一种提高小麦纹枯病抗性的方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101696420 B (45)授权公告日 2012.02.01 CN 101696420 B *CN101696420B* (21)申请号 200910210538.4 (22)申请日 2009.11.09 C12N 15/82(2006.01) A01H 1/02(2006.01) (73)专利权人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京钟灵街 50 号 (72)发明人 周淼平 任丽娟 张鹏 余桂红 孙晓波 张旭 马鸿翔 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 一种提高小麦纹枯病抗性的方法 (。

2、57) 摘要 本发明涉及分子生物学领域， 具体涉及通过 采用基因工程方法将天麻的抗真菌蛋白基因和兔 防御素基因导入常规小麦并表达， 增加小麦的纹 枯病抗性 ； 一种提高小麦纹枯病抗性的方法， 在 于以下步骤 ： 构建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御 素基因的表达载体 pAHC-NP-GAFP ； 通过基因枪法 将 pAHC-NP-GAFP 导入受体小麦幼胚细胞， 对小麦 幼胚细胞愈伤诱导、 植株再生， 获得转基因待选植 株， 通过分子检测， 获得阳性转基因植株， 阳性转 基因植株通过自交和 PCR 筛选， 获得 T5代转基因 纯合株系 ； 对 T5代转基因纯合株系后代进行纹枯 病抗性筛选 ； 筛选出。

3、纹枯病抗性提高的转基因植 株。其优点在于 ： 与常规的种质培育方法相比， 具 有针对性强、 培育周期短、 对重要农艺性状影响小 的特点。 (51)Int.Cl. 审查员 奚静 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 CN 101696420 B1/1 页 2 1. 一种提高小麦纹枯病抗性的方法， 其特征在于以下步骤 ： a、 构建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体 pAHC-NP-GAFP ； b、 通过基因枪法将天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因表达载体 pAHC-NP-GAFP 导入 受体小麦幼胚细胞 ； c、 对所述。

4、的小麦幼胚细胞进行愈伤诱导、 植株再生， 获得转基因待选植株 ； d、 对上述转基因待选植株进行分子检测， 获得阳性转基因植株， 阳性转基因植株通过 自交和 PCR 筛选， 获得 T5代转基因纯合株系 ； e、 对 T5代转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛选 ； f、 筛选出纹枯病抗性提高的转基因植株 ； 所述的天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体 pAHC-NP-GAFP 通过以下步骤 获得 ： A、 制备质粒 pAHC-NP ： 以 pAHC25 为基础质粒， 采用限制性内切酶 XbaI 和 BglII 对 pAHC25质粒DNA进行部分酶切， 切除质粒含有的bar基因， 0.8琼脂。

5、糖电泳， 回收9.1Kb左 右 DNA 酶切大片段， 以 T4DNA 连接酶与 seq1 连接， 连接产物转化大肠杆菌 DH5 感受态细 胞， 转化后的大肠杆菌DH5细胞悬液涂布含100mg/L氨苄青霉素的平板， 对抗氨苄青霉素 的阳性克隆进行扩增并提取质粒， 采用测序和酶切的方法验证连接的正确性， 获得的质粒 命名为 pAHC-NP ； B、 制备 pAHC-NP-GAFP 表达载体 ： pAHC-NP 质粒 DNA 采用限制性内切酶 SmaI 和 SacI 完 全酶切， 切除质粒含有的 GUS 基因， 0.8琼脂糖电泳， 回收 7.3Kb 左右 DNA 酶切大片段， 以 T4DNA连接酶与。

6、Seq2连接， 转化大肠杆菌， 对抗100mg/L氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并 提取质粒， 采用测序和酶切的方法验证连接的正确性， 获得的质粒命名为 pAHC-NP-GAFP 即 为天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体 ； 所述的 seq1 为 ATG GTT GTT TGT GCA TGT AGA CGT GCA CTT TGT TTA CCA CGT GAA CGT CGT GCA GGT TTT TGT AGA ATT CGT GGT AGA ATT CAT CCA CTT TGT TGT CGT CGT TGA ； 所述seq2为ATG AGG GTA CGG TTG AAT 。

