技术领域
本发明涉及酶活性的检测方法，具体为一种检测日化产品中溶菌酶活性的方法。
背景技术
种类繁多的日用化学品， 随着科学技术的发展，制作日益精良，在原料的选择上，使用的天然原料越来越受青睐。同时在功能的研发上，日益依赖于分子生物学、生物工程、皮肤生理医学等学科的发展。酶制剂因其安全性、高效性和专一性越来越多地为日化产业所关注。具有高稳定性和高效性的生物酶复合制剂正在不断开拓日化领域的新时代。
生物酶是生物体产生的一种催化剂，它的化学本质是蛋白质。其特点：一是催化的高效性，催化效率可达107 ～ 1012倍，是一般的化学催化剂无可比拟的； 二是酶具有高度的作用专一性；三是催化性能的高稳定性。
雪豹FE口腔清洁卫生用品是以溶菌酶为核心的生物酶复合制剂。具有抗菌消炎，有止血，帮助组织修复，增强机体抵抗力等功效。溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），能专一性水解细菌细胞壁，（通过催化细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰氨基葡糖与N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键水解），而达到杀灭细菌的目的。而且它的最小抑菌浓度是微克级的。与一般化学催化剂相比较，其突出特点是彻底杀灭细菌而非抑菌，没有造成化学残留和耐药性问题。
溶菌酶广泛存在于人体多种组织，和禽类的蛋清以及微生物中。它是一种天然酶，安全绿色的添加剂，无抗药性，也是国家认可的食品添加剂成分。也是国际化妆品原料标准INC中认可的通用原料。
溶菌酶的活力检测目前国内外一般采用比浊法GB/T 302990-2014。其原理是以溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）为反应底物，使用溶菌酶催化水解其细胞壁，细菌因失去细胞壁的保护无法维持细胞内渗透压平衡而裂解死亡，导致菌悬液的浊度降低，通过分光光度计测定在450nm处的吸光光度值的变化并换算出样品酶活性单位。
酶活性的定义为在25摄氏度，0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.2）中，以溶壁微球菌为底物，于450nm处每分钟使吸光度值下降0.001时所需的酶量。活性单位为U/mg或U/g或U/mL。
用分光光度计进行定量分析时，利用样品的吸光值与样品的浓度成正比的原理， 可将待测试样的纯品配制成一系列标准溶液，事先绘制标准曲线，由待测未知样品的吸光度对照标准曲线，就可得到其含量或活力单位。
溶菌酶在日化产品中得到广泛的应用，对日化产品中溶菌酶活性的检测是企业生产重要的一项，日化产品成分复杂，尤以乳液，胶体或膏霜类产品居多。随着溶菌酶应用范围的增大，其在日化领域中溶菌酶比浊法的局限性日益凸显。日化产品配方成分复杂，干扰多，影响大，重复性差，产品中含有悬浊物或胶粒等散射质点时入射光通过样品就会有一部分光因散射而损失掉，使透射光强度减少，实测吸收光度增大，干扰浊度测定。 甚至很多情况下由于胶体溶液的透光性差而导致数据无法检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术，针对日化产品成分复杂的特点，提供一种检测溶菌酶活性的色源底物透明圈法，与比浊法相比，具有检测灵敏、检测结果可靠，检测更简便快速的优点。
本发明解决上述问题所采用的技术方案为：一种检测日化产品中溶菌酶活性的色源底物透明圈法：利用溶菌酶水解特点，在含色源底物的固体培养基中形成透明圈，所述的色源底物是活性染料艳红所标记的溶壁微球菌，在合适的浓度范围内，溶菌酶的活力与透明圈的直径呈线性关系，以溶菌酶活力单位为纵坐标，透明圈直径为横坐标，绘制标准梯度曲线，根据样品的透明圈直径与标准样品的标准梯度曲线比较，可计算出样品中溶菌酶的活力单位。
上述检测日化产品中溶菌酶活性的色源底物透明圈法的具体步骤：
