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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710054441.3 (22)申请日 2017.01.22 (71)申请人 浙江省淡水水产研究所 地址 313001 浙江省湖州市吴兴区杭长桥 南路999号 (72)发明人 刘莉曹铮林锋卢淑娟 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 尉伟敏赵越剑 (51)Int.Cl. C12N 5/078(2010.01) (54)发明名称 一种中华鳖肺巨噬细胞的原代培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种中华鳖肺巨噬细胞的原 代培养方法， 包括中华鳖完。
2、整肺巨噬细胞的分离 及肺巨噬细胞的原代培养两大步骤。 本发明操作 简单， 培养方便， 培养成功率高， 特别是冲洗离体 肺组织， 使得肺组织原代细胞分离培养容易方 便， 为中华鳖病毒研究提供有效的细胞介质。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 106701675 A 2017.05.24 CN 106701675 A 1.一种中华鳖肺巨噬细胞的原代培养方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 一、 中华鳖完整肺巨噬细胞的分离： (1)取100-500g重的中华鳖， 体表消毒， 采用断颈法处死， 解剖取出完整肺部组织； (2)肺部组织置于预冷的加双抗的PBS液中， 去除多余的其它组织， 洗涤3。
3、次， 然后放入 预冷的HBSS平衡盐溶液中； (3)采用含有3胎牛血清的M199液体培养基为洗涤液注入肺部， 冲洗两次， 合并两次 所得的冲洗液； (4)冲洗液过100 m滤网， 一次离心， 去上清， 沉淀加红细胞裂解液裂解红细胞5-8min， 100 m滤网过滤， 二次离心， 二次离心所得细胞沉淀待用； 二、 肺巨噬细胞的原代培养： 二次离心所得细胞沉淀用细胞培养液重悬， 按11065106个/ml细胞分装至细胞培 养瓶培养， 2830， 5CO2条件下培养。 2.根据权利要求1所述的原代培养方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 体表消毒采用0.1 高锰酸钾浸泡20-30min。 3.根据权。
4、利要求1所述的原代培养方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 加双抗的PBS液pH为 7.4， 双抗为500 g/ml青霉素， 500 g/ml链霉素。 4.根据权利要求1或2所述的原代培养方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 冲洗操作为将洗 涤液注入肺部， 保持洗涤液在肺内并晃动1-3分钟， 从气管处倒出洗涤液得到冲洗液。 5.根据权利要求1或2所述的原代培养方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 一次离心参数为 800r/min离心5min， 二次离心参数为800r/min离心5min。 6.根据权利要求1所述的原代培养方法， 其特征在于， 所述细胞培养液为含有20-30 胎牛血清、 100 。
5、g/mL青霉素及100 g/mL链霉素的M199液体培养基。 7.根据权利要求1或2所述的原代培养方法， 其特征在于， 细胞培养瓶使用前， 先用1 明胶铺板， 置于37孵育24h， 再去除明胶。 8.根据权利要求1或2所述的原代培养方法， 其特征在于， 2830， 5CO2条件下培养3 4h后， 更换细胞培养液以去除未贴壁的红细胞和死细胞， 继续培养1216h， 更换细胞培 养液进一步除去残留红细胞， 继续培养。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106701675 A 2 一种中华鳖肺巨噬细胞的原代培养方法 技术领域 0001 本发明涉及一种细胞体外培养方法， 特别涉及一种中华鳖肺巨噬细胞的。