7、TCG GGC CAC CAA CTT GAT ACC GGG GGC TCA GTA GCA GAA GGC GGC TAC CTA TTC ATA ATA GAA AAC GAT TGT AAT CTT GTC TTA TAT GAT AAC AAC AGA GCG GTA TGG GCA TCA GGA ACC AAC GGA AAG GCC TAT GGC TGT GTG CTT AAG ATG CAG AAT GAT GGC AAC CTC CTT ATT TAT AGC GGT AGC AGG GCA ATA TGG GCA AGC AAC ACC AAT CGC CAA AAC 。

8、GGT AAC TAC TAT CTG ATC CTT CAG AGA GAT CGT AAC GTC GTC ATA TAC GAT AAT TCT AAT AAT GCG ATT TGG GCA ACC CAC ACC AAC GTT GGA AAT GCT GAA ATC ACT GCC ATC CCA CAC AGC AAC GGC ACA GCG GCG GCG TCT GGC TGA。 2. 根据权利要求 1 所述的一种提高小麦纹枯病抗性的方法， 其特征在于所述的分子检 测为 PCR 分析方法。 3. 根据权利要求 1 所述的一种提高小麦纹枯病抗性的方法， 其特征在于抗小麦纹枯病 。

9、的应用。 权 利 要 求 书 CN 101696420 B1/7 页 3 一种提高小麦纹枯病抗性的方法 技术领域 0001 本发明涉及小麦育种和分子生物学领域， 通过采用基因工程方法将天麻的抗真菌 蛋白基因和防御素基因导入常规小麦并表达， 增加小麦的纹枯病抗性。 背景技术 0002 小 麦 纹 枯 病， 又 称 麦 尖 眼 点 病 (Wheat sharp eyespot)， 是 由 禾 谷 丝 核 菌 (Rhizoctonia cerealis Vander hoeven) 和立枯丝核菌 (Rhizoctonia solaniKuhn) 引起 的一种重要的世界性土传真菌病害， 早在1934年。

10、国外即有报道。 1973年， 我国也发现此病。 20 世纪 80 年代以来， 随着施肥水平的不断提高， 耕作制度的改变和感病品种的大面积推 广， 纹枯病已成为我国长江流域麦区的主要病害， 并逐渐蔓延到黄淮麦区， 近年来以鲁、 豫、 陕、 苏、 皖等麦区发生较为严重(姚金保等， 2007)。 小麦纹枯病一般病田病株率为10-20， 重病田块可达 60-80以上， 由此造成的产量损失严重， 轻的减产 5-10， 重的减产 40， 甚至颗粒无收， 并且小麦纹枯病发病越早， 损失越重 ( 张会云等， 2007)。 0003 目前， 我国小麦纹枯病的防治依然以化学防治为主， 化学防治不仅增加农本， 而且。

11、 会造成环境污染， 化防的效果还直接受到施药的时期、 天气等诸多环境因素的影响。 培育并 推广小麦纹枯病抗病品种无疑是控制该病害最经济和最有效的途径。 但多年的种质材料鉴 定研究也发现， 在已经筛选的近千份材料中， 没有发现对该病害免疫的小麦品种 ( 系 )， 高 抗的材料也较少。对主要纹枯病抗源的抗性遗传和抗病 QTL( 数量性状位点 ) 分析结果表 明， 小麦纹枯病抗性是由主基因和微效基因共同作用的数量性状， 并且存在复杂的基因互 作 ( 汤颋等， 2004 ； 吴纪中等， 2005 ； 张小村等， 2005 ； 任丽娟等， 2007)。由于遗传方式的复 杂， 给常规育种带来诸多困难， 如。

