的可检测症状的减轻等也 包括在疾病(例如癌症)的治疗或预防中。这些治疗和预防效果优选在统计学 上是显著的，例如，在5％或更低的显著水平观察，其中将针对MPHOSPH1 和/或DEPDC1相关疾病(例如癌症)的疫苗的治疗或预防效果与未施用疫苗 的对照相比。例如，斯氏t检验、Mann-WhitneyU检验或ANOVA可以用于 测定统计学显著性。
由于(inthat)本发明提供用于治疗或预防与MPHOSPH1和/或DEPDC1 过表达相关的疾病(例如癌症)的方法，可以向患有所述疾病或有风险发生(或 易患)所述疾病的受试者预防性或治疗性地施用所述治疗化合物或组合物。 这样的受试者可以使用标准临床方法来鉴定。在本发明的上下文中，预防施 用发生在明显的疾病临床症状显现之前，由此预防疾病或病症或者延迟它的 发展。在医学领域背景下，术语“预防”包括降低疾病病死率或发病率负荷 (burden)的任何活性。预防可以发生在初级、次级和三级预防水平。初级预 防避免疾病的发生，而次级和三级水平的预防包括以预防疾病进展和症状出 现为目的的活动，以及通过恢复功能和减少疾病相关的并发症来降低已患疾 病影响的活动。
在本发明的上下文中，术语“有效的(efficacious)”指治疗导致受试者中 癌症大小、普遍性(prevalence)或转移潜力的降低。当预防性施用治疗时，“有 效的”意思是治疗延迟或防止非癌(noncancer)的发生或减轻癌症的临床症 状。对癌症的评估可以使用标准临床规程进行。另外，治疗的有效性可以联 合任何用于诊断或治疗癌症的已知方法来测定。例如，癌症可以通过组织病 理学诊断或通过鉴定症状性异常来诊断。
上述具有免疫学活性的肽，或编码这样的肽的多核苷酸或载体，可以与 佐剂组合。佐剂指当与具有免疫学活性的肽一起(或相继)施用时，使针对所 述肽的免疫应答增强的化合物。合适的佐剂的实例包括霍乱毒素、沙门菌毒 素(salmonellatoxin)、明矾等，但是不限于此。另外，本发明的疫苗可以适 当地与药学可接受载体组合。这些载体的实例是无菌水、生理盐水、磷酸盐 缓冲液、培养液(culturefluid)等。另外，疫苗可以按照需要含有稳定剂、悬 剂、防腐剂、表面活性剂等。所述疫苗可以系统施用或局部施用。疫苗施用 可以通过单次施用进行或通过多次施用加强(boost)。
当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，与MPHOSPH1和/或DEPDC1 过表达相关的疾病例如癌症可以例如通过回体方法来治疗或预防。更具体 地，收集接受治疗或预防的受试者的PBMC，在体外与本发明的肽接触。在 诱导APC或CTL之后，可以将细胞施用给受试者。APC也可以通过以回体 方式将编码所述肽的载体引入PBMC来诱导。体外诱导的APC或CTL在施 用之前可以加以克隆。通过克隆并培养具有高度的靶细胞破坏活性的细胞， 可以更有效地实施细胞免疫疗法。另外，以这种方式分离的APC和CTL可 以用于这样的细胞免疫疗法，该细胞免疫疗法不仅可针对细胞所来源的个 体，还可以针对其它个体中相似类型的疾病。
在以下实施例中将描述本发明的多个方面，这些实施例旨在说明本发明 并帮助本领域普通技术人员进行和使用本发明。所述实施例不意在以任何方 式另外限制本发明的范围。
尽管在实施或试验本发明时可以使用与本文所述类似或等同的方法和 材料，但是下文将描述几种合适的方法和材料。
实施例
接下来，通过以下实施例来示例(并非限制)本发明。然而，本文描述的 材料和方法等仅为说明本发明的几个方面，而不意欲以任何形式限制本发明 的范围。同样，在本发明的实施或检验中可以使用与本文所述类似或等同的 方法和材料等。
实施例1
材料和方法
细胞系
A24LCL细胞(HLA-A24/24)、人的类B淋巴母细胞细胞系(human B-lymphoblastoidcellline)、T2细胞和COS7购自ATCC。
选择源自MPHOSOH1和DEPDC1的肽的候选物
使用结合预测软件"BIMAS"(bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ ken_parker_comboform)(ParkerKC,等,(1994)JImmunol.；152(1):163-75.； KuzushimaK,等,(2001)Blood.；98(6):1872-81.)预测了与HLA-A*2402和 HLA-A*0201分子结合的源自MPHOSOH1或DEPDC1的9聚肽或10聚肽。 这些肽依照标准固相合成方法由Sigma(Sapporo,Japan)合成，并且通过反相 HPLC纯化。肽的纯度(>90％)和身份分别通过分析型HPLC和质谱测定。将 肽以20mg/ml溶解在二甲亚砜(DMSO)中并且贮藏在-80℃。
体外CTL诱导
