技术领域
本发明涉及白藜芦醇的提取方法及其获得的白藜芦醇和药物组合物，属于中药提取与应用技术领域。
背景技术
白藜芦醇是多酚类化合物，主要来源于葡萄（红葡萄酒）、虎杖、花生、桑椹等植物。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，又称为芪三酚，是肿瘤的化学预防剂，也是对降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂。美国农业部的研究结果表明，花生红衣与仁中也含有相当多的白藜芦醇。白藜芦醇的实验研究已经证实，其具有对心血管疾病和癌症的有益作用。白藜芦醇对骨质疏松、痤疮及老年痴呆症有预防作用，具有抗病毒及免疫调节等功能。
目前，从虎杖中提取白藜芦醇主要利用酶解法，如专利CN1251361A、CN101698634A等，提取溶剂大多为有机溶剂，这些方法都需经过酶解将虎杖苷转化为白藜芦醇。但这要求酶解过程温度需恒定，这样才能保证酶解充分，且酶解占用生产空间较大，酶解时间长，且发酵好的药材如果不及时处理，就会导致发酵物中白藜芦醇的含量降低，这就需要耗费较大的人力物力，导致生产效率降低，成本增高。中国专利CN1760166A公开了一种从虎杖中提取纯化白藜芦醇的新方法，该方法采用水提取，再将提取物中白藜芦醇甙通过酸催化水解反应富集出来，而后将富集产物以一定配比上预先处理好的大孔吸附树脂柱进行分离纯化，用水和乙醇洗脱。虎杖苷微溶于水，白藜芦醇难溶于水，用水做为溶剂提取，虎杖苷提取不完全，造成原料的浪费。虽然得到的白藜芦醇的纯度高，但是耗时耗能，生产周期长。中国专利CN10232093A公开了一种从虎杖根茎中提取白藜芦醇的新方法，包括粉碎、提取、浓缩、水解、析晶、过滤、干燥等步骤。该方法不需酶解、柱层析，直接用甲醇从虎杖中将虎杖苷及白藜芦醇提取出来，然后加酸把虎杖苷上的糖苷键进行分解，再加碱中和多余的酸，而得到含量大于50％的白藜芦醇的方法。虽然该发明不经柱层析，溶剂消耗小，操作简单，生产周期短、成本低，但是该发明的收率低，纯度低，且甲醇有一定的毒性。
汉防己甲素又名粉防己碱，来源于防己科植物粉防己的根，为无色针状结晶，熔点217-218℃，临床主要用于治疗早期轻度高血压，与小剂量放射合并用于癌症；亦用于单纯硅肺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期及各期煤硅肺。汉防己甲素通过降低过氧化物释放和吞噬细胞的活性而起到镇痛作用，还能通过抑制肿瘤耐药细胞表面β-糖蛋白的过度表达功能，增加化疗药物在肿瘤细胞内的积聚，增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
老年痴呆症的发病机制目前仍不明确，化学合成药物毒副作用大，大部分中药组合物的作用机理不明确，疗效不高、见效缓慢，剂型单调落后。
发明内容
为了解决现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供白藜芦醇的提取方法及其获得的白藜芦醇和药物组合物。本发明提供的白藜芦醇的提取方法，包括以下步骤：
（1）粉碎：将虎杖根茎粉碎，得细粉；
（2）提取：将步骤（1）得到的原料细粉用体积百分比浓度为85-95%乙醇回流提取3次，两次加入料液比分别为1:6-8g/mL、1:4-6g/mL、1:3-4g/mL的乙醇，第一次提取时间为3-4小时，第二次提取时间为2-3小时，第三次提取时间为1-2小时，提取温度均为80-85℃，每次提取后过滤，合并滤液；
（3）浓缩：将步骤（2）得到的滤液在80-85℃下减压浓缩至无醇味；