6、原代培养 方法。 背景技术 0002 中华鳖， 又名水鱼、 甲鱼、 团鱼， 是常见的养殖龟种。 中华鳖生活于江河、 湖沼、 池 塘、 水库等水流平缓、 鱼虾繁生的淡水水域， 也常出没于大山溪中。 在安静、 清洁、 阳光充足 的水岸边活动较频繁， 有时上岸但不能离水源太远。 能在陆地上爬行、 攀登， 也能在水中自 由游泳。 喜晒太阳或乘凉风。 民间谚语形容鳖的活动是 “春天发水走上滩， 夏日炎炎柳荫栖， 秋天凉了入水底， 冬季严寒钻泥潭” 。 夏季有晒甲习惯， 寒冷的冬季会冬眠， 翌年开始苏醒寻 食。 喜食鱼虾、 昆虫等， 也食水草、 谷类等植物性食物， 并特别嗜食臭鱼、 烂虾等腐食， 耐饥 饿。
7、， 但贪食且残忍， 如食饵缺乏还会互相残食。 性怯懦怕声响， 白天潜伏水中或淤泥中， 夜间 出水觅食。 0003 中华鳖是国内主要的淡水名优特色养殖品种， 国内第一个淡水鱼类细胞系ZC- 7901由张念慈杨广智(1981)发表在水产学报上。 以后有不少淡水鱼类细胞系的建立。 而中 华鳖细胞体外培养也有报道。 其中吴康， 薛明强等(2000)发表在中国水产科学， 中华鳖胚胎 细胞体外培养的研究； 李晓莉， 曾令兵等(2010)发表在水生态学杂志上的中华鳖5种组织细 胞的离体培养实验； 付建平， 聂品等建立中华鳖主动脉平滑肌细胞系STA(soft-shelled turtle artery)， 于。
8、2013年发表在Fish Pathology上。 上述方法存在操作复杂， 条件较苛 刻， 培养成功率较低的不足。 中华鳖肺巨噬细胞的培养方法也未见报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种中华鳖肺巨噬细胞的原代培养方法， 操作简单， 培养 方便， 培养成功率高， 特别是冲洗离体肺组织， 使得肺组织原代细胞分离培养容易方便， 为 中华鳖病毒研究提供有效的细胞介质。 0005 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 0006 一种中华鳖肺巨噬细胞的原代培养方法， 包括以下步骤： 0007 一、 中华鳖完整肺巨噬细胞的分离： 0008 (1)取100-500g重的中华鳖， 体表消毒， 采。
9、用断颈法处死， 解剖取出完整肺部组织； 0009 (2)肺部组织置于预冷的加双抗的PBS液中， 去除多余的其它组织， 洗涤3次， 然后 放入预冷的HBSS平衡盐溶液中； 0010 (3)采用含有3胎牛血清的M199液体培养基为洗涤液注入肺部， 冲洗两次， 合并 两次所得的冲洗液； 0011 (4)冲洗液过100 m滤网， 一次离心， 去上清， 沉淀加红细胞裂解液裂解红细胞5- 8min， 100 m滤网过滤， 二次离心， 二次离心所得细胞沉淀待用； 0012 二、 肺巨噬细胞的原代培养： 说明书 1/3 页 3 CN 106701675 A 3 0013 二次离心所得细胞沉淀用细胞培养液重悬，。
10、 按11065106个/ml细胞分装至细 胞培养瓶培养， 2830， 5CO2条件下培养。 0014 作为优选， 步骤(1)中， 体表消毒采用0.1高锰酸钾浸泡20-30min。 0015 作为优选， 步骤(2)中， 加双抗的PBS液pH为7.4， 双抗为500 g/ml青霉素， 500 g/ml 链霉素。 0016 作为优选， 步骤(3)中， 冲洗操作为将洗涤液注入肺部， 保持洗涤液在肺内并晃动 1-3分钟， 从气管处倒出洗涤液得到冲洗液。 0017 作为优选， 步骤(4)中， 一次离心参数为800r/min离心5min， 二次离心参数为800r/ min离心5min。 0018 作为优选，。
11、 所述细胞培养液为含有20-30胎牛血清、 100 g/mL青霉素及100 g/mL 链霉素的M199液体培养基。 0019 作为优选， 细胞培养瓶使用前， 先用1明胶铺板， 置于37孵育24h， 再去除明 胶。 这样操作有利于肺巨噬细胞的贴壁生长。 0020 作为优选， 2830， 5CO2条件下培养34h后， 更换细胞培养液以去除未贴壁 的红细胞和死细胞， 继续培养1216h， 更换细胞培养液进一步除去残留红细胞， 继续培养。 0021 本发明的有益效果是： 本发明建立了中华鳖肺巨噬细胞的原代细胞培养方法， 其 特点是操作简单， 培养方便， 无需特定的细胞分离液。 用直接冲洗法即可有效获得。