使用源自单核细胞的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞(APC)来诱导针对 HLA上呈现的肽的CTL应答。DC是如其它文献中所述在体外生成的(Nukaya I等,(1999)Int.J.Cancer80,92-7.,TsaiV等,(1997)J.Immunol 158:1796-802.)。简言之，用Ficoll-Paque(Pharmacia)溶液从正常志愿者 (HLA-A*2402和/或HLA-A*0201)分离外周血单个核细胞(PBMC)，通过粘附 于塑料组织培养瓶(BectonDickinson)对所述外周血单个核细胞进行分离，从 而将它们富集成单核细胞级分。将富集的单核细胞群体在1000U/ml GM-CSF(Genzyme)和1000U/mlIL-4(Genzyme)存在下在含2％热灭活自体 血清(AS)的AIM-V(Invitrogen)中培养。培养7天之后，将生成细胞因子的 DC在AIM-V中用20mcg/ml合成肽在3mcg/mlβ2-微球蛋白存在下于20℃ 冲击4小时。然后将这些肽冲击过的DC用MMC(30mcg/ml，进行30分钟) 灭活，并且以1:20比例与自体CD8+T细胞混合，其中所述自体CD8+T细 胞是通过用DynabeadsM-450CD8(Dynal)和DETACHaBEADTM(Dynal)的 阳性选择获得的。这些培养物放入(setupin)48孔平板(Corning)中；每孔在 0.5mlAIM-V/2％AS中含有1.5x104个经肽冲击的DC、3x105个CD8+T细胞 和10ng/mlIL-7(Genzyme)。三天之后，对这些培养物补充IL-2(CHIRON) 至终浓度为20IU/ml。在第7天和第14天，进一步用经肽冲击的自体DC 再次刺激所述T细胞。每次均通过与上文所述相同的方法制备DC。在第21 天，在第3轮肽冲击之后，用经肽冲击的A24LCL细胞或T2细胞来测试CTL。
CTL扩增流程
使用类似于RiddellSR,等(WalterEA等,(1995)NEnglJMed 333:1038-44.；RiddelSR,等,(1996)NatureMed.2:216-23.)所述的方法在培养 中扩增CTL。将总共5x104个CTL在40ng/ml抗CD3单克隆抗体 (Pharmingen)存在下重悬在通过MMC灭活的含两种人类B淋巴母细胞细胞 系的25mlAIM-V/5％AS中。培养开始后的次日，向培养物添加120IU/ml IL-2。在第5、8和11天用含30IU/mlIL-2的新鲜AIM-V/5％AS为培养物 补料。
CTL克隆的建立
在96孔圆底微量滴定板(NalgeNuncInternational)中稀释至每孔具有 0.3、1和3个CTL。将CTL与7x104个细胞/孔的两种人类B淋巴母细胞细 胞系、30ng/ml抗CD3抗体和125U/mlIL-2一起在总共150mcl/孔的含5％AS 的AIM-V中培养。10天之后向培养基添加50mcl/孔的IL-2，从而使IL-2 终浓度达到125U/ml。在第14天测试CTL的CTL活性，并且使用与上述 相同的方法扩增CTL克隆。
特异性CTL活性
为了检验特异性CTL活性，进行了IFN-γELISPOT测定和IFN-γELISA。
简言之，制备了经肽冲击的A24-LCL或T2细胞(1x104/孔)作为刺激细 胞。使用48孔中培养的细胞或有限稀释后的CTL克隆作为应答细胞。按照 生产流程(undermanufactureprocedure)进行IFN-γELISPOT测定和ELISA。
细胞培养和转染
建立了用EpsteinBar病毒转化的HLA-A24B-LCL(A24LCL)。Jiyoye、 EB-3、COS7、HT1376、RT-4和J82购自美国典型培养物保藏中心(Rockville, MD)。将A24LCL、Jiyoye和EB-3维持在含10％胎牛血清(GEMINI Bio-Products)和1％抗生素溶液(Sigma)的RPMI1640中。将COS7、HT1376、 RT-4和J82维持在适合的培养基和抗生素中。COS7和HEK的转染使用 FUGENE6(Roche)进行。HEK-A2细胞，作为表达HLA-A*0201分子的稳定 克隆，通过pcDNA6.2-HLA-A2质粒转染建立，并且通过有限稀释方法在5 mcg/mlBlastcidinS存在下分离。
表位肽在BALB/c小鼠中的免疫原性
为了诱导肽特异性CTL，使用每只小鼠100ml疫苗混合物来提供免疫， 所述混合物含有50mcl(100mcg)的HLA-A24限定性肽和50mclIFA。在第 0天将所述疫苗皮下注射至右胁进行第一次免疫，并且在第7天注射至左胁 进行第二次免疫。在第14天，使用经接种小鼠的脾细胞，不加以任何体外 刺激，作为应答细胞，并且以使用或未使用肽冲击的RLmale1细胞作为刺激 细胞，进行IFN-γELISPOT测定。
结果
癌症中MPHOSPH1和DEPDC1的表达增强
使用cDNA微阵列从多种癌症获得的全局基因表达谱数据(globalgene expressionprofiledata)揭示了MPHOSPH1(GenBank登录号NM_016195； SEQIDNo.1)和DEPDC1(GenBank登录号BM683578)(具有两种变体 DEPDC1V1(SEQIDNos.3)和DEPDC1V2(SEQIDNo.5))的表达升高。与 相应的正常组织相比，MPHOSPH1的表达在31例膀胱癌的30例中，36例 乳腺癌的8例中，全部18例宫颈癌中，17例胆管细胞癌的5例中，31例 CML的25例中，11例结肠直肠癌的6例中，14例胃癌的6例中，全部5 例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中，10例骨肉瘤的6例中，22例前列腺癌的 7例中，18例肾癌的10例中和21例软组织肿瘤的15例中有效升高。与相 应的正常组织相比，DEPDC1的表达在25例膀胱癌的23例中，在13例乳 腺癌的6例中，全部12例宫颈癌中，全部6例胆管细胞癌中，4例CML的 3例中，4例结肠直肠癌的2例中，全部6例NSCLC中，全部7例淋巴瘤中， 14例骨肉瘤的10例中，24例前列腺癌的11例中，全部14例SCLC中和31 例软组织瘤的22例中有效升高(表1)。
