技术领域
本发明属于葡萄糖酸钙生产技术领域，尤其涉及用固定化复合酶制取葡萄糖酸钙的方法。
背景技术
葡萄糖酸钙是一种用途极广的多羟基有机酸盐，由于其无毒，原料来源广泛的特性，主要用作食品的钙强化剂与营养剂、缓冲剂、固化剂、鳌合剂，应用前景十分广阔。食品级葡萄糖酸钙作为一种重要的食品添加剂,在食品中的应用前景光明, 可以作为营养增补剂、 品质改良剂等；医药级葡萄糖酸钙，可以作为人体的钙补充剂，钙是体内含量最大的无机物，为维持人体神经，肌肉，骨骼系统，细胞膜和毛细血管通透性正常功能所必需。钙离子是许多酶促反应的重要激活剂，对许多生理过程是必需的，如神经冲动传递，平滑肌和骨骼肌的收缩，肾功能，呼吸和血液凝固等。可调节人体酸碱平衡，保证神经肌肉的正常作用。葡萄糖酸钙是一种多羟基羧酸钙，英文名称：Calcium Gluconate，化学名称：五羟基已酸钙，分子式：Ca(C6H11O7)2，分子量：430.40，本品为白色结晶性或颗粒性粉末，熔点201℃（分解），无臭，无味，易溶于沸水（20g/100ml），略溶于冷水（3g/100ml，20℃），不溶于乙醇或乙醚等有机溶剂。水溶液显中性（pH约6-7）。
目前葡萄糖酸钙的生产方法主要有电解氧化法、溴化法、金属催化合成法、发酵法等。
黑曲霉发酵法生产葡萄糖酸钙，需要对糖质原料进行灭菌，因此会造成发酵液脱色困难。发酵配料需要添加多种营养盐，引入杂质，会造成提纯成本上升。而且所得葡萄糖酸钙产品纯度较低；电解氧化法在工业生产中能耗大， 不易控制， 工业化生产中很少采用；金属催化合成法一般使用重金属的催化剂，容易引起重金属超标，不适宜用于食品添加剂，葡萄糖酸钙的使用范围受到限制。
《食品与药品》2011年第13卷第9期，杜婵娟等， 固定化酶法制备葡萄糖酸钙的研究，提到了葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶共价固定到经戊二醛预处理的壳聚糖上,用所得固定化酶催化葡萄糖转化为葡萄糖酸钙，结果固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的回收率分别为86.9%和54.3%。但是，该固定材料的价格成本较高，酶的固定化率和回收率较低。
发明内容
本发明的目的在于，在现有的双酶法生产葡萄糖酸钙方法的基础上，提供了一种固定化复合酶制取葡萄糖酸钙的方法，将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入海藻酸钠和硅胶混合溶液，再滴入氯化钙溶液中固定成型；将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶进行固定化，实现酶液分离，提高了葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的重复利用率，降低酶的使用成本，节约了生产成本，通过本法生产的葡萄糖酸钙产品纯度高并符合当前国家对企业节能环保的要求。
本发明的反应原理为：
。
本发明的一种固定化复合酶制取葡萄糖酸钙的方法技术方案为：包括以下步骤：
（1）将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入已经消毒冷却的海藻酸钠与硅胶混合溶液，充分搅拌均匀；
（2）将混有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的海藻酸钠与硅胶混合溶液滴入已经消毒冷却的氯化钙溶液中固定成型，形成固定化酶；
（3）将葡萄糖配制成10-15%(W/V)的浓度，消毒冷却后置于反应罐内，分批次加入碳酸钙固体；
（4）反应罐中加入成型的固定化酶，开始反应；反应设置反应条件为：通入无菌空气，搅拌速度为200-300 r/min，酶反应温度为33-35℃；
（5）反应周期为18-36h，当反应液中还原糖浓度降至0.2%以下时，结束反应，停通气、搅拌，待反应体系静置分层；
（6）分层完毕，将上层反应液放出，进行脱色、浓缩结晶，然后经分离、干燥得到成品葡萄糖酸钙，固定化酶留在反应罐中重复利用，继续进行下一批反应。
步骤（1）中葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶质量比例为1：3-1：4。
步骤（1）海藻酸钠与硅胶混合溶液中，海藻酸钠浓度为1.0%-1.5%；以硅酸钠计硅胶浓度为1.0%-2.0%。