1）溶壁微球菌的培养和收集：取菌种，接种于肉汤培养基，37℃培养 12小时以后通过离心收集菌体，经冷冻干燥，获得干燥菌体，该肉汤培养基的质量百分比成分：牛肉膏 0.5%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、琼脂2.5%，pH7.5，压力1 03.4KPa，灭菌 15 分钟以上；
2）活性艳红染料标记溶性微球菌：取干燥菌体 5g，加入 50毫升1.25mol/L NaOH，再加 2.5 克活性染料艳红 K-2BP搅拌均匀，于25℃水浴放置 24 小时进行染色， 离心收集染色菌体；染色菌体反复用蒸馏水洗涤并离心以除去未参加反应的游离染料，反复处理直到上清液无色，由此得到净化的染色菌体；
进行酶活力测定时，将染色菌体直接悬于0.1mol/L、pH6.5 的磷酸盐缓冲液内，制成浓度为1%色源底物溶液；或者将染色菌体冻干保存，使用时用磷酸盐缓冲液冲配；
3）平板制备：将灭菌后的含1.6wt% 琼脂的固体培养基250ml冷却至50℃，加色源底物溶液50ml，混匀后小心倒入直径为150mm 的培养皿平板内，70ml/个，水平放置，待凝固后，放置洁净工作台内1小时，或置于4℃冰箱存放备用；使用前用无菌打孔器在每个平板上打出所需的孔洞，弃去孔中琼脂块，形成完整空穴备用；
4）样品的处理：取含溶菌酶的固体样品1克或液体或乳液样品1毫升，加0.1 M、pH 6.5 的磷酸盐缓冲液3mL，搅拌混匀后室温下放置2小时及以上，离心后取上清液作为酶含量的检测样品；
5）检测：用移液器向培养皿平板上的琼脂孔内加入不同量的标准溶菌酶溶液以形成梯度，标准溶菌酶溶液参照CAS 编号：12650-88-3，Sigma，同时加入待检测含酶样品，和未含溶菌酶产品的样品，作为空白对照，加入量100ul /孔；
6）将加入标准酶溶液和样品的平板水平移入37℃恒温培养箱中培养12小时；
7）酶反应后扩散透明圈直径减去琼脂孔直径即为检测试样的实际透明圈直径，以样品的实际透明圈直径与绘制标准梯度曲线进行比对，以确定样品的酶活力单位，并由此可通过稀释倍数换算计算出实际日化产品的总酶活力单位。
优选操作是，步骤1中菌体收集的离心转速为3000 rpm。
优选操作是，步骤2中染色菌体收集的离心转速为3000r/min，离心时间为10min。
优选操作是，步骤4离心操作的转速为12，000转/分， 离心时间为10min。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本方法是采用色源底物法与透明圈法的有机结合，进行溶菌酶的定性定量检测，可排除胶体等因素带来的干扰，同时又能体现溶菌酶在此对于细菌细胞壁的裂解专一性，因为其它的抑菌成分无法分解色源底物（染色的细菌细胞壁）从而无法形成透明圈，故本方法直观，快速，灵敏，简便，正确。
附图说明
图1为本发明实施例中标准溶菌酶溶液的染色底物透明圈实验结果；
图2为本发明实施例中含酶牙膏和口香糖样品及其空白对照样的染色底物透明圈实验结果；
图3为本发明实施例中含酶漱口水、沐浴露和洁面乳样品及其空白对照样的染色底物透明圈实验结果；
图4为本发明实施例中标准梯度曲线，图标标识：表示透明圈直径和其对应的酶活力单位所在位置
● 表示为 不同量的溶菌酶标准品；
① 表示A 和B，含酶牙膏；
②表示 C，含酶口香糖；
③表示 D, 含酶漱口水；
④表示 E，含酶沐浴露；
⑤表示 G，含酶洁面乳。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
试验样品为 含溶菌酶产品( A- G)，空白样品为市场上其他未含溶菌酶相对应的产品：云南白药牙膏( A′)，美加净植尚牙膏(B′) , 好丽友口香糖(C′)，益口佳漱口水(D′) , 潘婷（Pantene Pro-V） 沐浴露（E′）， 妮维雅（Nivea）洁面乳（G′）进行空白对照试验：
含溶菌酶产品标记如下( A – G ) :
牙膏( A&B ) 配方设计为： 山梨糖醇, 水, 水合硅石, 磷酸氢钙, 丙二醇, 月桂酸肌氨酸钠, 食用香精, 焦磷酸四钠, 纤维素胶, 卡拉胶, 植酸钠, 糖精钠, 溶菌酶；