[表1]
在癌组织中观察到MPHOSPH1或DEPDC1与正常对应组织相比的存在 上调的情况的比例
源自MPHOSPH1或DEPDC1的HLA-A24和HLA-A2结合肽的预测
表2按照结合亲和力的顺序列出了MPHOSPH1的HLA-A*2402结合肽。 表2A所列为源自MPHOSPH1的9聚肽，表2B所列为源自MPHOSPH1的 10聚肽。
表3按照结合亲和力的顺序列出了MPHOSPH1的HLA-A*0201结合肽。 表3A所列为源自MPHOSPH1的9聚肽，表3B所列为源自MPHOSPH1的 10聚肽。
表4按照结合亲和力的顺序列出了DEPDC1V1和V2的HLA-A*2402 结合肽。表4A所列为源自DEPDC1V1和V2的9聚肽，表4B所列为源自 DEPDC1V1和V2的10聚肽。
表5按照结合亲和力的顺序列出了DEPDC1V1和V的HLA-A*0201结 合肽。表5A所列为源自DEPDC1V1和V2的9聚肽，表5B所列为源自 DEPDC1V1和V2的10聚肽。
[表2A]
源自MPHOSPH1的HLA-A*2402结合性9聚肽
起始位置说明从MPHOSPH1的N末端起的氨基酸编号。结合得分源自 “材料和方法”中描述的"BIMAS"。
[表2B]
源自MPHOSPH1的HLA-A*2402结合性10聚肽
起始位置说明自MPHOSPH1的N末端起的氨基酸编号。结合得分源自 “材料和方法”中描述的"BIMAS"。
[表3A]
源自MPHOSPH1的HLA-A*0201结合性9聚肽
起始位置说明自MPHOSPH1的N末端起的氨基酸编号数。
结合得分源自“材料和方法”中描述的"BIMAS"。
[表3B]
源自MPHOSPH1的HLA-A*0201结合性10聚肽
起始位置说明自MPHOSPH1的N末端起的氨基酸编号数。
结合得分源自“材料和方法”中描述的"BIMAS"。
[表4A]
源自DEPDC1的HLA-A*2402结合性9聚肽
起始位置说明自DEPDC1的N末端起的氨基酸编号数。
结合得分源自“材料和方法”中描述的"BIMAS"。
[表4B]
源自DEPDC1的HLA-A*2402结合性10聚肽
起始位置说明自DEPDC1的N末端起的氨基酸编号数。
结合得分源自“材料和方法”中描述的"BIMAS"。
[表5A]
源自DEPDC1的HLA-A*0201结合性9聚肽
起始位置说明自DEPDC1的N末端起的氨基酸编号数。
结合得分源自材料和方法中描述的"BIMAS"。
[表5B]
源自DEPDC1的HLA-A*0201结合性10聚肽
起始位置说明距DEPDC1的N末端的氨基酸数。
结合得分源自材料和方法中描述的"BIMAS"。
使用预测的来自MPHOSPH1的HLA-A*2402限定性肽刺激T细胞
根据上文“材料和方法”部分所说明的方案生成了源自MPHOSHP1 (SEQIDNo:2)的那些肽的CTL。如通过IFN-γELISPOT测定法所评估的， 得到的具有可检测特异性CTL活性的CTL示于图1A和图2A。在图1A中， 用MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)刺激的4号孔中的细胞与对照相比 显示了强力的IFN-γ产生。在图2A中，用MPHOSPH1-A24-10-278(SEQID NO:8)刺激的8号孔中的细胞与对照相比显示了强力的IFN-γ产生。然后将 这些阳性孔中的细胞扩增并且进行有限稀释。如图1B (MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7))和图2B(MPHOSPH1-A24-10-278 (SEQIDNO:8))中所示，建立了针对经肽冲击的靶的特异性CTL活性高于 针对未经肽冲击的靶的活性的CTL克隆。
用MPHOSPH1-A24-9-278(IYNEYIYDL(SEQIDNO:7))(图3A)和 MPHOSPH1-A24-10-278(IYNEYIYDLF(SEQIDNO:8))(图3B)刺激的CTL 克隆针对经肽冲击的靶显示了强力的特异性CTL活性，而对未经任何肽冲 击的靶未显示任何显著的特异性CTL活性。这说明所述CTL克隆具有肽特 异性细胞毒性。
针对表达MPHOSPH1的靶细胞的特异性CTL活性
检验了建立的针对这些肽生成的CTL克隆识别内源表达MPHOSPH1和 HLA-A*2402的靶细胞的能力。用全长MPHOSPH1基因和HLA-A*2402分 子二者转染的COS7是内源表达MPHOSPH1和HLA-A*2402的靶细胞的一 种具体模型，使用通过MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)生成的CTL 克隆作为效应细胞测试了针对这种COS7的特异性CTL活性。制备了用全 长MPHOSPH1转染但未用HLA-A*2402转染的COS7，以及用HLA-A*2402 转染但是未用全长MPHOSPH1转染的COS7作为对照。CTL克隆针对用 MPHOSPH1和HLA-A24二者转染的COS7具有最高的特异性CTL活性。 然而，该CTL克隆针对未用MPHOSPH1或HLA-A24转染的COS7未显示 显著的特异性CTL活性(图4)。
这些结果清楚地表明，MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)与 HLA-A24分子一起在靶细胞表面天然表达，并且被CTL所识别。
针对内源表达MPHOSPH1的膀胱癌细胞系的CTL活性