步骤（2）中，氯化钙溶液浓度为3-6%。
步骤（2）中，形成的固定化酶静止放置4-10小时，使固定强度更大。
步骤（3）中，碳酸钙质量为溶液中葡萄糖质量的5/18-1/3。
步骤（4）中，碳酸钙分批次加入反应体系，反应开始加入所需碳酸钙总量的1/3，反应6-10小时后，反应体系溶液比较澄清时加入剩余的碳酸钙。
步骤（4）中，反应罐压力保持在0.1-0.2MPa。
步骤（6）中，分离、干燥得到成品葡萄糖酸钙，是将葡萄糖酸钙溶液浓缩至干物质浓度为75%时，加入1%葡萄糖酸钙晶种结晶。
本发明的有益效果是：本发明提供一种固定化复合酶制取葡萄糖酸钙的方法，在现有的双酶法生产葡萄糖酸钙方法的基础上，进行了改进，将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶加入海藻酸钠和硅胶混合溶液，再滴入氯化钙溶液中固定成型；将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶进行固定化，实现酶液分离，提高了葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的重复利用率，降低酶的使用成本，节约了生产成本，通过本法生产的葡萄糖酸钙产品纯度高并符合当前国家对企业节能环保的要求。
本发明所采用的固定化材料价格低廉，葡萄糖氧化酶酶活固定化率高可达88.9%，过氧化氢酶酶活固定化率可达76.8%，可重复使用6次,相比现有技术，重复使用次数显著提高。
本发明采用硅胶与海藻酸钙杂化凝胶对葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶复合酶系统进行共固定化，硅胶在杂化凝胶中起到了骨架作用有利于底物分子的自由出入；海藻酸钙浓度越高杂化凝胶越至密阻止了酶蛋白的泄漏，但同时也不利于底物分子的自由出入。本发明找到了海藻酸钙与硅胶的最佳浓度配比，既能使底物分子自由出入又能有效固定化酶蛋白。硅藻土吸附法，酶分子容易脱落，酶蛋白固定化率低，单纯海藻酸钙包埋法，海藻酸钙浓度过高不利于底物的自由出入，浓度过低酶蛋白容易泄漏。
通过本法生产的葡萄糖酸钙成本低，但是纯度等同游离双酶法生产的葡萄糖酸钙，固定化复合酶法生产葡萄糖酸钙方法符合工业化大生产的要求。
附图说明
图1所示为实施例1所得产品的色谱分析图；
图2所示为葡萄糖酸钙标准校正曲线。
具体实施方式
实施例1：
（1）、配制1500mL海藻酸钠与硅胶混合溶液，海藻酸钠浓度为1.0%-1.5%，硅胶浓度为1.0%-2.0%（以硅酸钠计），121℃高温灭菌后冷却，把相当于反应液中葡萄糖质量2.5‰的葡萄糖氧化酶和7.5‰的过氧化氢酶加入其中加入其中，充分搅拌均匀；利用注射器，将混有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的海藻酸钠与硅胶混合溶液溶液滴入已经消毒冷却的6%氯化钙溶液中固定成型，静止放置4小时；使用无水葡萄糖，配制3.5L浓度为10%(W/V)的葡萄糖溶液，消毒冷却后置于5L反应罐内，首先加入32.4g碳酸钙固体；反应罐中加入成型的固定化酶，设置反应条件为：通入无菌空气，搅拌速度为200-300 r/min，酶反应温度为35℃；反应8小时后加入剩余的65.1g碳酸钙固体（碳酸钙稍微过量），继续反应18-30小时，反应液中还原糖浓度降为0.2%以下后，结束反应，停通气、搅拌，待反应体系静置分层；将上层反应液放出，按0.1%(W:V)加入活性炭于75 ℃下脱色1小时，过滤得滤液，在真空度为0.095MPa条件下，60℃蒸发，至干物质量百分比为70%，加入1%葡萄糖酸钙晶种结晶。用离心机分离得葡萄糖酸钙晶体。所得晶体在80℃下，烘干4小时，得成品葡萄糖酸钙。将母液真空浓缩至干物质量百分比为75%进行二次结晶，干燥后所得葡萄糖酸钙。两次结晶共制取葡萄糖酸钙414.3g，基于原料中葡萄糖质量的收率(收率定义为所得产品与投入葡萄糖的质量比)为118.3 %，所得葡萄糖酸钙纯度为99.30%。
（2）、反应完第一批的固定化酶留在反应罐中继续进行第二批反应，葡萄糖溶液浓度、加入碳酸钙固体的量以及反应条件均不变，如此反复进行反应可重复反应6次。平均反应周期为32h,基于原料中葡萄糖质量6次反应的平均收率(收率定义为所得产品与投入葡萄糖的质量比)为118.1%，根据线性方程计算所得，所生产葡萄糖酸钙平均纯度为99.61%。
