技术领域
本发明涉及一种植物乳杆菌及其应用，特别是涉及一种具有高转氨酶活力的植物乳杆菌 及其在制备干酪中的应用。
背景技术
微生物细胞内酶活的高低影响着细胞代谢快慢。奶酪成熟是一系列连续而复杂的生化过 程，是微生物和酶共同作用的过程，在成熟过程中主要存在三类生化反应：蛋白质水解、脂 肪分解和乳糖代谢。通过这些复杂的变化，最终形成奶酪特有的风味、气味和质地，其中蛋 白质的水解最为复杂。蛋白质在各种蛋白酶如凝乳酶、原料乳中组织蛋白酶D、发酵剂和非 发酵剂乳酸菌酶作用下，水解形成短肽以及氨基酸的混合物，这些混合物直接影响奶酪的口 感和滋味，同时也提供了酶解底物，再经进一步的代谢作用以及化学转化形成奶酪特有的风 味和香气化合物。具体地，蛋白质的变化包括以下几个方面：在凝乳酶的作用下，原料乳中 的蛋白质会水解形成大分子量的水溶性酪蛋白衍生肽类或者中间肽类；在发酵剂乳酸菌释放 的蛋白酶作用下，酪蛋白衍生肽进一步分解，会产生更小的肽类包括苦味肽；在发酵剂和非 发酵剂菌株溶解后释放的肽酶作用下，逐步分解形成短肽或者游离的氨基酸；游离的氨基酸 在发酵剂和非发酵剂菌株溶解后释放的转氨酶作用下发生转氨基作用，形成风味前体酮酸类 物质。酮酸类物质再经过脱羧、脱氢和化学等作用形成胺类、酸类、醛类、醇类、酯类等风 味物质，从而构成奶酪的各种特征风味。
切达奶酪属于硬质奶酪的一种，口感温和，容易被东方人接受，然而切达奶酪的成熟和特 征的风味形成需要很长的时间，这就需要大量的储存空间和成本。因此，加速切达奶酪成熟 和风味的形成是有必要的。现如今加速切达奶酪成熟的方法包括物理、化学和微生物方法， 其中微生物法是近些年研究的热点，主要是在奶酪制作过程中添加附属发酵剂，加快蛋白质 的水解速度，从而加快奶酪的成熟。然而，在加速奶酪成熟的同时保证奶酪风味形成加快鲜 有研究。奶酪前体风味物质的产生能够加速奶酪风味的形成，转氨酶是控制这一步的关键性 酶。乳杆菌是一类革兰氏染色阳性、无芽孢杆菌，能够使碳水化合物发酵产生乳酸，广泛存 在于发酵乳制品、发酵植物食品如泡菜、酸菜、青贮饲料以及人肠道中，是食品工业上的常 用菌种，与人类关系密切。乳杆菌具有耐酸性，定殖胃肠道的能力，并且乳杆菌能够调节机 体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇水平，控 制内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，从而对机体的营养状态、生理功 能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应激反应等 产生有益的影响。在成熟的切达奶酪中乳杆菌是数量最多的一类非发酵剂菌株，因此探索利 用乳杆菌作为加速切达奶酪成熟和风味形成的附属添加剂具有重大的意义。本发明筛选出具 有高转氨酶的加速奶酪风味形成的乳杆菌，并且证明它们在切达奶酪中具有良好的加速奶酪 风味形成的效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有高转氨酶活力的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），我们命名为植物乳杆菌CCFM410，于2013年9月25日保藏于中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO.8242，保藏地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
所述菌株的特点为：