检验了建立的针对MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)肽生成的 CTL克隆识别内源表达MPHOSPH1的肿瘤细胞的能力。使用针对 MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)生成的CTL克隆作为效应细胞试验 了针对内源表达MPHOSPH1和HLA-A24的HT1376细胞的CTL活性。使 用内源表达MPHOSPH1但是不表达HLA-A24的J82细胞和RT-4细胞作为 靶细胞。建立的CTL克隆针对表达MPHOSPH1和HLA-A24二者的HT1376 细胞显示出高IFN-γ产生。另一方面，所述CTL针对表达MPHOSPH1但是 不表达HLA-A24的J82和RT-4细胞未显示显著的CTL活性(图5)。这清楚 地表明MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)肽与HLA-A24一起天然地移 至(processedto)肿瘤细胞表面，并且被CTL所识别。
在BALB/c小鼠中使用MPHOSPH1-A24-9-278肽进行的体内CTL诱导
已知H-2Kd分子(小鼠I类MHC之一)具有类似于HLA-A24分子的肽锚 基序(peptideanchormotif)，并且与HLA-A24限定性肽部分地交叉反应。其 后发明人使用BALB/c小鼠进行MPHOSPH1-A24-9-278肽接种(H-2Kd)来检 验了该肽是否在体内诱导CTL。在第0天和第7天将IFA缀合的肽皮下注射 入BALB/c小鼠。在第14天，收集脾细胞并且作为应答细胞用于ELISPOT 测定。与仅注射IFA的对照小鼠(nega1～3)相比，所有注射了肽的小鼠(Ani1～5) 的脾细胞显示出强力的IFN-γ产生(图6)。这个数据表明 MPHOSPH1-A24-9-278肽即使在体内也能够引发CTL应答。
使用预测的来自MPHOSPH1的HLA-A*0201限定性肽刺激T细胞
如图7中所示，通过IFN-γELISPOT测定法评估了得到的具有可检测的 特异性CTL活性的CTL。如图7A中所示，用MPHOSPH1-A2-9-282 (YIYDLFVPV(SEQIDNO:9))刺激的1号和5号孔中的细胞与对照相比显示 出强力的IFN-γ产生。如图7B中所示，用MPHOSPH1-A2-9-638(RLAIFKDLV (SEQIDNO:10))刺激的8号孔中的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产 生。如图7C中所示，用MPHOSPH1-A2-10-1714(TMSSsKLSNV(SEQIDNO: 11))刺激的4号孔中的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。
如图8A(MPHOSPH1-A2-9-282(SEQIDNO:9))、图8B (MPHOSPH1-A2-9-638(SEQIDNO:10))和图8C(MPHOSPH1-A2-10-1714 (SEQIDNO:9))中所示，扩增了阳性孔中的这些细胞，并且建立了针对用肽 冲击的靶的特异性CTL活性高于针对未用肽冲击的靶的活性的CTL细胞系。
通过MPHOSPH1-A2-9-282(YIYDLFVPV(SEQIDNO:9))刺激的CTL 克隆(图9A和9B)针对用肽冲击的靶显示了强力的特异性CTL活性，而对未 用任何肽刺激的靶没有任何显著的特异性CTL活性。
使用预测的来自DEPDC1的HLA-A*2402限定性肽刺激T细胞
根据上文“材料和方法”部分所述方案生成了源自DEPDC1的那些肽的 CTL。如通过IFN-γELISPOT测定法所评估的，得到的具有可检测特异性 CTL活性的CTL示于图10。如图10A中所示，用DEPDC1-A24-9-294 (EYYELFVNI(SEQIDNO:12))刺激的10号孔中的细胞与对照相比显示了 强力的IFN-γ产生。因此，将阳性孔中的细胞扩增并且进行有限稀释。如图 10B(DEPDC1-A24-9-294(SEQIDNO:12))中所示，建立了针对经肽冲击的 靶的特异性CTL活性高于针对未经肽冲击的靶的活性的CTL克隆。通过 DEPDC1-A24-9-294(EYYELFVNI(SEQIDNO:12))刺激的CTL克隆(图11) 针对经肽冲击的靶显示了强力的特异性CTL活性，而对未经任何肽冲击的 靶没有任何显著的特异性CTL活性。该结果表明所述CTL克隆具有肽特异 性细胞毒性。
针对表达DEPDC1和HLA-A*2402的靶细胞的特异性CTL活性
检查了建立的针对这些肽生成的CTL克隆识别内源表达DEPDC1和 HLA-A*2402的靶细胞的能力。用全长DEPDC1基因和HLA-A*2402分子二 者转染的COS7充当内源表达DEPDC1和HLA-A*2402的细胞的一种具体 模型，使用通过DEPDC1-A24-9-294(EYYELFVNI(SEQIDNO:12))生成的 CTL克隆作为效应细胞测试了针对这种COS7的特异性CTL活性。制备了 用全长DEPDC1转染但未用HLA-A*2402转染的COS7，以及用HLA-A*2402 转染但是未用全长DEPDC1转染的COS7作为对照。CTL克隆针对用 DEPDC1和HLA-A24二者转染的COS7显示了高度的特异性CTL活性。然 而，该CTL克隆针对未用MPHOSPH1或HLA-A24转染的COS7未显示显 著的特异性CTL活性(图12)。
这些结果清楚地表明，DEPDC1-A24-9-294(EYYELFVNI(SEQIDNO: 12))与HLA-A24分子一起在靶细胞表面天然表达，并且被CTL所识别。