将干燥所得产品进行色谱分析，色谱分析图如说明书附图图1所示，证明产品为葡萄糖酸钙。
实施例2：
（1）、配制16L海藻酸钠与硅胶混合溶液，海藻酸钠浓度为1.0%-1.5%，硅胶浓度为1.0%-2.0%（以硅酸钠计），121℃高温灭菌后冷却，把相当于反应液中葡萄糖质量2.5‰的葡萄糖氧化酶和1%的过氧化氢酶加入其中，充分搅拌均匀；利用带有多个注射器针头的蠕动泵，将混有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的海藻酸钠与硅胶混合溶液滴入已经消毒冷却的5%氯化钙溶液中固定成型，静止放置6小时；使用无水葡萄糖，配制70L浓度为10%(W/V)的葡萄糖溶液，消毒冷却后置于100L反应罐内，首先加入640g碳酸钙固体；反应罐中加入成型的固定化酶，设置反应条件为：通入无菌空气，搅拌速度为200-300 r/min，酶反应温度为35℃；反应8小时后加入剩余的1300g碳酸钙固体（碳酸钙稍微过量），继续反应18-30小时，反应液中还原糖浓度降为0.2%以下后，结束反应，停通气、搅拌，待反应体系静置分层；将上层反应液放出，按0.1%(W:V)加入活性炭于75 ℃下脱色1小时，过滤得滤液，在真空度为0.095MPa条件下，60℃蒸发，至干物质量百分比为70%，加入1%葡萄糖酸钙晶种结晶。用离心机分离得葡萄糖酸钙晶体。所得晶体在80℃下，烘干5小时，得成品葡萄糖酸钙。把母液真空浓缩至干物质量百分比为75%进行二次结晶，干燥后得葡萄糖酸钙产品。两次结晶共制取葡萄糖酸钙8298g。
固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶继续进行重复反应，反应7批以后反应周期延长，失去实际生产的意义，因此，固定化复合酶法生产葡萄糖酸钙反应7批后即停止反应。平均反应周期为33h,六批反应平均收率为：118.5%，葡萄糖酸钙纯度为：99.2%达到食品级要求。
实施例3
做对比实施例如下：
使用无水葡萄糖，配制70L浓度为10%(W/V)的葡萄糖溶液，消毒冷却后置于100L反应罐内，加入葡萄糖氧化酶和过氧化酶，先加入640g碳酸钙固体；设置反应条件为：通入无菌空气，搅拌速度为200-300 r/min，酶反应温度为33℃；反应6小时后加入剩余的1300g碳酸钙固体（碳酸钙稍微过量），继续反应20小时，反应液中还原糖浓度降为0.2%以下后，结束反应，停通气、搅拌，取出反应液，按0.7%(W:V)加入活性炭于75 ℃下脱色1小时，过滤得滤液，在真空度为0.095MPa条件下，60℃蒸发，至干物质量百分比为70%，加入1%葡萄糖酸钙晶种结晶。用离心机分离得葡萄糖酸钙晶体。所得晶体在80℃下，烘干6小时，得成品葡萄糖酸钙。把母液真空浓缩至干物质量百分比为75%进行二次结晶，干燥后得葡萄糖酸钙产品。两次结晶共制取葡萄糖酸钙8295.8g；反应周期为26h,产品收率为118.5%，葡萄糖酸钙纯度为99.6%。
固定化复合酶法生产葡萄糖酸钙与游离态复合酶法生产葡萄糖酸钙对比分析
（1） 从反应节约用电计算
固定化复合酶法产酸钙平均反应周期为33h,游离态酶法反应周期为26h 以生产6批计算
游离态酶法可节约用电
6*7*0.5=21（kw）合人民币11.55元。
（2） 从固定化载体费用计算
硅酸钠成本：16×2%×0.65=0.21元
海藻酸钠成本：16×1.5%×25=6元
氯化钙成本：15×6%×9=8.1元
氧化钙可重复使用3次因此实际成本为
8.1÷3=2.7
（3）从脱色过程活性炭用量比较计算
固定化复合酶法比游离态复合酶法生产葡萄糖酸钙节约活性炭成本为：70×（0.7-0.1）%×3=1.26元
（4）从所用酶的成本计算
每生产1公斤葡萄糖酸钙约需要酶的成本为1元（酶制剂厂家提供）
游离态复合酶法生产葡萄糖酸钙复合酶的成本为
8.29×6×1=49.74元
固定化复合酶法生产葡萄糖酸钙复合酶的成本为
8.29×1.3×1=10.78元
（5）总合上述4项进行计算
固定化复合酶法比游离态复合酶法生产葡萄糖酸钙节约成本为
49.74+1.26-11.55-0.21-6-2.7-10.78=19.76元
而且游离态酶法由于酶不容易与反应液分离，要用较多的活性炭进行脱色除蛋白，产生较多的废炭适成环境污染。