（4）水解：往步骤（3）得到的浓缩液中加入酸和稳定剂，在65-70℃下，搅拌，水解3-4小时；
（5）结晶：待步骤（4）的水解液自然冷却至室温，加碱调节水解液的pH至中性，静置结晶，过滤，减压干燥，得到白藜芦醇晶体。
所述的酸为硫酸、盐酸和醋酸中的至少一种，酸的浓度为3-5wt%，本发明人对酸的用量以及水解时间进行了认真的研究和和大量实验，发现酸的用量为步骤（3）得到的浓缩液重量的5.5-7%，3-4小时的水解时间，水解效果最佳，这可以使虎杖苷得到充分的转化，大大提高了收率。
考虑到白藜芦醇的稳定性，本发明人通过大量的试验，意外地发现水解时加入稳定剂，水解能更好地进行，这保证了转化出来的白藜芦醇的稳定性，从而保证了本工艺的高收率。当所述的稳定剂为柠檬酸钠，稳定剂的用量为步骤（3）得到的浓缩液重量的1.1-1.6%时，效果最佳。
所述的碱为氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氧化钙和氢氧化钙中的至少一种。
本发明还提供了由以上提取方法得到的白藜芦醇。
本发明还提供了一种治疗老年痴呆症的药物组合物，该药物组合物含有白藜芦醇和汉防己甲素。白藜芦醇对老年痴呆症有预防作用，但是本发明人经实验发现单独使用白藜芦醇治疗老年痴呆的效果并不理想，而发明人经过探索性试验发现，汉防己甲素化合物具有显著地抑制β淀粉样蛋白沉积的作用。Aβ蛋白的聚集与老年斑的形成以及老年痴呆症的发生和进展之间具有十分密切的关系，因此可见汉防己甲素可用于预防或治疗老年痴呆症，发明人再经过探索性试验，发现白藜芦醇和汉防己甲素联合使用时，其治疗老年痴呆症的效果优异。
发明人还探究了药物组合物中白藜芦醇和汉防己甲素的重量比为1：0.2-1，更优选为1：0.8。所述的药物组合物为片剂、胶囊剂、缓释胶囊剂、缓释片剂、混悬剂中的一种以上。
本发明提供白藜芦醇的提取方法及其获得的白藜芦醇和药物组合物的优点在于：
1、本发明的提取方法在现有技术的基础上进一步选择优化，经过认真的研究和大量的实验，寻找到从虎杖根茎中提取白藜芦醇的最佳参数及步骤，大大减少了溶剂的用量，也大大缩短了生产周期，克服了现有技术的不足。经反复的实验验证了本工艺稳定性好，可行性强。
2、本发明的提取方法直接使用乙醇回流提取，通过加酸水解将虎杖苷上的糖苷键分解，转化出更多游离的白藜芦醇，最后加碱中和多余的酸。本发明各参数、步骤的协同，将把虎杖根茎中的虎杖苷及白藜芦醇充分提取出来，大大提高了收率，同时本发明工艺简单，成本低，适用于工业化生产。
3、本发明的药物组合物可以显著地抑制β淀粉样蛋白沉积，其用于老年痴呆症的预防或治疗时疗效确切，剂量明确，可以显著延缓老年痴呆症的发病进程，大大改善患者的认知能力和生活质量。白藜芦醇和汉防己甲素均为天然植物中提取的活性成分，用于老年痴呆症的治疗或预防时毒副作用低，两者联用可以起到对老年痴呆症预防或治疗的协同作用。
具体实施方式
下面采用具体实施例进一步说明本发明的内容。
以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
实施例1、本发明白藜芦醇的提取方法：
将虎杖根茎粉碎，取细粉500g，加入85%的乙醇3000mL，在80-85℃回流提取3小时，过滤，收集第一次提取液。滤渣中加入85%的乙醇2000mL，在80-85℃回流提取2小时，过滤，收集第二次提取液。滤渣中加入85%的乙醇1500mL，在80-85℃回流提取1小时，过滤，收集第三次提取液。合并三次提取液，在80-85℃下减压浓缩至无醇味。加入浓缩液重量的5.5%的3wt%盐酸，加入浓缩液重量的1.1%的柠檬酸钠固体，在65-70℃搅拌水解3小时，自然冷却至室温，加10 wt %碳酸钠溶液调节pH至中性，放置过夜结晶，过滤，收集晶体进行减压干燥，得白藜芦醇9.7g，收率为1.94%。