12、周期性强、 预见性差等， 直接影响了小麦纹枯病抗性改良 的进度。 0004 近年来， 转基因技术由于周期短、 可用的抗性基因多、 针对性强等优点， 已经成为 提高作物抗病能力的新手段。采用这一方法， 来自于小麦近缘种中间偃麦草的乙烯反应因 子 (ERF) 基因已经被导入小麦并获得纹枯病抗性显著提高的转基因小麦植株 (Chen Liang 等， 2008)。 0005 天麻抗真菌蛋白 (Gastrodia antifungal protien， GAFP) 位于天麻次生块茎的 表皮和皮层， 对天麻次生块茎阻抑蜜环菌侵染有关， 离体抑菌实验表明天麻抗真菌蛋白对 多种真菌均有抑菌活性 ( 胡忠等， 。

13、1988)， 该基因已经被克隆 (http:/www.ncbi.nlm.nih. gov/ ； GenBank ： AF225410)。防御素是一类广泛存在于生物体内的富含半胱氨酸的阳离子 抗菌肽， 其作用机理特殊 ： 带正电荷的防御素分子与带负电荷的靶细胞膜接触后， 通过靶 细胞膜产生的电动势将形成疏水面的防御素二聚体注入细胞膜， 多个二聚体可形成跨膜离 子通道， 扰乱细胞膜通透性及细胞能量状态， 导致细胞膜去极化， 呼吸作用受抑制以及细胞 ATP 含量下降， 最终使靶细胞死亡 ； 防御素抗病毒作用则是通过与病毒外壳蛋白结合而导 致病毒失去生物活性(童青春等， 1999 ； 龙晶等， 200。

14、7)。 防御素的抗菌谱广， 不但对细菌、 真 菌、 和被膜病毒有广谱的毒杀效应， 对某些恶性肿瘤细胞也有毒杀作用。 来自于兔的防御素 说 明 书 CN 101696420 B2/7 页 4 NP-1 已进行氨基酸序列测定 (GenBank ： AAB21588)。本发明采用基因工程方法将天麻抗真 菌蛋白基因以及兔防御素 NP-1 基因导入普通小麦， 提高了小麦的纹枯病抗性。 发明内容 0006 本发明目的在于 ： 针对目前小麦纹枯病抗性种质资源贫乏状况， 采用转基因方法 将抗小麦纹枯病病原菌的天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因导入感纹枯病的小麦品种， 从而提高小麦的纹枯病抗性。 0007 本发明。

15、目的是这样实现的 ： 构建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载 体 ； 采用基因枪方法将构建的表达载体导入受体小麦幼胚细胞 ； 通过组织培养过程筛选， 获得转基因待选植株 ； 对待选植株进行 PCR( 聚合酶链式反应 ) 分析， 获得整合并表达天麻 抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的转基因植株 ； 对纯合的转基因植株后代株系进行纹枯病 抗性鉴定， 筛选并获得纹枯病抗性提高的小麦转基因株系。 0008 在本发明中 ： 所述的构建天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体是这样 实现的， 以 pAHC25( 附图一 ) 为基础质粒， 采用限制性内切酶 Xba I 和 Bgl II 对 pAHC25。

16、 质 粒 DNA 进行部分酶切， 切除质粒含有的 bar 基因， 0.8琼脂糖电泳， 回收 9.1Kb 左右 DNA 酶 切大片段， 与起始密码子 ATG 前和终止密码子 TGA 后分别添加 Xba I 和 Bgl II 酶切位点的 兔防御素 NP-1 基因 ( 由 GenBank ： AAB21588 氨基酸序列推导的 DNA 碱基序列添加 ATG 起 始密码子和终止密码子 TGA， 完整 DNA 序列见 Seq1)DNA 片段， 采用 T4DNA 连接酶 16连接 过夜 (25ul 反应体系含 1T4DNA 连接酶缓冲液， 质粒大片段 0.3pmol， 兔防御素 NP-1 基因 片段 0.。

