技术领域
本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种具有酸敏感性的生物可降解型两亲性三嵌段共聚物、其制备方法以及其作为药物载体的应用。
背景技术
全球每年有700多万人因患癌症失去生命，而且这个数字正在逐年上升。癌症的治疗是二十一世纪人类面临的最大考验和难题。
随着科学技术的不断发展与进步，人类对肿瘤学、分子生物学、药学及化学等相关科学的不断探索，使得对抗肿瘤药物的研究有了长足的进步，许多行之有效的抗癌药物被设计开发出来。但目前绝大多数抗癌药物存在毒副作用大和水溶性差的缺点，从而极大地限制了抗癌药物在临床中的应用。
两亲性聚合物一般由亲水和疏水两部分组成，它们能够在水溶液中形成具有核-壳结构的胶束。其中，疏水的聚合物链构成胶束的内核、亲水部分则形成外壳。由于大多数的高效抗癌药物都具有很强的疏水性，因此，聚合物胶束的疏水性内核可以用于装载疏水性抗癌药物，提高药物的水溶性并降低毒副作用；而亲水性的外壳可以起到稳定胶束的作用，并极大地提高了载药胶束的血液循环时间。
一般来说，肿瘤和炎症等病变组织内部的pH值都要比正常体液的pH值低，呈现出弱酸性。因此，可以利用这一特点进行药物载体的设计，将一些在酸性条件下易分解的组分引入两亲性聚合物中。它们在水溶液中组装成的胶束在中性条件下可以装载药物并稳定存在，但是在酸性条件下，酸敏感性基团或链段会发生断裂使胶束被破坏，从而可以将其内部包裹的药物快速地释放出来，这些酸敏感性基团包括缩醛基、腙键、原甲酸酯等。
在现有技术中，已有一些关于酸敏感性的两亲性共聚物用作药物载体的报道。但是，作为药物载体，应当具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且，作为抗肿瘤药物的载体，还应当具有下列特征：在水溶液中可以形成稳定的聚合物胶束，其疏水性内核可以装载疏水性抗癌药物，亲水性外壳起到稳定胶束、提高胶束血液循环时间的作用；当载药胶束到达肿瘤或病变组织时，能够利用局部组织的pH值较低的特点，破坏胶束，快速地释放出抗癌药物。
因此，需要寻求更多的酸敏感的两亲性共聚物。
发明内容
本发明的目的是，提供一种具有酸敏感性的两亲性三嵌段共聚物，该共聚物应具有良好的生物可降解性，可用作抗癌药物的载体；本发明的另一个目的是提供该两亲性三嵌段共聚物的制备方法及应用。
为达到上述目的，本发明的总体构思是：将开环聚合（ROP）和“点击”化学反应两种方法相结合，制备具有酸敏感性的两亲性三嵌段共聚物。首先利用双末端含羟基的聚乙二醇（HO-PEG-OH）与乙烯基氯乙基醚（CEVE）反应，并进一步与叠氮化钠反应制备末端含酸敏感性缩醛基和叠氮基团的二叠氮乙基二缩醛基聚乙二醇（N3-α-PEG-α-N3）；然后利用炔丙醇作为引发剂、辛酸亚锡为催化剂，对环酯单体进行开环聚合，得到单末端带有炔基的疏水性生物可降解聚酯（Polyester-C≡C）；最后，利用所制备的N3-α-PEG-α-N3与Polyester-C≡C发生“点击”化学反应，获得具有酸敏感性的生物可降解型两亲性三嵌段共聚物。
本发明具体的技术方案为：一种具有酸敏感性的两亲性三嵌段共聚物，由下列化学结构式表达：
；
式中，R1选自、或中的一种；n为30～90，m为32～192。
上述技术方案中，具有酸敏感性的基团为缩醛基，其化学结构式为：。该具有酸敏感性的生物可降解型两亲性三嵌段共聚物在结构上既含有疏水性的聚酯嵌段，可用于装载疏水性抗癌药物；又含有在酸性条件下可发生水解的缩醛基，在一定pH条件下缩醛基发生水解，胶束被破坏，从而快速地释放出被包裹在胶束内部的疏水性抗癌药物。