针对内源表达DEPDC1的膀胱癌细胞系的CTL活性
检验了建立的针对DEPDC1-A24-9-294肽生成的CTL克隆识别内源表 达DEPDC1的肿瘤细胞的能力。使用针对DEPDC1-A24-9-294生成的CTL 克隆作为效应细胞试验了针对内源表达DEPDC1和HLA-A24的HT1376细 胞的CTL活性。使用内源表达DEPDC1但是不表达HLA-A24的J82细胞和 RT-4细胞作为靶细胞。建立的CTL克隆针对表达DEPDC1和HLA-A24二 者的HT1376细胞显示出高IFN-γ产生。另一方面，所述CTL针对表达 DEPDC1但是不表达HLA-A24的J82和RT-4细胞未显示显著的CTL活性(图 13)。这清楚地表明DEPDC1-A24-9-294与HLA-A24分子一起天然地移至肿 瘤细胞表面，并且被CTL所识别。
在BALB/c小鼠中使用DEPDC1-A24-9-294肽进行的体内CTL诱导
已知H-2Kd分子(小鼠I类MHC之一)具有类似于HLA-A24分子的肽锚 基序，并且与HLA-A24限定性肽部分地交叉反应。其后发明人使用BALB/c 小鼠通过用DEPDC1-A24-9-294肽接种(H-2Kd)检验了这种肽是否在体内诱 导CTL。在第0天和第7天将IFA缀合的肽皮下注射入BALB/c小鼠。在第 14天，收集脾细胞并且作为应答细胞用于ELISPOT测定。与仅注射IFA的 对照小鼠(nega1、2)相比，所有注射了肽的小鼠(Ani1～5)的脾细胞显示出强力 的IFN-γ产生(图14)。这个数据表明DEPDC1-A24-9-294肽即使在体内也能 够引发CTL应答。
使用预测的来自DEPDC1的HLA-A*0201限定性肽刺激T细胞
图15和表6中所示为通过IFN-γELISPOT测定法筛选时得到的具有可 检测的特异性CTL活性的CTL。用DEPDC1-A02-10-644((SLMIHTFSRC SEQIDNO:240))刺激的4号和7号孔中的细胞与对照相比显示出强力的 IFN-γ产生。用DEPDC1-A02-10-575(SLLPASSMLT(SEQIDNO:241))刺激 的2号孔中的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。用DEPDC1- A02-10-506(QLCRSQSLLL(SEQIDNO:243))刺激的7号孔中的细胞与对照 相比显示出强力的IFN-γ产生。用DEPDC1-A02-10-765(KQFQKEYPLI(SEQ IDNO:244))刺激的1号孔中的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。 用DEPDC1-A02-10-395(IMGGSCHNLI(SEQIDNO:249))刺激的1号孔中 的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。用DEPDC1-A02-10-224 (NMANTSKRGV(SEQIDNO:253))刺激的1号和2号孔中的细胞与对照相 比显示出强力的IFN-γ产生。用DEPDC1-A02-9-297(ELFVNILGL(SEQID NO:226))刺激的4号孔中的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。用 DEPDC1-A02-10-296(YELFVNILGL(SEQIDNO:254))刺激的3号和4号孔 中的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。用DEPDC1-A02-10-301 (NILGLLQPHL(SEQIDNO:255))刺激的2号、3号、5号和7号孔中的细胞 与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。用DEPDC1-A02-9-598(LLQPHLERV (SEQIDNO:192))刺激的6号孔中的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产 生。用DEPDC1-A02-9-619(LLMRMISRM(SEQIDNO:195))刺激的6号孔 中的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。用DEPDC1-A02-9-290 (LLTFEYYEL(SEQIDNO:197))刺激的2号孔中的细胞与对照相比显示出强 力的IFN-γ产生。用DEPDC1-A02-9-563(RLCKSTIEL(SEQIDNO:209))刺 激的5号孔中的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。用 DEPDC1-A02-9-653(CVLCCAEEV(SEQIDNO:225))刺激的1号和3号孔中 的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。用DEPDC1-A02-10-674 (FLMDhHQEIL(SEQIDNO:228))刺激的1号孔中的细胞与对照相比显示出 强力的IFN-γ产生。最后，用DEPDC1-A02-10-302(ILVVcGYITV(SEQIDNO: 230))刺激的2号和6号孔中的细胞与对照相比显示出强力的IFN-γ产生。