17、03pmol， 350uT4DNA 连接酶， 连接产物转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞 ( 转化方法参 照 分子克隆实验指南 第二版， P55-56 页， 科学出版社， 1992)， 转化后的大肠杆菌 DH5 细 胞悬液涂布含 100mg/L 氨苄青霉素的平板， 对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质 粒， 采用测序和酶切的方法验证连接的正确性， 获得的质粒命名为 pAHC-NP ； pAHC-NP 质粒 DNA采用限制性内切酶Sma I和Sac I完全酶切， 切除质粒含有的GUS基因， 0.8琼脂糖电 泳， 回收 7.3Kb 左右 DNA 酶切大片段， 再与起始密码子 ATG 前和终止密码。

18、子 TGA 后分别添加 Sma I 和 Sac I 酶切位点的天麻抗真菌蛋白基因 (GenBank ： AF225410 添加起始密码子 ATG 和终止密码子 TGA， 完整 DNA 序列见 seq2)DNA 片段采用 T4DNA 连接酶按上文连接条件进行 连接， 连接产物按上文方法转化大肠杆菌， 对抗 100mg/L 氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增 并提取质粒， 采用测序和酶切的方法验证连接的正确性， 获得的质粒命名为 pAHC-NP-GAFP 即为天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体 ( 见附图二 )。采用基因枪转基因方 法将构建的表达载体导入受体小麦幼胚细胞， 通过愈伤诱导、 植株再。

19、生获得转基因待选植 株 ( 参照周淼平等， 小麦基因枪法转化技术的改进， 江苏农业学报， 1999， 15(1) ： 62-64) ； 所 述的受体小麦是指六倍体常规小麦 ； 所述的幼胚是指开花后 12-14 天的幼胚。 0009 在本发明的应用中 ： 对待选植株进行分子检测， 获得整合并表达天麻抗真菌蛋白 基因和兔防御素基因的阳性转基因植株， 阳性转基因植株通过自交和 PCR 筛选， 获得 T5代 转基因纯合株系 ； 对 T5代转基因纯合株系后代系进行纹枯病抗性筛选， 获得纹枯病抗性提 高的转基因植株。 0010 所述的分子检测为 PCR 分析方法。PCR 分析是指提取待选转基因小麦及其后代。

20、的 基因组 DNA( 脱氧核糖核酸 )， 以此为模板对天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因片段进行 说 明 书 CN 101696420 B3/7 页 5 PCR扩增， 能扩增出相应基因片段的植株为阳性转基因植株。 天麻抗真菌蛋白基因的PCR检 测引物为5 CTA GCACAA GGC GGC TAC CTA TTC 3 和5 GCA GTG ATT TCA GCA TTT CCAACG 3 ， 扩增条件 ： 95 3 分钟 ； 94 1 分钟， 62 45 秒， 72 30 秒， 共 30 个循环 ； 最后 72延 伸 5 分钟。扩增片段大小为 305bp， 检测电泳图见附图 3。兔防御素基因的。

21、 PCR 检测引物 为 5 ATG GTT GTT TGT GCATGT AG 3 和 5 CAA CGA CGA CAA CAA AGT GG 3 ， 扩增条件 ： 95 3 分钟 ； 94 1 分钟， 60 45 秒， 72 30 秒， 共 35 个循环 ； 最后 72延伸 5 分钟。扩 增片段大小为 104bp， 检测电泳图见附图 4。 0011 纹枯病抗性鉴定是指采用具有较强致病力的纹枯病病原菌进行牙签嵌入法接种 ( 具体鉴定方法参照蔡士宾等， 小麦抗纹枯病种质创新及 QTL 定位的初步研究， 中国农业科 学， 2006， 39(5) ： 928-934)， 根据病情指数判定其纹枯病抗。

22、性。 具体做法如下 ： 将长1.0cM左 右的牙签水浸 30 分钟后， 铺于烧杯底部， 加入适量 PDA 培养基， 经高温湿热灭菌后， 接种具 有较强致病力的纹枯菌菌丝块， 25恒温培养 30 天， 待菌丝密集布满短牙签表面。小麦拔 节期将经上述方法处理的牙签嵌入到小麦植株贴近地面的基部第 1 2 叶鞘之间， 每株系 接种 15 个茎秆， 喷雾保湿 7 天。于小麦乳熟期调查纹枯病发病情况， 计算病情指数， 根据病 情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。 0012 病情严重度判定标准如下 ： 0 级 ： 无病症 ； 1 级 ： 叶鞘有典型的纹枯病病斑， 但不侵 茎 ； 2 级 ： 病菌侵人茎秆， 病斑。