上述技术方案中，三嵌段共聚物的数均分子量范围是：12000～24000 g mol-1。
上述具有酸敏感性的两亲性三嵌段共聚物的制备方法，包括以下步骤：
(1)以双末端为羟基封端的聚乙二醇（HO-PEG-OH）与乙烯基氯乙基醚（CEVE）为原料，采用无水二氯甲烷作为溶剂，在对甲苯磺酸吡啶盐（PPTS）的催化下反应，制备末端含有二氯乙基二缩醛基的聚乙二醇（Cl-α-PEG-α-Cl）；其化学结构式为：
；
所述乙烯基氯乙基醚的结构式为 ；
其中，双末端为羟基封端的聚乙二醇的数均分子量范围为2000~12000 g mol-1，双末端为羟基封端的聚乙二醇（HO-PEG-OH）、对甲苯磺酸吡啶盐（PPTS）和乙烯基氯乙基醚（CEVE）的摩尔比为5∶1∶(25～50)；
(2)用步骤(1)获得的末端含有二氯乙基二缩醛基的聚乙二醇与叠氮化钠（NaN3）反应，制备末端含有二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇（N3-α-PEG-α-N3）；其结构式为：
；
所述末端含有二氯乙基二缩醛基的聚乙二醇与叠氮化钠的摩尔比为1∶(2～10)；
(3)用炔丙醇作为引发剂、辛酸亚锡[Sn(Oct)2]为催化剂，对环酯单体进行开环聚合，得到单末端带有炔基的疏水性生物可降解聚酯（Polyester-C≡C），所述环酯单体选自：ε-己内酯、丙交酯或三甲基环碳酸酯中的一种；
所述炔丙醇与环酯单体的摩尔比为1∶(30～90)；
(4)在“点击”化学反应催化剂和配体的存在下，采用步骤(2)获得的末端含有二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇（N3-α-PEG-α-N3）与步骤(3)获得的单末端带有炔基的疏水性生物可降解聚酯（Polyester-C≡C），通过“点击”化学法制备，获得具有酸敏感性的两亲性三嵌段共聚物（Polyester-α-PEG-α-Polyester），其结构式为：
，
其中，末端含有二叠氮乙基二缩醛基聚乙二醇、单末端带有炔基的疏水性生物可降解聚酯和催化剂的摩尔比为(2.1～2.4)∶1∶1；催化剂和配体的摩尔比为1∶(1～2)。
“点击”化学反应是一种新型、简单、高效、快速的合成方法，这种方法具有以下显著特点：(1) 所用原料和试剂容易获得；(2) 反应条件简单；(3) 产率高；(4) 立体选择性好；(5) 产物净化技术简单；(6) 产物稳定性好。众多的优点使得“点击”化学反应在高分子化学、材料修饰、生物医学等领域得到广泛应用。至今还没有文献报道类似于本发明中通过“点击”化学反应将亲水性聚乙二醇（PEG）链段和疏水性聚酯链段通过具有酸敏感性的缩醛基相连，形成ABA型三嵌段共聚物的结构。
上述技术方案中，步骤(4) 中，“点击”化学反应催化剂选自氯化亚铜或溴化亚铜；配体选自：联吡啶、五甲基二亚乙基三胺、四甲基乙二胺或六甲基三亚乙基四胺中的一种。
进一步的技术方案，在步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)完成后，分别对产物进行提纯处理，所述纯化过程包括以下步骤：
(i) 末端含有二氯乙基二缩醛基的聚乙二醇的纯化：在反应结束后，加入质量分数为5%的Na2CO3水溶液终止反应，加入二氯甲烷稀释后，用水萃取2～3遍，收集下层有机相，用无水硫酸镁干燥，将过滤得到的滤液浓缩，逐滴加入到冰正己烷中，过滤并将收集到的固体产物置于真空烘箱中干燥至恒重，得到白色产物；
所述Na2CO3与对甲苯磺酸吡啶盐的摩尔比为(25～50)∶1；二氯甲烷与Na2CO3水溶液的体积比为(4～8)∶1；