(1)在酸性（pH3.0)环境下生长良好；
(2)在高盐浓度（3%NaCl）环境下生长良好；
(3)能在低温环境下生长；
(4)细胞自溶度较高；
(5)菌株产酸能力不强；
(6)细胞内总肽酶活力高；
(7)细胞内转氨酶活力高。
下面将对这些性质进行详细描述。
1、耐酸性实验
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM410接种于MRS培养基中，在温度37℃下培养24h， 再经MRS培养液传代培养2～3次后，选取在上述条件下生长得到的菌液1.0mL，用PBS（磷 酸盐缓冲液）清洗两次后，重悬在PBS中，与9.0mL pH值分别为4.0，5.0，6.0的MRS混 合后，在温度37℃下进行培养24h，分别测定不同酸性环境下植物乳杆菌CCFM412的OD600 值。通过测定OD600值的变化大小，得到耐酸性好的菌株。OD600值是在600nm波长处的吸光 值，利用这个值来测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以通常用来指菌 体细胞密度。
实验结果见附图1，实验结果表明植物乳杆菌CCFM410在pH4.0的酸性条件下培养24h 后OD值增加量为0.6421，具有较好的耐酸能力。
2、耐盐性实验
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM410接种于MRS培养基中，在温度37℃下培养24h， 再经MRS培养液传代培养2～3次后，选取在上述条件下生长得到的菌液1.0mL，用PBS（磷 酸盐缓冲液）清洗两次后，重悬在PBS中，与9.0mL NaCl浓度分别为0%，2%，4%，6%的 MRS混合后，在温度37℃下进行培养24h，分别测定不同酸性环境下植物乳杆菌CCFM412的 OD600值。通过测定OD600值的变化大小，得到耐盐性好的菌株。
实验结果见附图2，实验结果表明植物乳杆菌CCFM410在4%的高盐条件下培养24h后OD 值增加量为1.0054，在6%的条件下培养24h后OD值增加量为0.6129，具有较好的耐盐能力。
2、低温条件下生长情况
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM410接种于MRS培养基中，在温度37℃下培养24h， 再经MRS培养液传代培养2～3次后，取1mL植物乳杆菌CCFM412培养液，接种于19mL的 MRS液体培养基，在温度5℃，10℃，15℃下培养24h，观察低温条件下菌株生长情况。
实验结果如表1，实验结果表明植物乳杆菌CCFM410能在低温条件下生长。
表1菌株低温条件生长情况
注:“-+”代表略有生长，“+”代表生长，“++”代表生长良好
3、细胞自溶度的测定
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM410接种于MRS培养基中，在温度37℃下培养24h， 再经MRS培养液传代培养2次后，以2%(V/V)的接种量接入液体MRS中进行增殖培养18h，将 菌体培养液取出，冷冻离心（5000g，15min，4℃），将离心所得的菌体悬浮于0.05mol/L的 pH7.0的磷酸钠缓冲液中，调整初始OD600nm为1.0左右，用磷酸钠缓冲液作为空白试剂调 零。将悬浮液和空白试剂放置在30℃下6h，在600nm处分别测定初始、6h、24h的吸光度， 分别记作OD0，OD6，OD24。菌体自溶度计算方法如下：
自溶度（%）=OD0-ODn/OD0×100%
其中，ODn表示测定时间n对应的OD值，n为6，24.