通过DEPDC1-A02-10-296(YELFVNILGL(SEQIDNO:254))和 DEPDC1-A02-9-653(CVLCCAEEV(SEQIDNO:225))刺激的CTL细胞系(图 16)针对经过肽冲击的靶显示了强力的特异性CTL活性，而针对未经任何肽 冲击的靶未显示任何显著的特异性CTL活性。这表明所述CTL克隆具有肽 特异性细胞毒性。
[表6]
候选的来自DEPDC1的HLA-A*0201限定性肽
针对表达DEPDC1和HLA-A*0201的靶细胞的特异性CTL活性
检验了建立的针对DEPDC1-A02-10-296肽(YELFVNILGL(SEQIDNO: 254))和DEPDC1-A02-9-653肽(CVLCCAEEV(SEQIDNO:225))生成的CTL 克隆识别内源表达DEPDC1和HLA-A2的靶细胞的能力。首先，我们为了 有效地测定特异性CTL应答建立了组成型表达HLA-A*0201的HEK293细 胞系(HEK-A2)。用全长DEPDC1基因转染的HEK-A2细胞是表达DEPDC1 和HLA-A2的靶细胞的一种具体模型，使用建立的通过DEPDC1-A02-10-296 (YELFVNILGL(SEQIDNO:254))或DEPDC1-A02-9-653(CVLCCAEEV (SEQIDNO:225))生成的CTL细胞系作为效应细胞测试了针对这种HEK-A2 细胞的特异性CTL活性。制备了用表达模拟物(Mock)的载体转染的HEK-A2 和用源自DEPDC1的非对应肽(nocorrespondingpeptidederivedfrom DEPDC1)冲击的HEK-A2作为阴性对照。建立的CTL细胞系针对DEPDC1 转染的HEK-A2显示出特异性CTL活性。另一方面，该CTL细胞系针对用 表达模拟物的载体转染的HEK-A2和用DEPDC1-A02-9-674肽或 DEPDC1-A02-9-462肽刺激的HEK-A2未显示显著的特异性CTL活性(图 17)。这清楚地表明DEPDC1-A02-10-296和DEPDC1-A02-9-653与HLA-A2 分子一起天然移至靶细胞表面并且被CTL所识别。
抗原肽的同源性分析
针对本发明的肽建立的CTL显示了强力的特异性CTL活性。这提示 MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)、MPHOSPH1-A24-10-278(SEQID NO:8)、MPHOSPH1-A2-9-282(SEQIDNO:9)、MPHOSPH1-A2-9-638(SEQ IDNO:10)、MPHOSPH1-A2-10-1714(SEQIDNO:11)、DEPDC1-A24-9-294 (SEQIDNO:12)、DEPDC1-A2-9-589(SEQIDNO:192)、DEPDC1-A2-9-619 (SEQIDNO:195)、DEPDC1-A2-9-290(SEQIDNO:197)、DEPDC1-A2-9-563 (SEQIDNO:209)、DEPDC1-A2-9-653(SEQIDNO:225)、 DEPDC1-A2-10-674(SEQIDNO:228)、DEPDC1-A2-10-302(SEQIDNO: 230)、DEPDC1-A02-10-644(SEQIDNO:240)、DEPDC1-A02-10-575(SEQID NO:241)、DEPDC1-A02-10-506(SEQIDNO:243)、DEPDC1-A02-10-765 (SEQIDNO:244)、DEPDC1-A02-10-395(SEQIDNO:249)、 DEPDC1-A02-10-224(SEQIDNO:253)、DEPDC1-A02-9-297(SEQIDNO: 226)、DEPDC1-A02-10-296(SEQIDNO:254)和DEPDC1-A02-10-301(SEQ IDNO:255)的序列可能与源自其它已知使人免疫系统致敏的分子的肽同源。 为了排除这种可能性，使用BLAST算法 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)以上述肽序列作为查询项进行了 同源性分析。没有发现显著的序列同源性。
这些结果提示MPHOSPH1-A24-9-278(SEQIDNO:7)、 MPHOSPH1-A24-10-278(SEQIDNO:8)、MPHOSPH1-A2-9-282(SEQIDNO: 9)、MPHOSPH1-A2-9-638(SEQIDNO:10)、MPHOSPH1-A2-10-1714(SEQ IDNO:11)、DEPDC1-A24-9-294(SEQIDNO:12)、DEPDC1-A2-9-598(SEQ IDNO:192)、DEPDC1-A2-9-619(SEQIDNO:195)、DEPDC1-A2-9-290(SEQ IDNO:197)、DEPDC1-A2-9-563(SEQIDNO:209)、DEPDC1-A2-9-653(SEQ IDNO:225)、DEPDC1-A2-10-674(SEQIDNO:228)、DEPDC1-A2-10-302 (SEQIDNO:230)DEPDC1-A02-10-644(SEQIDNO:240)、 DEPDC1-A02-10-575(SEQIDNO:241)、DEPDC1-A02-10-506(SEQIDNO: 243)、DEPDC1-A02-10-765(SEQIDNO:244)、DEPDC1-A02-10-395(SEQID NO:249)、DEPDC1-A02-10-224(SEQIDNO:253)、DEPDC1-A02-9-297(SEQ IDNO:226)、DEPDC1-A02-10-296(SEQIDNO:254)和DEPDC1-A02-10-301 (SEQIDNO:255)的序列是独特的，因此它们引起不期望的对任何不相关分 子的免疫应答的风险较低。