(ii) 末端含有二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇的纯化：在反应结束后，将反应混合液通过装有碱性Al2O3的柱子以除去溶液中的铜盐，减压除去溶剂，加入二氯甲烷稀释后，用水萃取2～3遍，收集下层有机相，用无水硫酸镁干燥，将过滤得到的滤液浓缩，逐滴加入体积比为1∶1的冰正己烷与冰乙醚的混合溶剂中，过滤并将收集到的固体产物置于真空烘箱中干燥至恒重，得到白色产物；
(iii) 单末端带有炔基的疏水性生物可降解聚酯的纯化：在反应结束后，减压除去部分溶剂，将浓缩液逐滴加入冰乙醚中，过滤并将收集到的固体产物置于真空烘箱中干燥至恒重，得到白色产物；
(iv) 具有酸敏感性的两亲性三嵌段共聚物的纯化：在反应结束后，加入四氢呋喃稀释反应混合液，并在搅拌的条件下与空气接触，使反应终止，待溶液变成绿色后，使其通过装有碱性Al2O3的柱子，减压除去溶剂，再将浓缩液逐滴加入冰乙醚中，过滤并将收集到的固体产物溶解于四氢呋喃、并装在截留分子量为12000～14000 Da的透析袋中用去离子水透析48～96 h，最后，将透析袋中所得到的无色透明溶液冷冻干燥，获得白色的固体产物。
所述四氢呋喃与固体产物的质量比为(10～50)∶1。
本发明公开了一种中间体，它是末端含有二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇，由下列化学结构式表达：
；
式中，m为32～192。
本发明同时请求保护上述具有酸敏感性的两亲性三嵌段共聚物作为刺激响应性药物载体的应用。
两亲性三嵌段共聚物Polyester-α-PEG-α-Polyester可以在水溶液中自组装形成胶束，疏水性聚酯链段形成胶束的核，用于包裹疏水性药物；亲水性PEG链段形成胶束的外壳，起到稳定胶束的作用；而疏水性聚酯链段和亲水性PEG链段之间具有酸敏感性的缩醛基，在弱酸性条件下会发生水解断裂，从而使胶束被破坏，快速地释放出装载在胶束核中的药物，因而可以用作高效的刺激敏感性药物载体。
由于上述方案的实施，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明采用了生物相容性良好的聚乙二醇和生物可降解的聚酯分别作为亲水性和疏水性的链段，以在酸性条件下可发生水解的缩醛基作为酸敏感性连接段，首次采用“点击”化学法制备了具有良好生物相容性和生物可降解性的酸敏感性两亲性三嵌段共聚物。
2、本发明中获得的具有酸敏感性的生物可降解型两亲性三嵌段共聚物在水中可自组装形成稳定的聚合物胶束，其疏水性内核可以装载疏水性抗癌药物，亲水性外壳起到稳定胶束、提高胶束血液循环时间的作用，当载药胶束到达肿瘤或病变组织时，局部pH值的降低会使缩醛基发生断裂，胶束被破坏，从而快速地释放出抗癌药物。因此，本发明公开的具有酸敏感性的生物可降解型两亲性三嵌段共聚物可以有效地装载并释放抗癌药物，在癌症的治疗方面，具有良好的应用价值。
附图说明
图1为实施例一中双末端含羟基的聚乙二醇、具有酸敏感性的末端含二氯乙基二缩醛基聚乙二醇（Cl-α-PEG135-α-Cl）和实施例二中末端为二叠氮乙基二缩醛基聚乙二醇（N3-α-PEG135-α-N3）的核磁共振氢谱图（1H NMR），溶剂为CDCl3。
图2为实施例三中单末端为炔基的聚己内酯（PCL30-C≡C）的核磁共振氢谱图（1H NMR），溶剂为CDCl3。
图3为实施例四中具有酸敏感性的生物可降解型两亲性三嵌段共聚物(PCL30-α-PEG135-α-PCL30)的核磁共振氢谱图（1H NMR），溶剂为CDCl3。