实验结果见附图3，实验结果表明植物乳杆菌CCFM410在30℃条件下培养6h和24h后细胞自 溶度分别为17.72%，21.26%，具有高的自溶度。
4、产酸能力
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM410接种于MRS培养基（例如青岛海博的产品）中， 在温度37℃下培养24h，再经MRS培养液传代培养2次后，以2%(V/V)的接种量接入液体 MRS中进行增殖培养18h，将菌体培养液取出，冷冻离心（5000g，15min，4℃），将离心所得 的菌体悬浮于0.05mol/L的pH7.0的磷酸钠缓冲液中，调整初始OD600nm为1.0左右。将带 菌体的缓冲液以2%（v/v）的接种量接入脱脂培养基中，在37℃培养18h，测定脱脂乳培养 基的pH（pH1）和脱脂乳培养基的初始pH（pH0），以ΔpH=pH0-pH1计算得到菌株的产酸能力。 实验结果见表2，实验结果表明植物乳杆菌CCFM410在37℃条件下培养18h后脱脂培养基酸 度的变化，ΔpH=0.98，相比发酵剂菌株具有较低的产酸能力。
表2菌株产酸能力
5、细胞内转氨酶活力测定
将冷冻保存的本发明植物乳杆菌CCFM410接种于MRS培养基中，在温度37℃下培养24h， 再经MRS培养液传代培养2次后，以2%(V/V)的接种量接入液体MRS中进行增殖培养18h，将 菌体培养液取出，冷冻离心（5000g，15min，4℃），将离心所得的菌体悬浮于0.05mol/L的 pH7.0的磷酸钠缓冲液中，在-80℃环境下反复冻融，再用0.22um的玻璃珠对细菌细胞进行 破碎。将破碎后的细胞冷冻离心（20000g，10min，4℃），收集上清液，即为菌体无细胞提取 液（CFE），取出一部分采用考马斯亮蓝G-250方法测定CFE中蛋白质含量，其余CFE放置在 -20℃下备用。
转氨酶活力测定的酶反应体系中包含0.05mM的磷酸吡哆醛（PLP），6mM的α-酮戊二酸 （αKGA），pH7.0的50mM磷酸盐缓冲液（PBS）和1mM的氨基酸（分别为亮氨酸、苯丙氨酸、 蛋氨酸），37℃下反应1h后，80℃下加热15min，停止反应，生成的谷氨酸量通过谷氨酸试 剂盒测定。测量过程中，250ul的反应体系在37℃下反应45min后再在λ=492nm测定吸光度 值，将所测定的值与标准曲线对比，得到转氨基作用生成的谷氨酸含量。
实验结果见附图4，实验结果表明植物乳杆菌CCFM410以亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸为底物 测定的细胞内转氨酶活力分别为，相比发酵剂菌株具有高的转氨酶活力。
通过以上实验证明，本发明的植物乳杆菌CCFM410具有下述性质：
1、具有耐酸性，在低pH下可以生长；
2、具有耐盐性，在高盐条件下可以生长；
3、可以在低温条件下生长；
4、细胞具有高自溶度；
5、产酸能力不高；
6、细胞内转氨酶活力高。
本发明要解决的另一个技术问题是提供所述的植物乳杆菌在切达干酪制备中的应用，将 所述植物乳杆菌作为附属发酵剂加入到切达奶酪制作过程中，加速奶酪的成熟和风味的形成。
所述发酵剂为RA21LYO；
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）通过如下凝乳加入所述原料乳中：所述凝 乳的制备方法为：将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）在脱脂乳培养基中发酵,得到 凝乳。
具体技术方案为：
A)原料乳的预处理：购自于无锡天资乳业的合格的标准化的原料乳，在30min内转运到 实验室中。在63℃-68℃下巴氏杀菌30min或者在72℃下杀菌15秒，快速冷却到30℃-32℃。