23、宽度环茎不超过茎秆周长的 1/2 ； 3 级 ： 病菌侵人茎秆， 茎秆上 病斑环茎宽度在1/2-3/4茎秆周长之间 ； 4级 ： 病菌侵人茎秆， 茎秆上病斑绕茎秆3/4以上， 或茎秆已软腐 ； 5 级 ： 枯孕穗或枯白穗。 0013 病情指数按以下公式计算 ： 0014 病情指数(各级病株数各级代表值)/(总株数最高级代表值)100 0015 纹枯病抗性判定标准 ： 病情指数 20 为 “高抗” ； 20 病情指数 50 为 “抗病” ； 50 病情指数 80 为 “感病” ； 80 病情指数 100 为 “高感” 。本发明的优点在于 ： 与常 规的种质培育方法相比， 选取的目的基因对纹枯病病。

24、原菌的生长有抑制作用， 针对性强 ； 由 转化植株到纯合的转基因株系时间短并且对受体亲本的重要农艺性状影响小， 培育的周期 短、 减少对重要农艺性状选育所需的人工经验的依赖性。 附图说明 0016 图 1pAHC25 的示意图 0017 图 2 天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体 pAHC-NP-GAFP 的示意图 0018 图 3 部分转基因待选植株天麻抗真菌蛋白基因的 PCR 检测的电泳图， 其中 0019 1 ： 未转基因扬麦 158 对照。 0020 2 ： 质粒 pAHC-NP-GAFP。 0021 12 ： DNA 分子量标准， 条带从上到下分别为 2000bp、 1000。

25、bp、 750bp、 500bp、 250bp 和 100bp。 0022 3-11， 13-24 ： 转基因待选植株。 其中4-6， 8-11， 13-18， 20-24为转天麻抗真菌蛋白 基因的阳性植株。 0023 图 4 为部分转基因待选植株兔防御素基因的 PCR 检测的电泳图， 其中 0024 CK+： 质粒 pAHC-NP-GAFP。 说 明 书 CN 101696420 B4/7 页 6 0025 CK-： 未转基因扬麦 158 对照。 0026 1-16 ： 转基因待选植株。其中 1， 3-6， 10-15 为转兔防御素基因的阳性植株。 具体实施方式 0027 实施例 1 ： 0。

26、028 以 pAHC25 为基础质粒， 采用限制性内切酶 Xba I 和 Bgl II 对 pAHC25 质粒 DNA 进 行部分酶切， 切除质粒含有的 bar 基因， 0.8琼脂糖电泳， 回收 9.1Kb 左右 DNA 酶切大片 段， 与起始密码子 ATG 前和终止密码子 TGA 后分别添加 Xba I 和 Bgl II 酶切位点的兔防 御素 NP-1 基因 ( 由 GenBank ： AAB21588 氨基酸序列推导的 DNA 碱基序列添加 ATG 起始密 码子和终止密码子 TGA， 完整 DNA 序列见 seq1)DNA 片段， 采用 T4DNA 连接酶 16连接过夜 (25ul 反应体。

27、系含 1T4DNA 连接酶缓冲液， 质粒大片段 0.3pmol， 兔防御素 NP-1 基因片段 0.03pmol， 35uT4DNA 连接酶， 连接产物转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞 ( 转化方法参照 分 子克隆实验指南 第二版， P55-56 页， 科学出版社， 1992)， 转化后的大肠杆菌 DH5 细胞悬 液涂布含 100mg/L 氨苄青霉素的平板， 对抗氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取质粒， 采用测序和酶切的方法验证连接的正确性， 获得的质粒命名为 pAHC-NP ； pAHC-NP 质粒 DNA 采用限制性内切酶 Sma I 和 Sac I 完全酶切， 切除质粒含有的 GUS 基。