讨论
对新的TAA，尤其是诱导强力且特异性的抗肿瘤免疫应答的TAA的鉴 定，为人们进一步开发肽接种策略在多种类型的癌症中的临床应用提供了保 证(BoonT.等,(1996)JExpMed183:725-9.；vanderBruggenP等,(1991) Science254:1643-7.；BrichardV等,(1993)JExpMed178:489-95.；Kawakami Y等,(1994)JExpMed180:347-52.；ShichijoS等,(1998)JExpMed 187:277-88.；ChenYT等,(1997)Proc.Natl.Acd.Sci.USA,94:1914-8.；Harris CC.,(1996)JNatlCancerInst88:1442-5.；ButterfieldLH等,(1999)CancerRes 59:3134-42.；VissersJL等,(1999)CancerRes59:5554-9.；vanderBurgSH等, (1996)J.Immunol156:3308-14.；TanakaF等,(1997)CancerRes57:4465-8.； FujieT等,(1999)IntJCancer80:169-72.；KikuchiM等,(1999)IntJCancer81: 459-66.；OisoM等,(1999)IntJCancer81:387-94.)。
DNA微阵列技术能够揭示恶性细胞的基因表达综合谱(LinYM,等, Oncogene.2002Jun13；21:4120-8.；KitaharaO,等,CancerRes.2001May 1；61:3544-9.；SuzukiC,等,CancerRes.2003Nov1；63:7038-41.；AshidaS, CancerRes.2004Sep1；64:5963-72.；OchiK,等,IntJOncol.2004 Mar；24(3):647-55.；KanetaY,等,IntJOncol.2003Sep；23:681-91.；ObamaK, Hepatology.2005Jun；41:1339-48.；KatoT,等,CancerRes.2005Jul 1；65:5638-46.；KitaharaO,等,Neoplasia.2002Jul-Aug；4:295-303.； Saito-HisaminatoA等,DNARes2002,9:35-45.)，并且可应用于鉴定潜在的 TAA。在多种癌症中上调的转录物中，使用这些技术鉴定了两种分别称为 MPHOSPH1和DEPDC1的新的人基因。
如上所述，MPHOSPH1和DEPDC1在多种癌症中过表达，但是在正常 组织中显示的表达极低。此外，已经证明了这些基因具有与细胞增殖相关的 重要功能(参见PCT/JP2006/302684)。因此，源自MPHOSPH1和DEPDC1 的肽能够充当TAA表位，进而能够用于诱导显著且特异性的针对癌细胞的 免疫应答。
因此，由于MPHOSPH1和DEPDC1是新的TAA，所以使用这些表位肽 的疫苗可用作针对多种癌或表达这些分子的其它疾病的免疫治疗剂。
实施例2
材料和方法
肽和佐剂
合成的GMP级肽购自NeoMultiPeptideSystem(MPS)(SanDiego,CA)。 作为佐剂，使用不完全弗氏佐剂(IFA)(MONTANIDE*ISA51)。用1mgIFA 乳化1mg适合的肽。
抗原表达
发明人进行了免疫组织化学分析。将获得自外科手术或活检的来自膀胱 癌的肿瘤细胞或肿瘤组织用各种MPHOSPH1和DEPDC1特异性多克隆抗体 染色。染色的方案在HumanGenomeCenter,InstituteforMedicalScience,the UniversityofTokyo(东京大学医学科学研究所人类基因组中心)建立，如先前 所述(KanehiraM等CancerRes.；67(7):3276-3285,2007.,KanehiraM等 Oncogene.2007Apr23；[在印刷之前以电子形式公开])。HLA-A*2402表达 的试验在SRL(Tachikawa,Japan)进行。
纳入试验的患者
纳入试验的标准如下；
1.不能手术治疗的复发性膀胱癌患者，先前经过标准化疗治疗并且失 败。
2.按日本标准的表现状态(performancestatus)为0或1的患者。
3.20周岁至80周岁的患者
4.患有在治疗前能够由图像检查(CT/MRI)识别的原发性肿瘤或转移的 患者，不考虑RECIST指标(RECISTguideline)
5.前次治疗(外科手术、化疗、放射治疗、热疗、其它免疫疗法等)过后 超过4周的患者
6.预测超过3个月的预后的患者
7.具有骨髓功能(WBC大于2000，小于15000，血小板大于50000)、肝 功能(GOT小于150，GPT小于150,T-bil小于3.0)、肾功能的患者(Cr小于 3.0)
8.具有HLA-A*2402的患者
9.患者的肿瘤表达MPHOSPH1和/或DEPDC1
排除的标准如下：
1.妊娠中的患者
2.实施母乳喂养的患者
3.有妊娠意愿的患者
4.患有不可控制的感染的患者
5.在临床试验期间必需以下药物的患者
系统施用类固醇
系统施用免疫抑制剂
6.医生或首席研究者认为不应纳入在此项试验中的患者
方案