B)发酵剂的添加：发酵剂菌株在10%的经过热杀菌的脱脂乳培养基中30℃活化10h-12h， 以1%-2%(体积比)的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀。
C)附属发酵剂的添加：附属发酵剂菌株在10%的经过热杀菌的脱脂乳培养基中30℃活化 12h后，以1%-5%体积比的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀，，静置一段时间，至酸度降低 2.22°T左右。
D)凝乳酶的添加
当酸度达到要求后，凝乳酶以0.001%-0.002%的添加量溶解于水中添加到牛乳中。搅 拌均匀，凝乳一段时间。
上述凝乳酶来源于丹尼斯克公司（产品编号：MARZYME150）
E)切割凝乳、加热搅拌及排除乳清
凝乳酶添加后，待凝乳充分形成，即可进行切割。判断标准：轻挑一小部分凝块，当 析出的乳清清澈（不会浑浊），测定乳清酸度，乳清酸度应在12.2-14.4°T间。升温至38 ℃-39℃后，保温30min-45min，至pH降至6.1左右，排除全部的乳清。
F)凝块的堆酿
排除乳清后，将干酪粒堆积在制作槽内一端，用不锈钢板挤压，使其成块。将形成的 凝块切割成两块，静置，每隔10min-15min翻面，翻转三次后将两块凝块堆起，静置，每 10min-15min翻面，至凝乳块形成新的表面。在此过程中经常测定排除的乳酸酸度，当乳清 达到pH=5.2-5.4，酸度达到55.56°T-66.67°T时，堆酿结束。
G)切碎与加盐
堆酿结束后，用刀将干酪块切割成小颗粒。然后采用干盐添加法加盐，在温度为30℃ -32℃下，按干酪块2.2%-2.7%的添加量分两次加入NaCl，并不断搅拌。
H)压榨成型
将合适重量的干酪粒放入模具中，在室温下用一定重量的物体进行压榨，15h-18h。
I)真空包装、成熟
从模具中取出新鲜的奶酪，进行真空包装。将包装好的新鲜奶酪放置在4℃-10℃环境下 成熟。
所述植物乳杆菌在干酪蛋白质水解中的应用也属于本发明要求保护的范围。
本发明提供的植物乳杆菌具有高肽酶、高转氨酶活性，将其作为附属发酵剂添加至切达干 酪模型中,将奶酪模型放置在20℃下进行快速成熟，结果发现植物乳杆菌CFM410得到的干酪 中水溶性氮，5%PTA-SN和12%TCA-SN的含量较高，可有效提高蛋白分解程度，且在短时间内 形成陈年切达干酪具有的风味特征，增加了干酪风味种类，切达奶酪模型中陈年奶酪的坚果 味和硫味感官得分增加，使得切达干酪成熟周期短,可以节约贮藏成本。
附图说明
图1表示植物乳杆菌菌株在不同pH条件下的生长情况；
图2表示在不同浓度的NaCl条件下植物乳杆菌的生长情况；
图3表示植物乳杆菌的自溶度；
图4表示植物乳杆菌的转氨酶活力；
图5为成熟期间各奶酪体系中微生物变化；
图6为成熟期间各奶酪pH值变化；
图7为奶酪模型在成熟期内蛋白质水解情况；
图8为奶酪模型在成熟期内感官评定结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、菌株的获得
1）样品稀释液的制备及细菌分离
无菌操作取25g样品放入装有225mL无菌的生理盐水的均质杯内，以8000r/min均质 1min～2min，制成1:10样品匀液。再用lml无菌枪头吸取样品处理液放入9ml灭菌生理 盐水中,震荡混匀即成10-2稀释液，依次类推，连续稀释至10-4在10-2、10-3、10-4梯度分别 吸lml稀释液至于培养皿中,并倒入50℃左右MRS琼脂培养基，混匀，37℃培养48h。
2）菌株初步纯化
用接种针挑取平皿表面及底部圆形的乳酸菌疑似单菌落，在MRS平板培养中划线接种，37 ℃培养48h。