图4为聚乙二醇、实施例三中的PCL-C≡C和实施例四中PCL30-α-PEG135-α-PCL30的凝胶渗透色谱（GPC）流出曲线。
图5为实施例一中Cl-α-PEG135-α-Cl和实施二中N3-α-PEG135-α-N3的红外光谱图（FT-IR）。
图6为实施例二中N3-α-PEG135-α-N3、实施例三中PCL-C≡C和实施例四中PCL30-α-PEG135-α-PCL30的红外光谱图（FT-IR）。
图7为实施例四中PCL30-α-PEG135-α-PCL30在pH 7.4缓冲溶液中自组装形成的胶束（浓度为0.06 mg mL-1）的透射电镜照片。
图8为实施例四中PCL30-α-PEG135-α-PCL30在pH 7.4缓冲溶液中自组装形成的胶束（浓度为0.06 mg mL-1）的动态光散射曲线。
图9为实施例七中PCL30-α-PEG135-α-PCL30形成的载药胶束在不同pH值的缓冲溶液中的药物释放曲线。
图10为实施例七中PCL30-α-PEG135-α-PCL30三嵌段共聚物的细胞毒性测试图.
图11为实施例六中PCL30-α-PEG135-α-PCL30三嵌段共聚物载药胶束与抗癌药物阿霉素（DOX）的细胞毒性测试曲线。
具体实施方法
下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述：
实施例一：具有酸敏感性的末端含二氯乙基二缩醛基的聚乙二醇（Cl-α-PEG135-α-Cl）的合成。
首先通过双末端含羟基的聚乙二醇（HO-PEG135-OH）与对甲苯磺酸吡啶盐（PPTS）在甲苯中共沸除水，然后采用无水二氯甲烷作为溶剂，与乙烯基氯乙基醚（CEVE）反应，制备末端含二氯乙基二缩醛基的聚乙二醇（Cl-α-PEG135-α-Cl）。具体合成方法如下：
在装有磁力搅拌子，干燥管及常压蒸馏装置的100 mL圆底烧瓶中，加入聚乙二醇（6.01 g，1.0 mmol），对甲苯磺酸吡啶盐（PPTS，0.5 g，0.2mmol）以及甲苯30 mL，加热共沸，在110 ℃条件下蒸馏出甲苯和水的共沸物。
将装有HO-PEG135-OH以及PPTS的圆底烧瓶冷却至室温后加入无水二氯甲烷（CH2Cl2，50 mL），在恒压滴液漏斗中加入乙烯基氯乙基醚（CEVE，1 mL，10 mmol）和10 mL无水二氯甲烷，在0 ℃条件下搅拌，并缓慢滴加乙烯基氯乙基醚（CEVE），滴加完毕后在室温条件下继续搅拌30 min，加入10 mL质量分数为10%的碳酸钠水溶液使体系呈碱性，终止反应。
向上述反应体系中加入60 mL CH2Cl2，用10 mL pH 10.0的饱和NaCl水溶液洗涤两次，静置分液，收集有机相，加入无水硫酸镁干燥、过滤，将滤液浓缩后在冰正己烷中沉淀、过滤、反复三次、用水泵抽干，再置于真空干燥箱内干燥24 h，得到末端含二氯乙基二缩醛基的聚乙二醇（Cl-α-PEG135-α-Cl，5.37 g），产率89%。
实施例二：末端含二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇（N3-α-PEG135-α-N3）的合成。
在50 mL的圆底烧瓶中依次加入Cl-α-PEG135-α-Cl（5.03 g, 0.8 mmol），叠氮化钠（0.57 g, 8mmol）以及10 mL二甲基甲酰胺（DMF）。在60 ℃的条件下反应40 h。将反应体系通过碱性三氧化二铝柱（Al2O3）除去未反应的叠氮化钠，接着在50 ℃下用真空油泵抽去DMF，加入60 mL CH2Cl2稀释后用pH 10.0的PBS缓冲液（10 mL）洗涤两次，分液静置，收集有机相，经过无水硫酸镁干燥、过滤，将滤液浓缩后在冰正己烷和冰乙醚中（体积比1:1）沉淀、过滤，反复三次，用水泵抽干，再置于真空干燥箱内干燥24 h，得到末端含二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇（N3-α-PEG135-α-N3，2.48 g），产率49%。