实施例2、本发明白藜芦醇的提取方法：
将虎杖根茎粉碎，取细粉500g，加入95%的乙醇4000mL，在80-85℃回流提取4小时，过滤，收集第一次提取液。滤渣中加入95%的乙醇3000mL，在80-85℃回流提取3小时，过滤，收集第二次提取液。滤渣中加入95%的乙醇2000mL，在80-85℃回流提取2小时，过滤，收集第三次提取液。合并三次提取液，在80-85℃下减压浓缩至无醇味。加入浓缩液重量的7%的5 wt%盐酸，加入浓缩液重量的1.6%的柠檬酸钠固体，在65-70℃搅拌水解4小时，自然冷却至室温，加碳酸钠固体调节pH至中性，放置过夜结晶，过滤，收集晶体进行减压干燥，得白藜芦醇10.2g，收率为2.04%。
实施例3、本发明白藜芦醇的提取方法：
将虎杖根茎粉碎，取细粉5kg，加入90%的乙醇35L，在80-85℃回流提取3.5小时，过滤，收集第一次提取液。滤渣中加入90%的乙醇25L，在80-85℃回流提取2.5小时，过滤，收集第二次提取液。滤渣中加入90%的乙醇20L，在80-85℃回流提取1.5小时，过滤，收集第三次提取液。合并三次提取液，在80-85℃下减压浓缩至无醇味。加入浓缩液重量的6%的4 wt%硫酸，加入浓缩液重量的1.4%的柠檬酸钠固体，在65-70℃搅拌水解3.5小时，自然冷却至室温，加15 wt%碳酸钠溶液调节pH至中性，放置过夜结晶，过滤，收集晶体进行减压干燥，得白藜芦醇98g，收率为1.96%。
实施例4、本发明白藜芦醇的提取方法：
将虎杖根茎粉碎，取细粉500kg，加入90%的乙醇4000L，在80-85℃回流提取4小时，过滤，收集第一次提取液。滤渣中加入90%的乙醇3000L，在80-85℃回流提取3小时，过滤，收集第二次提取液。滤渣中加入90%的乙醇2000L，在80-85℃回流提取2小时，过滤，收集第三次提取液。合并三次提取液，在80-85℃下减压浓缩至无醇味。加入浓缩液重量的6%的4 wt%盐酸，加入浓缩液重量的1.4%的柠檬酸钠固体，在75-80℃搅拌水解2小时，自然冷却至室温，加10 wt%氢氧化钠溶液调节pH至中性，放置过夜结晶，过滤，收集晶体进行减压干燥，得白藜芦醇10.5kg，收率为2.10%。
对比例一、一种从虎杖根茎中提取白藜芦醇的新方法：
选取CN102320934A一种从虎杖根茎中提取白藜芦醇的新方法的实施例六。
表1
实施例 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例一 原料重量 500g 500g 5kg 500kg 500kg 产品（白藜芦醇）重量 9.7g 10.2g 98g 10.5kg 8.8kg 收率 1.94% 2.04% 1.96% 2.10% 1.76%
由表1可知，使用本发明的提取方法的收率明显高于对比例一，所以本发明的提取方法更优，而且本发明提取方法的提取剂用量少，提取次数少，而大大提高了收率，且工艺稳定，操作简单，参数明确，生产周期短，成本低，可行性强，适用于工业化生产。
实施例5、本发明药物组合物片剂的制备
白藜芦醇 25g 汉防己甲素 5g 淀粉 25g 糊精 35g 低取代羟丙基纤维素 5g 60%乙醇 适量 硬脂酸镁 1g