28、因， 0.8琼脂糖电泳， 回收7.3Kb左右DNA酶切大片段， 再与起始密码子ATG前和终止密码子TGA后分别添加Sma I 和 Sac I 酶切位点的天麻抗真菌蛋白基因 (GenBank ： AF225410 添加起始密码子 ATG 和终 止密码子 TGA， 完整 DNA 序列见 seq2)DNA 片段采用 T4DNA 连接酶按上文连接条件进行连接， 连接产物按上文方法转化大肠杆菌， 对抗 100mg/L 氨苄青霉素的阳性克隆进行扩增并提取 质粒， 采用测序和酶切的方法验证连接的正确性， 获得的质粒命名为 pAHC-NP-GAFP 即为天 麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的表达载体 ( 见附图。

29、二 )。 0029 以扬麦 158 为受体， 采用基因枪法， 将天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因同时 导入扬麦 158 幼胚细胞， 通过愈伤诱导、 植株再生获得转基因待选植株 ( 参照周淼平等， 小 麦基因枪法转化技术的改进， 江苏农业学报， 1999， 15(1) ： 62-64)， 对待选植株进行 PCR 筛 选， 天麻抗真菌蛋白基因的 PCR 检测引物为 5 CTA GCA CAA GGC GGC TAC CTA TTC 3 和 5 GCAGTG ATT TCA GCA TTT CCAACG 3 ， 扩增条件 ： 95 3 分钟 ； 94 1 分钟， 62 45 秒， 72 30 秒， 。

30、共 30 个循环 ； 最后 72延伸 5 分钟。扩增片段大小为 305bp， 检测电泳图见附 图 3。兔防御素基因的 PCR 检测引物为 5 ATGGTT GTT TGT GCA TGTAG 3 和 5 CAA CGA CGA CAA CAAAGT GG3 ， 扩增条件 ： 953分钟 ； 941分钟， 6045秒， 7230秒， 共35个 循环 ； 最后 72延伸 5 分钟。扩增片段大小为 104bp， 检测电泳图见附图 4。获得整合并表 达天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的转基因植株， 转基因植株通过自交和 PCR 筛选， 获得 T5代转基因纯合株系， 对转基因纯合株系后代进行纹枯病抗性筛。

31、选。 0030 纹枯病抗性筛选采用江苏省农业科学院植物保护研究所提供的具较强纹枯病致 病力菌株R3010接种， 接种采用牙签接菌法(具体鉴定方法参照蔡士宾等， 小麦抗纹枯病种 质创新及QTL定位的初步研究， 中国农业科学， 2006， 39(5) ： 928-934)， 将长1.0cM左右的牙 签水浸 30 分钟后， 铺于烧杯底部， 加入适量 PDA 培养基， 经高温湿热灭菌后， 接种具有较强 致病力的纹枯菌菌丝块， 25恒温培养 30 天， 待菌丝密集布满短牙签表面。小麦拔节期将 经上述方法处理的牙签嵌入到小麦植株贴近地面的基部第 1 2 叶鞘之间， 每株系接种 15 说 明 书 CN 10。

32、1696420 B5/7 页 7 个茎秆， 喷雾保湿 7 天。于小麦乳熟期调查纹枯病发病情况， 计算株系平均病情指数， 根据 病情指数判定小麦植株的纹枯病抗性。 0031 病情严重度判定标准如下 ： 0 级 ： 无病症 ； 1 级 ： 叶鞘有典型的纹枯病病斑， 但不侵 茎 ； 2 级 ： 病菌侵人茎秆， 病斑宽度环茎不超过茎秆周长的 1/2 ； 3 级 ： 病菌侵人茎秆， 茎秆上 病斑环茎宽度在 1/23/4 茎秆周长之间 ； 4 级 ： 病菌侵人茎秆， 茎秆上病斑绕茎秆 3/4 以上， 或茎秆已软腐 ； 5 级 ： 枯孕穗或枯白穗。 0032 病情指数按以下公式计算 ： 0033 病情指数(。