12、贴壁生长 的肺巨噬细胞， 能在本发明中描述的培养条件下维持正常形态12-20d， 可满足后续较多的 生物学实验， 实用性非常高。 可推广应用于其他爬行类水生动物肺巨噬细胞的原代培养。 附图说明 0022 图1是中华鳖离体肺组织。 0023 图2是贴壁生长的肺巨噬细胞。 0024 图3是肺巨噬细胞的ACP染色鉴定。 具体实施方式 0025 下面通过具体实施例， 对本发明的技术方案作进一步的具体说明。 0026 本发明中， 若非特指， 所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法， 如无特别说明， 均为本领域的常规方法。 0027 实施例： 0028 一种中华鳖肺巨噬细。
13、胞的原代培养方法， 包括以下步骤： 0029 一、 中华鳖完整肺巨噬细胞的分离： 0030 (1)取100-500g重的中华鳖， 采用0.1高锰酸钾浸泡20-30min进行体表消毒， 采 用断颈法处死， 并尽量挤出血后， 解剖取出完整肺部组织(带部分气管， 见图1)； 0031 (2)肺部组织置于预冷的加双抗的PBS液(pH 7.4， 双抗为500 g/ml青霉素， 500 g/ ml链霉素)中， 去除脂肪和结缔组织等多余的其它组织， 洗涤3次， 然后放入预冷的HBSS平衡 盐溶液(市售)中； 0032 (3)用无菌镊子提起与肺部相连的气管， 将含有3胎牛血清的M199液体培养基为 洗涤液注入。
14、肺部， 此时肺部膨胀， 用另一把镊子提起肺底部， 两端轻轻晃动约1-3min， 从气 说明书 2/3 页 4 CN 106701675 A 4 管处倒出洗涤液完成一次冲洗， 重复冲洗1次， 合并两次所得的冲洗液； 0033 (4)冲洗液100 m滤网过滤， 一次离心(800r/min离心5min)， 去上清， 沉淀加红细胞 裂解液(市售)裂解红细胞5-8min， 100 m滤网过滤， 二次离心(800r/min离心5min)， 二次离 心所得细胞沉淀待用； 0034 二、 肺巨噬细胞的原代培养： 0035 二次离心所得细胞沉淀用细胞培养液(含有20-30胎牛血清、 100 g/mL青霉素及 1。
15、00 g/mL链霉素的M199液体培养基)重悬， 按11065106个/ml细胞分装至细胞培养瓶 培养， 2830， 5CO2条件下培养34h后， 更换细胞培养液以去除未贴壁的红细胞和死 细胞， 继续培养1216h， 更换细胞培养液进一步除去残留红细胞， 余下大部分为肺巨噬细 胞， 纯度可达75-90， 继续培养。 细胞培养瓶使用前， 先用1明胶铺板(即明胶覆盖细胞培 养瓶)， 置于37孵育24h， 再去除明胶。 0036 细胞形态观察及鉴定： 在100和400相差显微镜下观察细胞， 其中巨噬细胞呈 大多易于聚集成团生长， 表面粗糙； 有少量红细胞呈椭圆形， 表面较为光滑(图2)。 巨噬细胞 。
16、因酸性磷酸酶活性较高， 经ACP染色试剂盒染色后， 细胞呈红色(图3)。 分离培养后的细胞大 多可被ACP染色试剂染成红色， 表明分离培养的细胞多为肺巨噬细胞。 可用于后续实验。 0037 目前中华鳖肺巨噬细胞细胞可在体外培养12-20天， 细胞仍维持良好状态。 本发明 可获得纯度达75-90肺巨噬细胞， 可用于中华鳖病毒感染等实验研究。 0038 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案， 并非对本发明作任何形式上的 限制， 在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。 说明书 3/3 页 5 CN 106701675 A 5 图1 图2 说明书附图 1/2 页 6 CN 106701675 A 6 图3 说明书附图 2/2 页 7 CN 106701675 A 7 。