制备工艺：称取处方量的、白藜芦醇、汉防己甲素、淀粉、糊精和低取代羟丙基纤维素混合均匀。另取适宜量的60%乙醇，加入于混合粉末中，混合均匀后制软材，通过16目筛制粒，60℃以下干燥。干燥后完成后用18目筛进行整粒，筛出干粒中的细粉，与过筛的硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混和均匀，压片，即得。
实施例6、本发明药物组合物胶囊剂的制备
白藜芦醇 20g 汉防己甲素 20g 可压性淀粉 40g 乳糖 30 低取代羟丙基纤维素 5g 60%乙醇 适量
制备工艺：将处方中的各辅料过100目筛，称取白藜芦醇、汉防己甲素与可压性淀粉、乳糖和低取代羟丙基纤维素混合均匀后，加入60%乙醇溶液制软材，18目筛制颗粒，于60℃干燥，16目筛整粒，装填胶囊，即得。
实施例7、本发明药物组合物缓释片的制备
白藜芦醇 60g 汉防己甲素 48g 羧丙基甲基纤维素 30g 乳糖 2.5g 80%乙醇 适量 硬脂酸镁 0.12g
制备工艺：分别称取处方量的白藜芦醇、汉防己甲素、乳糖和羧丙基甲基纤维素粉碎后过80目筛后置于乳钵中混合均匀，加入适量80%乙醇制备软材，过筛制备湿粒，60-70℃干燥制备干颗粒后整粒，加入硬脂酸镁压片即可得到缓释片剂。
实施例8、本发明本发明药物组合物对D-半乳糖所致大鼠老年痴呆模型的治疗作用
1 材料
D-半乳糖为上海试剂二厂产品。避暗自动测试仪为成都泰盟科技有限公司产品。
2 实验方法
2.1 老年痴呆模型大鼠的建立：取鼠龄8～12周，体重260-300g的大鼠60只，随机分成6组：模型组、对照组、白藜芦醇组、汉防己甲素组、复方组。每组10只大鼠。除对照组外各治疗组大鼠每日按120mg/kg腹腔注射D-半乳糖，连续注射4周。各治疗组分别给予下述药物：
正常组：灌胃给予相同体积的生理盐水；
对照组：灌胃给予相同体积的生理盐水；
模型组：灌胃给予相同体积的生理盐水；
白藜芦醇组：灌胃给予白藜芦醇10mg/kg/d；
汉防己甲素组：灌胃给予汉防己甲素2mg/kg/d；
复方组：灌胃给予白藜芦醇10mg/kg/d和汉防己甲素2mg/kg/d；
2.2 避暗实验行为学检测
避暗自动测试仪的活动箱分明暗两室，两室之间有一洞口，箱底通以铜栅。正式实验前对各组大鼠进行训练，将大鼠头背着洞口放人明室．先适应环境3min，然后给暗室铜栅通36V电流，大鼠进入暗室后受到电击即逃到明室，铜栅持续通电5min，此为训练过程。24h后进行大鼠的记忆测验，记录大鼠第一次进入暗室的时间(避暗潜伏期)，若大鼠5min内仍未进入暗室。其潜伏期计作300s。
3 统计学方法
实验数据用±s表示，用SPSS11.5软件包进行统计分析，采用ANOVA和LSD’S posthoc test进行统计学分析，以P<0.05表示有显著性差异。
4 实验结果
表4 各给药组对老年痴呆模型大鼠避暗潜伏期的影响（±s）
组别 n 避暗潜伏期（s） 模型组 10 22.64±5.63 对照组 10 90.53±12.65 白藜芦醇组 10 95.23±11.25 汉防己甲素组 10 95.37±11.13 复方组 10 125.66±12.68
由表4可以看出，复方组相对于模型组大鼠避暗潜伏期显著延长（P＜0.01），提示复方组对老年痴呆大鼠模型具有显著的预防和治疗效果，其治疗效果优于白藜芦醇组和汉防己甲素组。具体表现为：
复方组的大鼠避暗潜伏期与模型组相比具有显著性差异，且复方组无论与白藜芦醇组还是汉防己甲素组，其大鼠避暗潜伏期均明显缩短，具有显著性差异。这表明白藜芦醇对大鼠老年痴呆模型的治疗作用与汉防己甲素对其治疗作用并不排斥，两种药物对老年痴呆大鼠模型存在协同作用。
本发明实施例8表明白藜芦醇与汉防己甲素可以联合使用，并能够取得治疗上的协同作用。