实施例三：单末端为炔基的聚己内酯（PCL30-C≡C）的合成方法。
将放入搅拌子的支管圆底烧瓶在120 ℃烘箱中至少干燥24 h后，塞上玻璃塞，通过乳胶管与油泵相连抽至室温后，再通入高纯氩气，抽真空，如此反复三次。
用干燥的注射器从支管中依次注入炔丙醇 （0.12 g，2.14 mmol），己内酯（ε-CL）（10.1 g，86.1 mmol）和辛酸亚锡[Sn(Oct)2]（430 mg）（ε-CL根据理论聚合度计算用量；[ε-CL]: [Sn(Oct)2] = 1: 0.04，质量比），25 mL无水甲苯为溶剂。在反应瓶中充满氩气后，在90 ℃的油浴中搅拌反应4 h。
反应结束后，将甲苯溶剂旋蒸除去，在在冰无水乙醚中沉淀、过滤，反复两次，除去未反应的单体，用布氏漏斗抽滤后的产物置于真空烘箱中烘干至恒重，得到白色产物（PCL30-C≡C，8.79 g），测得产率为87.4%。
实施例四：具有酸敏感性的生物可降解型两亲性三嵌段共聚物（PCL30-α-PEG135-α-PCL30）的合成。
将支管圆底烧瓶按照实施例三的方法处理后，充满氩气，迅速加入上述末端含二叠氮乙基二缩醛基的聚乙二醇N3-α-PEG135-α-N3（366 mg, 0.06 mmol）、单末端为炔基的聚己内酯PCL30-C≡C （300 mg, 0.1 mmol）、溴化亚铜（0.014 g，0.10 mmol）和五甲基二亚乙基三胺（21 μL，0.10 mmol），用油泵抽、充氩气、反复三次以除去瓶中空气，再用干燥的注射器加入20 mL溶剂四氢呋喃（THF），搅拌至混合物完全溶解，溶液呈蓝色。然后将圆底烧瓶移至25 ℃的油浴中，搅拌反应24 h。
反应结束后，接触空气使反应终止，聚合物混合溶液用100 mL二氯甲烷稀释后，使溶液通过碱性的Al2O3柱子除去溶液中的铜盐，混合液旋转蒸发除去溶剂使溶液浓缩，在150 mL冰乙醚中进行沉淀，抽滤后的产物溶解在5 mL四氢呋喃中，对去离子水透析48 h后，冷冻干燥至恒重，得到白色产物。
结合实施例一、实施例二、实施例三和实施例四，分别利用核磁共振氢谱（1H NMR）、红外光谱（FT-IR）和凝胶渗透色谱（GPC）验证所得聚合物的结构、分子量和分子量分布。图1分别为聚合物Cl-α-PEG135-α-Cl、N3-α-PEG135-α-N3的核磁共振氢谱对比图。图2和图3分别为聚合物PCL30-C≡C、PCL30-α-PEG135-α-PCL30的核磁共振氢谱图。图4为三种聚合物的GPC流出曲线（PEG135: =6860 g mol-1，=1.08; PCL30-C≡C：=3010 g mol-1，=1.19; PCL30-α-PEG135-α-PCL30：=11900 g mol-1，=1.10;）。图5为聚乙二醇、Cl-α-PEG135-α-Cl和N3-α-PEG135-α-N3的红外光谱图，在波数为2109cm-1处出现叠氮基团（-N3）吸收峰。图6为N3-α-PEG135-α-N3、PCL30-C≡C以及三嵌段共聚物PCL30-α-PEG135-α-PCL30的红外光谱图，在波数3280 cm-1处为炔基（-C≡C）的吸收峰，波数1730 cm-1处为羰基（-C=O）的吸收峰。从中可以分析出反应产物符合实验设计。