对纳入试验的具有HLA-A*2402且其肿瘤表达M期磷蛋白1 (MPHOSPH1)和/或含DEP结构域的蛋白1(DEPDC1)的膀胱癌患者，用 HLA-A*2402限定性表位肽MPHOSPH1-9-278(IYNEYIYDL(SEQIDNO:7)) 和/或DEPDC1-9-294(EYYELFVNI(SEQIDNO:12))进行免疫。将每种肽与 1mL不完全弗氏佐剂(IFA,MONTANIDE*ISA51)混合，每周一次皮下注射至 腋窝或腹股沟的病灶(axillaryoringuinallesion)。四次注射定义为一疗程，然 后在1个疗程之后为了进行免疫学和临床评估，抽取血液并且进行CT/MRI。
安全性评估
根据NationalCancerInstitute-CommonToxicityCriteriaversion3(国立癌 症研究所-普通毒性标准第3版)(NCI-CTCver.3)进行不良作用评估。
免疫学评估
这是本研究中的次要终点之一，我们确认是否产生了肽特异性CTL应 答。如下测量特异性CTL应答；收集外周血单个核细胞，并且用适当的肽 再次刺激。在第14天通过IFN-gELISPOT测定法检验CTL应答。
抗肿瘤效果评估
根据RECIST标准进行临床响应的评估。
结果
表7显示了此项临床试验的总结。不存在严重的不良作用，除了病例3 的2级疹(Grade2ofexanthema)。获得了一例轻微响应(病例3)和一例混合响 应(病例4)。5例中的4例表达MPHOSPH1，而全部5例均表达DEPDC1。
[表7]
NT：未测试
病例2
在病例2中，将标准化疗失败的患有极晚期膀胱癌的72周岁女性纳入 此项临床试验中。在图18中，她的肿瘤的抗原表达情况显示MPHOSPH1 和DEPDC1均强烈表达。因此，我们为其接种了两种源自MPHOSPH1和 DEPDC1的表位肽。病例2存在膀胱癌的局部复发。根据RECIST标准评价 为稳定疾病(stabledisease；SD)(图19)。
病例3
在病例3中，将标准化疗失败的患有极晚期膀胱癌的49周岁男性纳入 此项临床试验中。仅DEPDC1为强烈表达(图20)。因此，我们仅为其接种了 源自DEPDC1的表位肽。病例3具有膀胱癌的多处肺部转移。在肺部转移的 右叶(图21)和左叶(图22)中，发展速率在接种之后降低。特别是肿瘤大小在 三个疗程之后减小。图23显示了按照RECIST标准的抗肿瘤效果。其清楚 地表明转移肿瘤的进展速率在接种之后降低。这说明通过使用源自DEPDC1 的表位肽的接种获得了轻微响应。病例3中的免疫学评估在接种之前和之后 测量了特异性CTL应答。在接种之后特异性CTL应答显示强烈(图24)。这 清楚地说明由源自DEPDC1的表位肽诱导的CTL可以显示抗肿瘤效果。
病例4
在病例4中，将标准化疗失败的患有极晚期膀胱癌的74周岁男性纳入 此项临床试验中。他的肿瘤表达MPHOSPH1和DEPDC1(图25)。因此，我 们为其接种了两种源自MPHOSPH1和DEPDC1的表位肽。病例4存在膀胱 癌的局部复发。在1个疗程的接种之后，按照RECIST标准肿瘤大小降低了 20％(图26)。然而，在肺部出现了新的转移灶。这说明通过使用两种源自 MPHOSPH1和DEPDC1的表位肽的接种获得了混合响应。
讨论
该临床试验的原理如下所述；
1.由于MPHOSPH1和DEPDC1在除睾丸之外的正常组织中表达，两种 抗原均有高度的肿瘤特异性。
2.认为这些肽具有强免疫原性，因为通过这些表位肽建立了强力且特异 性的CTL。
3.60％的日本人群体具有HLA-A*2402。
4.这些肽在化学上足够稳定，可应用于临床试验。
此项研究的目的是获得其毒性、免疫应答和抗肿瘤活性的临床信息。
先前报导的使用肽的疫苗临床试验的副作用是fur样症状(fur-like symptom)，诸如发热、头痛和不适。在极少的情况下，报导了带有水疱的激 烈皮肤反应(radicalskinreactionwithblister)，其被认为是注射位点处的短暂 交叉反应。在此项研究中，除了病例3的2级疹之外没有严重不良作用。该 患者在化疗过程中有过出疹的临床史。说明这种不良作用并非该接种所致， 因此本方案可能是安全的。
通过在接种后的特异性CTL诱导进行了免疫学分析。在病例1中，在 接种后未获得特异性CTL应答(数据未显示)。在病例3中，在第一疗程和第 二疗程的接种之后清楚地显示了针对源自DEPDC1的肽的特异性CTL应答。 在病例3中，通过接种获得了抗肿瘤效果。清楚地表明这种源自DEPDC1 的肽通过诱导特异性CTL显示了针对膀胱癌的抗肿瘤效果。
在病例4中，仅接种第一个疗程之后，就明显获得了针对膀胱癌局部复 发的抗肿瘤效果。这项证据强烈地支持这一结论，即这些表位肽表现出针对 膀胱癌的抗肿瘤效果。
总的来说，阐明了这种表位疗法是安全的，并显示强的抗肿瘤效果而无 严重的不良作用。
[工业实用性]
本发明鉴定了新的TAA，具体而言鉴定了诱导强力且特异性的抗肿瘤免 疫应答的那些TAA。这些TAA为针对与MPHOSPH1和/或DEPDC1相关的 疾病例如癌症的肽疫苗的进一步开发提供了保证。
本文提及的所有专利、专利申请和出版物均通过提述并入。
尽管已经详细地并且参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但应该 理解前述内容本质上是示例性和解释性的，旨在说明本发明及其优选实施方 案。通过常规实验，本领域技术人员将轻易地认识到可对本发明进行各种变 化和修改而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明并不意欲受到上述说 明的限定，而由附加的权利要求及其等同物限定。