口香糖 ( C ) 配方设计为:加工树胶基质 , 山梨糖醇， 木糖醇， 甘油， 碳酸钙, 溶菌酶 , 食用香料；
漱口水( D) 配方设计为: 甘油, 氢化蓖麻油, 溶菌酶， 阿斯巴甜, 冬青油, 薄荷脑；乙醇；食用香精；食用色素, 去离子水;
沐浴露 (E) 配方设计为:椰油酰胺丙基甜菜碱, 乳化硅油，枸橼酸, 香精,EDTA, 溶菌酶, 色素, 去离子水；
洁面乳(G) 配方设计为: 月桂酰肌氨酸钠,杏仁油， 羊毛脂， 硬脂酸单甘油酯，汉生胶, 甘油， 香精， 溶菌酶， 去离子水。
一、样品的处理
取含溶菌酶的牙膏1克，含酶口香糖1克，含酶漱口水1毫升，含酶沐浴露1毫升，含酶洁面乳1毫升，分别加0.1 M ，pH 6.5 磷酸盐缓冲液3mL，在不时轻缓搅拌后室温下放置约2小时，以12，000转/分，离心10分钟， 取上清液作为酶含量的检测样品（A-G）。
不含溶菌酶的样品也按照上述相对应产品的处理方法制备酶空白检测样品（A′- G′）。
二、活性艳红染料标记溶性微球菌 M.lysodeikticus 的制备
1）溶壁微球菌的培养和收集：取菌种，接种于肉汤培养基，37℃培养 12小时以后通过离心3000 rpm收集菌体，经冷冻干燥，获得干燥菌体，该肉汤培养基的质量百分比成分：牛肉膏 0.5%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、琼脂2.5%，pH7.5，压力1 03.4KPa，灭菌 15 分钟以上；
2）活性艳红染料标记溶性微球菌：取干燥菌体 5g，加入 50毫升1.25mol/L NaOH，再加 2.5 克活性染料艳红 K-2BP搅拌均匀，于25℃水浴放置 24 小时进行染色，3000r/min 离心 10 分钟收集染色菌体；染色菌体反复用蒸馏水洗涤并离心以除去未参加反应的游离染料，反复处理直到上清液无色，由此得到净化的染色菌体。
进行酶活力测定时，将染色菌体直接悬于0.1mol/L、pH6.5 的磷酸盐缓冲液内，制成浓度为1%的色源底物溶液；或者将染色菌体冻干保存，使用时用磷酸盐缓冲溶液制备成浓度为1%的色源底物溶液。
三、平板的制备
将灭菌后的含1.6wt% 琼脂的固体培养基250ml冷却至50℃，加色源底物溶液（悬浊液）50ml，混匀后小心倒入直径为150mm 的培养皿平板内，70ml/个，水平放置，待凝固后，放置于洁净工作台内1小时，或置于4℃冰箱存放待第二天使用；使用前用无菌打孔器在每个平板上打出所需的孔洞，弃去孔中琼脂块，形成完整的空穴备用。
四、检测
用移液器向培养皿平板上的琼脂孔内加入不同量的标准溶菌酶溶液以形成梯度，标准溶菌酶溶液参照CAS 编号：12650-88-3，Sigma，同时加入待检测含酶样品（A-G），和未含溶菌酶产品的样品（A′- G′），作为空白对照，加入量100ul /孔；
将平板水平移入37℃恒温培养箱中培养12小时；
酶反应后扩散透明圈直径减去琼脂孔直径即为检测试样的实际透明圈直径，在合适的浓度范围内，溶菌酶的活力与透明圈的直径呈线性关系如图4，以溶菌酶活力单位为纵坐标，透明圈直径为横坐标，绘制标准梯度曲线，根据样品的透明圈直径与标准样品的标准梯度曲线比较，可计算出样品中溶菌酶的活力单位。
试验结果如表1和图1-3所示，
表1
编号 样品名称 透明圈直径（mm） 酶活力单位 U/mg 1 酶标准品 11 1000 2 酶标准品 8.5 500 3 酶标准品 6 100 4 酶标准品 5 50 5 酶标准品 3.5 10 6 空白对照 0 0 A 含酶牙膏 7 250 A′ 云南白药牙膏 0 0 B 含酶牙膏 7 250 B′ 美加净植尚牙膏 0 0 C 含酶口香糖 9 600 C′ 好丽友口香糖 0 0 D 含酶漱口水 5.5 100 D′ 益口佳漱口水 0 0 E 含酶沐浴露 10.5 850 E′ 潘婷沐浴露 0 0 G 含酶洁面乳 2 5 G′ 妮维雅洁面乳 0 0
除上述实施例外，本发明还包括有其他实施方式，凡采用等同变换或者等效替换方式形成的技术方案，均应落入本发明权利要求的保护范围之内。