3）革兰氏染色
挑取单菌落,做革兰氏染色实验,在光学显微镜下观察并记录现象，将革兰氏阳性菌平板纯 化四代,镜检后转斜面贮藏,分离得到菌株CCFM410等。
4）菌株的16srDNA序列分析
利用16srDNA通用引物，得到16SrDNA序列长度为1454bp；其16srDNA序列在NIBC中 进行同源性比对后发现，该菌株与植物乳杆菌属具有100％同源性，结果显示该菌株属于植 物乳杆菌属。
实施例2、菌株在切达干酪模型中的应用
1.切达干酪模型的获得
切达干酪模型的生产工艺如下：原料乳(江苏省无锡市天资乳业，新鲜牛乳)经巴氏灭菌后 迅速冷却至31℃，添加发酵剂和附属发酵剂，在31℃条件下保温30-40min后添加一定量的 凝乳酶凝乳30-40min，将凝块切割成1cm边长的正方体颗粒后，以5℃/min速度升温，缓慢 搅拌，升温到39℃后保温缓慢搅拌，排除乳清，对凝块进行堆酿，将堆酿得到的凝块再切碎 以干法加盐法进行加盐，对装在模具中的奶酪进行压榨后真空包装，再放置在一定温度下进 行成熟。
实验设计两组，A组是只含有发酵剂制作得到的切达干酪模型，B组是通过添加发酵剂和附属 发酵剂共同制作得到的切达干酪模型。
具体步骤如下:
A)原料乳的预处理：购自于无锡天资乳业的合格的标准化的原料乳，在30min内转运到实验 室中。在65℃下巴氏杀菌30min后，快速冷却到31℃。
B)发酵剂的添加：发酵剂菌株在10%的经过热杀菌的脱脂乳培养基中30℃活化12h后，以体 积计1%的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀。
C)附属发酵剂的添加：附属发酵剂菌株在重量计10%的经过热杀菌的脱脂乳培养基中30℃活 化12h后，以体积计1%的添加量添加到原料乳中，搅拌均匀，，静置一段时间，至酸度降低 2.22°T左右。
D)凝乳酶的添加
当酸度达到要求后，凝乳酶以重量计0.002%的添加量溶解于水中添加到牛乳中。搅拌均匀， 凝乳30min。
上述凝乳酶来源于丹尼斯克公司（产品编号：MARZYME150）
E)切割凝乳、加热搅拌及排除乳清
凝乳酶添加后，待凝乳充分形成，即可进行切割。判断标准：轻挑一小部分凝块，当析出 的乳清清澈（不会浑浊），测定乳清酸度，乳清酸度为13.2°T。升温至39℃，保温45min， 至pH降至6.10，排除全部的乳清。
F)凝块的堆酿
排除乳清后，将干酪粒堆积在制作槽内一端，用不锈钢板挤压，使其成块。将形成的凝块 切割成两块，静置，每隔15min翻面，翻转三次后将两块凝块堆起，静置，每15min翻面， 至凝乳块形成新的表面。在此过程中经常测定排除的乳酸酸度，当乳清达到pH=5.2，酸度达 到60°T，堆酿结束。
G)切碎与加盐
堆酿结束后，用刀将干酪块切割成4cm×4cm的块状。然后采用干盐添加法加盐，在温度为 31℃下，按干酪块以重量计2.2%的添加量分两次加入NaCl，并不断搅拌。
H)压榨成型
将合适重量的干酪粒放入模具中，在室温下用一50kg的桶装水进行压榨，18h。
I)真空包装、成熟
从模具中取出新鲜的奶酪，无菌条件下平均切割奶酪，再进行真空包装。将包装好的新 鲜奶酪放置在8℃环境下成熟。
2.干酪检测
理化指标是为了衡量本发明制备的干酪在符合规定范围内。蛋白分解程度是衡量成熟的标 准之一,分解程度高才利于分解出更多小分子物质,利于风味的形成。感官评价是对干酪风味 的详细评价包括奶香味、平淡味、酸味、硫磺、坚果味、水果味、苦味、腐臭味、不清洁味 九个风味指标，其中奶香味、平淡味得分越低，硫磺、坚果味、得分越高，奶酪样品风味越 好。通过以下检测方法获得的A组和B组干酪在成熟期的各项指标(自制作得到新鲜干酪起记 作成熟期的第0周)，其后每隔一星期对奶酪样品进行分析测定。