实施例五：采用透析法制备三嵌段共聚物胶束
将1.5 mg聚合物PCL30-α-PEG135-α-PCL30加入到圆底烧瓶中，加入2 mL有机溶剂四氢呋喃（THF），搅拌4～6 h，使聚合物链完全舒展开来，在搅拌的情况下，利用微量进样泵以2 mL h-1的速度将10 mL pH 7.4 PB缓冲溶液加入，待完全进样后，将混合溶液转入透析袋（截留分子量为7000 Da）中，将有机溶剂完全透析除去。将透析后的溶液转入25 mL容量瓶中定容，从而得到浓度为0.06 mg mL-1的胶束溶液。图7为PCL30-α-PEG135-α-PCL30在pH 7.4缓冲溶液中自组装形成的胶束（浓度为0.06 mg mL-1）的透射电镜照片，图8为动态光散射曲线，如图7所示，三嵌段共聚物在水溶液中自组装形成胶束结构。图8为对应胶束粒径的动态光散射测试曲线图。
实施例六：聚合物胶束装载抗癌药物阿霉素的性能研究
分别称取25 mg聚合物和5 mg抗癌药物阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)加入到圆底烧瓶中，加入5 mL有机溶剂四氢呋喃（THF）以及5 μL三乙胺除去盐酸，搅拌4～6 h，使聚合物链处于完全舒展的状态，然后仍处于搅拌的状态下，利用进样泵以2 mL h-1的速度将10 mL 超纯水加入，待完全进样后，将混合溶液转入透析袋（截留分子量为7000 Da）中，将有机溶剂完全透析除去。将透析后的溶液转入50 mL容量瓶中定容，从而得到浓度为0.5 mg mL-1的载药胶束溶液。取5 mL载药胶束溶液于透析袋中，外部加入20 mL不同pH值的缓冲溶液，将其置于恒温振荡器中，在37 ℃的恒温水浴下释放。每隔一段时间取5 mL透析袋外部溶液，同时补充5 mL新鲜相同pH值的缓冲溶液。用荧光分光光度计检测释放的DOX的含量。载有阿霉素的聚合物胶束在不同pH条件下的释放曲线如图9所示，在pH 5.0时药物释放速率明显快于pH 7.4，说明该三嵌段聚合物载药胶束具有明显的pH敏感性，可以达到可控释放的目的。
实施例七：细胞毒性测试
将人子宫颈癌细胞(HeLa cells)培养在补充有10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃，5% CO2(相对湿度为90%)的培养箱中培养，定期更换培养液。选择处在生长活跃期的细胞接种于每孔含有100 μL RPMI-1640培养基的96孔板中，培养24 h。用透析法配置母液浓度（5 mg mL-1）的三嵌段共聚物PCL30-a-PEG135-a-PCL30的胶束，将一系列不同浓度的胶束溶液加入到96孔板中，继续培养48 h。接着加入25 μL的MTT试剂，进一步培养30 min后，用酶标仪(Bio-Rad model 680)在490 nm下测量对应的吸光度。细胞存活率的计算方法为：细胞存活率 (Cell viability) (%) = [A]test/[A]control × 100%，其中[A]test为PCL30-α-PEG135-α-PCL30共聚物胶束存在下测得的吸光度，而[A]control为不加共聚物的情况下测得的吸光度。每个样品测试三次，取其平均值。如图10所示，所合成的双亲水性嵌段共聚物对HeLa细胞基本没有毒副作用，证明双亲水性嵌段共聚物有很好的生物相容性。
另外，上述测试方法也应用于实施例六所制备的载有抗癌药物阿霉素（DOX）的胶束，并与游离的阿霉素的细胞毒性进行比较，结果如图11所示。在相同阿霉素浓度的情况下，聚合物载药胶束的毒性较小，证明聚合物有很好的生物相容性。