33、各级病株数各级代表值)/(总株数最高级代表值)100 0034 纹枯病抗性判定标准 ： 病情指数 20 为 “高抗” ； 20 病情指数 50 为 “抗病” ； 50 病情指数 80 为 “感病” ； 80 病情指数 100 为 “高感” 。 0035 纹枯病抗性鉴定结果见表 1， 受体对照亲本的病情指数为 80.0， 属高感类型， 23 个 导入天麻抗真菌蛋白基因和兔防御素基因的 T5代纯合株系的平均病情指数在 21.0-46.0 之间， 都属于抗病类型， 表明由于双价基因的导入， 可以使转基因植株的纹枯病抗性得到大 幅提高。 0036 表 1 扬麦 158 转基因 T5代纯合株系的纹枯病抗。

34、性鉴定结果 0037 说 明 书 CN 101696420 B6/7 页 8 转基因株系 平均病级 平均病情指数 抗性评价 TG-1 TG-2 TG-3 TG-4 1.6 1.5 1.9 2.3 32.0 29.5 38.0 46.0 抗病 抗病 抗病 抗病 TG-7 TG-8 TG-10 TG-15 TG-17 TG-19 TG-20 TG-25 TG-30 TG-31 TG-32 TG-35 TG-39 TG-40 TG-50 TG-54 TG-60 TG-70 TG-71 扬麦 158 2.2 2.0 2.3 1.5 1.4 1.1 2.4 1.6 1.4 1.4 1.6 1.8 1.4。

35、 2.1 1.1 1.3 1.6 1.7 1.2 4.0 43.3 40.8 45.0 29.3 28.3 21.7 43.0 32.9 28.2 28.7 31.0 36.0 28.7 41.3 21.0 33.0 32.0 34.0 24.5 80.0 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 抗病 高感 0038 序列表 0039 江苏省农业科学院 0040 一种提高小麦纹枯病抗性的方法 0041 0042 6 0043 PatentIn version 3.3 0044 1 0045 105 0046 DNA 0047 。

36、人工序列 0048 1 0049 atggttgttt gtgcatgtag acgtgcactt tgtttaccac gtgaacgtcg tgcaggtttt 60 0050 tgtagaattc gtggtagaat tcatccactt tgttgtcgtc gttga 105 0051 2 0052 393 说 明 书 CN 101696420 B7/7 页 9 0053 DNA 0054 人工序列 0055 2 0056 atgagggtac ggttgaattc gggccaccaa cttgataccg ggggctcagt agcagaaggc 60 0057 ggctac。

37、ctat tcataataga aaacgattgt aatcttgtct tatatgataa caacagagcg 120 0058 gtatgggcat caggaaccaa cggaaaggcc tatggctgtg tgcttaagat gcagaatgat 180 0059 ggcaacctcc ttatttatag cggtagcagg gcaatatggg caagcaacac caatcgccaa 240 0060 aacggtaact actatctgat ccttcagaga gatcgtaacg tcgtcatata cgataattct 300 0061 aataat。

38、gcga tttgggcaac ccacaccaac gttggaaatg ctgaaatcac tgccatccca 360 0062 cacagcaacg gcacagcggc ggcgtctggc tga 393 0063 3 0064 24 0065 DNA 0066 人工序列 0067 3 0068 ctagcacaag gcggctacct attc 24 0069 4 0070 24 0071 DNA 0072 人工序列 0073 4 0074 gcagtgattt cagcatttcc aacg 24 0075 5 0076 20 0077 DNA 0078 人工序列 0079 5 0080 atggttgttt gtgcatgtag 20 0081 6 0082 20 0083 DNA 0084 人工序列 0085 6 0086 caacgacgac aacaaagtgg 20 说 明 书 CN 101696420 B1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101696420 B2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 。