1.微生物分析
在A组干酪和B组干酪成熟期中的第0周，1周，2周，3周，4周，5周，6周分别取样(取 干酪中心区域样品10g，放入90ml灭菌生理盐水中,震荡混匀即成10-1稀释液，依次类推，连 续稀释至10-8，选取三个梯度分别吸l ml稀释液至于培养皿中,并倒入M17和LBS培养基， 混匀。分别放置在30℃和37℃下恒温培养箱中培养72h。测定A、B奶酪体系中发酵剂菌落 数目和B组奶酪中附属发酵剂数目变化。
结果如图5所示，从结果可以发现在整个成熟过程中主发酵剂数目变化处于下降的趋势，A 组数目从log=10.04cfu/g奶酪下降至log=7.08cfu/g奶酪，B组数目从log=10.32cfu/g 奶酪下降至log=7.18cfu/g奶酪，而附属发酵剂数目呈增大的变化趋势，前三周B组奶酪中 数目从log=6.99cfu/g奶酪增加到log=8.37cfu/g奶酪，其后三周数目变化不大。因此附 属发酵剂能在奶酪体系中快速生长，且添加了附属发酵剂的B组奶酪能在成熟期内维持较高 的活菌数，提供更多的酶。
2.干酪理化指标的测定
1）干酪pH值测定
在A组干酪和B组干酪成熟期第0周，1周，2周，3周，4周，5周，6周分别取10g干酪, 匀浆(6000转/分钟)1分钟,用40℃蒸馏水处理,浸提水和样品收集到100mL容量瓶中,将混合 物振荡,调整至室温(25℃),加蒸馏水至刻度,过滤,用pH计测定pH值。
结果如图6所示,整体变化趋势是先下降然后趋于平缓。在B组奶酪模型中一周后，pH值迅 速降低，结合微生物分析知，在一周后奶酪模型中发酵剂和附属发酵剂均维持在较高水平, 乳酸菌发酵产酸,使pH值有所下降。在三周及其后期A和B组奶酪模型均具有较低pH值，且 B组奶酪模型值更低，这是由于在20℃的成熟环境下，附属发酵剂CCFM410对奶酪体系中贡 献了部分酸。
2)水分的测定(中华人民共和国国家标准硬质干酪检验方法GB5421-85)
将称量皿放入105℃烘箱中烘干至恒重。分别称入通过搅拌机搅碎的A组干酪颗粒(贮存第1 天)和B组干酪颗粒(贮存第1天)2-3g(准确至0.2mg)，干酪样品在105℃的烘箱内干燥两次 重量差不大于2mg为止，计算出干酪中的水分百分含量。水分含量计算公式如下：
水分(%)=(Wl一W2)/(Wl一W)×100
式中:W一称量皿重量，g;
W1一称量皿和样品重，g;
W2一称量皿和干燥后样品重，g
结果如表4所示。
3)脂肪测定(哥特里一罗兹法测定)
分别称取1.00g研碎的A组干酪和B组干酪(贮存第1天),加10ml70℃温水置沸水浴中使其 溶解,加入1.25ml氨水，充分混匀，于沸水浴中加热5min，再振摇2min，加入10ml乙醇， 充分摇匀，于冷水中冷却后加入25ml乙醚，振摇0.5min加入25ml石油醚，再振摇0.5min， 静置30min，待上层液澄清时，读取醚层体积，放出醚层至一已恒重的烧杯中，置沸水浴上 挥干醚类物质，于105℃烘箱中干燥1h后称量，再置烘箱中干燥1h后称量,至前后两次质量 差不超过l mg。
X=(M1-M0)×V×100/25×M
X一样品中脂肪含量，%
M0一烧杯质量，g
M1一烧杯加脂肪的质量，g
M一样品质量，g
V一读取醚层体积，ml
结果如表4所示。
4)蛋白质含量的测定
取成熟期第1天(贮存第1天)A组干酪和B组干酪进行总氮测定:凯氏定氮，
GBSOO9.5-2003(样品不用处理，直接称取0.2g左右)
结果如表4所示。
表4奶酪的理化成分测定结果
3、蛋白质水解程度的测定
分别在A组干酪和B组干酪成熟期开始的第1d，1周，2周，3周，4周，5周，6周取样测 定水溶性氮含量,12%TCA可溶性氮含量和5%磷钨酸可溶性氮含量(5%PTA-SN)测定,具体操作 如下:
(1)水溶性测定:分别准确称取20g A组和B组干酪,加入40mL的去离子水在高速匀浆机匀浆 后50℃水浴保温40min，然后在4℃，9000r/min，30min下离心，除去上层脂肪和下层沉 淀，中层清液通过玻璃绒过滤后即得干酪模型的水溶性提取液，将一定量的清液移入凯氏消 化瓶,进行微量凯氏定氮,以水溶性氮含量占干酪总氮量的百分数(%)表示。
结果如图7中（A）所示，可以看出，B组奶酪相比A组奶酪水溶性氮略有增加。两组奶酪(切 达奶酪)随着成熟时间其蛋白质分解程度趋势平缓。水溶性氮主要是凝乳酶和蛋白酶的作用引 起的一定的蛋白质降解。由于添加了附属发酵剂,发酵剂产酸程度不同,凝乳酶的作用效果也 不同,所以初始的含量不同,但没有差异(P<0.05)。
(2)12%TCA-SN测定:准确称取1.5g干酪，加入25mL12%的TCA溶液，将干酪充分磨碎，再 用20mL的缓冲液(质量分数为12%的TCA溶液，取12g三氯乙酸溶解到到100ml的蒸馏水中) 充分冲洗，悬浮液在4000rpm的离心机中离心20min，取上清液定量移入凯氏消化瓶，进行 微量凯氏定氮，并以12%TCA-SN含量占干酪总氮量的百分数(%)表示。
结果如图7中（B）所示，从结果可以看出，B组(实验组奶酪)奶酪的12%TCA检测的可溶性 氮含量随着成熟时间延长逐渐增加,与A组奶酪相比，B组奶酪具有较高的非蛋白氮含量。在 5星期后不同组别之间非蛋白氮含量差异显著(p<0.05),加入附属发酵剂的B组奶酪的非蛋白 氮的含量为9.02%,在A组干酪中的含量为7.82%。这一变化表示着成熟干酪的次级蛋白质降 解，此时高、中分子量肽类被降解成低分子量肽类以及氨基酸等。
(2)5%PTA-SN测定:准确量取10ml奶酪水溶性部分，加入2.5mL20%（w质量/v体积）的TCA 溶液，混匀后，在室温下静置30min，混合液在4000rpm的离心机中离心20min，取上清液定 量移入凯氏消化瓶，进行微量凯氏定氮，并以5%PTA-SN含量占干酪总氮量的百分数(%)表示。 结果如图7中（C）所示，从结果可以看出，两组奶酪的5%PTA检测的可溶性氮含量随着成熟 时间延长逐渐增加。5%PTA-SN一定程度上表征了游离氨基酸含量。与A组奶酪相比，B组奶 酪具有高的游离氨基酸含量，且在成熟期达到4星期时不同组别之间5%PTA-SN含量差异显著 (p<0.05)。这一变化表示着附属发酵剂CCFM410能够促进体系中游离氨基酸的释放。
以上实验证明了添加CCFM410菌株可有效提高蛋白分解程度,提高游离氨基酸含量。
4、感官分析
1)感官鉴评小组的组成
感官鉴评小组由15名大学生自愿者组成，年龄在19～25岁，15名志愿者中部分成员接受 过《食品感官鉴评》课程的培训。
2）感官鉴评小组的培训
对小组成员进行一段时间的感官培训，分别对成熟期的各种奶酪进行风味感官评价。选定了 8个描述奶酪风味的指标，分别为奶香味、平淡味、酸味、陈年味（硫味和坚果味）、水果味、 苦味、腐臭味、不清洁味，以15分制为标准，浓度最高分最高。结果如图8所示，（A）、（B） 分别表示A组、B组奶酪感官评定结果。奶香味和平淡味是成熟时间短的奶酪主要表现出来 的风味，两组奶酪在20℃的成熟环境下，奶香味和平淡味都下降，B组得分相比A组偏低。 两组酸味偏高，这主要是高的成熟温度导致主发酵剂快速代谢产酸，所以整个体系中酸味偏 高，而B组奶酪中酸度比A组更强的原因主要是附属发酵剂在代谢过程中产生了部分酸。但 比较A、B两组奶酪陈年味，能够发现B组陈年味更为明显，且整体风味强度B组高于A组。 以上实验证明了添加CCFM410菌株加快切达奶酪中陈年味的形成速度。