一种干酪乳杆菌菌株及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611125795.4 (22)申请日 2016.12.09 (83)生物保藏信息 CGMCC 12363 2016.04.18 (71)申请人 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号 (72)发明人 凌键茆振川谢丙炎杨宇红 曹鸿一 (74)专利代理机构 北京东正专利代理事务所 (普通合伙) 11312 代理人 张伟朴 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01N 。

2、63/02(2006.01) A01P 5/00(2006.01) C12R 1/245(2006.01) (54)发明名称 一种干酪乳杆菌菌株及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种干酪乳杆菌菌株及其应 用， 所述菌株为干酪乳杆菌菌株Lac-1， 保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCCNO.12363。 干酪乳杆菌菌株 Lac-1制备的生防菌剂在防治根结线虫中的应 用。 本发明中的干酪乳杆菌分离自土壤， 对于根 结线虫具有良好的防效， 易于在土壤中定植， 且 利于早期防控根结线虫危害， 该菌株对于解决根 结线虫的防治具有巨大的应用潜力， 有助于实现 蔬菜的。

3、高产、 安全、 无公害生产； 干酪乳杆菌Lac- 1菌株的发酵液对根结线虫的致死率达到100， 在温室中的防治效果达到88.7， 防治效果高且 稳定， 适于农业生产需求。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 106676036 A 2017.05.17 CN 106676036 A 1.一种干酪乳杆菌菌株， 其特征在于， 所述菌株为干酪乳杆菌菌株Lac-1， 保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为CGMCC NO.12363。 2.利用权利要求1所述的干酪乳杆菌菌株制备的生防菌剂。 3.权利要求2所述的干酪乳杆菌菌株制备的生防菌剂在防治根结线虫中的应用。 4.。

4、根据权利要求3所述的干酪乳杆菌菌株制备的生防菌剂在防治根结线虫中的应用， 其特征在于， 所述根结线虫为南方根结线虫。 5.权利要求2所述的生防菌剂制备方法， 其特征在于， 该方法包括以下步骤： (1)将干酪乳杆菌菌株Lac-1划线接种在LB培养基上， 恒温培养后得到单株菌落； (2)将(1)步得到的单株菌落接种在种子培养基中， 恒温振荡培养后得到种子液； (3)将种子液接种到灭菌的发酵培养基中进行发酵培养， 获得浓度为107-1010cfu/mL的 发酵液； 然后将发酵液直接分装成液体剂型。 6.根据权利要求5所述的生防菌剂制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中在恒温培养箱中 培养48-72h。

5、， 培养温度为35-40。 7.根据权利要求5所述的生防菌剂制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中LB培养基配方为： 酵母粉5g/L， 蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L， 余量为水。 8.根据权利要求5所述的生防菌剂制备方法， 其特征在于， 步骤(2)中在恒温摇床上振 荡培养， 转速200rpm， 温度为35-40， 振荡培养24-36h。 9.根据权利要求5所述的生防菌剂制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中将种子液以接种 量1-2接种到发酵培养基中， 发酵温度为35-40。 10.根据权利要求5所述的生防菌剂制备方法， 其特征在于， 步骤(2)中的种子培养基与 步骤(3)中的发酵培。

6、养基均为LB培养基。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106676036 A 2 一种干酪乳杆菌菌株及其应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物技术领域， 具体涉及一种干酪乳杆菌菌株及其应用。 背景技术 0002 根结线虫(Meloidogyne)是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫。 已知危害蔬 菜的线虫主要有花生根结线虫、 北方根结线虫、 南方根结线虫、 爪哇根结线虫以及甜菜根结 线虫等。 线虫寄主范围广泛， 常危害瓜类、 茄果类、 豆类及萝 卜、 葫萝 卜、 莴苣、 白菜等30多种蔬 菜， 还能传播一些真菌和细菌性病害。 根结线虫是一种重要的农作物病原物， 每年造成大约 数十亿的损失。

7、。 根结线虫主要侵染农作物的根部， 侵染后的根部膨大形成巨大的根结， 可相 互连接形成串珠状， 由于根部被破坏， 影响正常的吸收机能， 所以地上部生长发育受阻， 被 侵染后的植株地上部表现矮化， 叶部黄化， 结果小而且少。 天气干燥时易萎蔫或枯萎。 长期 连作的温室中， 特别是可以使西瓜、 黄瓜、 番茄等绝产。 0003 由于抗根结线虫病的种质资源稀少， 所以在生产中化学防治仍然是防治根结线虫 的重要措施， 如棉隆、 氯化苦和百亩威等， 这些药剂虽然杀虫快， 但是会严重降低蔬菜质量， 污染环境， 破坏生态平衡， 使用过程中对人、 畜不安全， 因此生物防治措施日益受到人们的 关注。 发明内容 0。

8、004 本发明的目的是为了解决现有技术中化学防治存在的污染环境、 不安全的问题， 提供一种干酪乳杆菌菌株及其应用。 0005 为实现上述目的， 本发明提供了一种干酪乳杆菌菌株， 所述菌株为干酪乳杆菌菌 株Lac-1， 建议的分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei； 保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 保藏地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所， 保藏日期为2016年4月18日， 保藏编号为CGMCC 12363。 0006 本发明还提供了一种利用干酪乳杆菌菌株制备的生防菌剂。 0007 本发明还提供了干酪乳杆菌菌株制备。

9、的生防菌剂在防治根结线虫中的应用。 0008 进一步的， 所述根结线虫为南方根结线虫。 0009 本发明还提供了干酪乳杆菌菌株制备生防菌剂的方法， 该方法包括以下步骤： 0010 (1)将干酪乳杆菌菌株Lac-1划线接种在LB培养基上， 恒温培养后得到单株菌落； 0011 (2)将干酪乳杆菌菌株Lac-1的单株菌落接种在种子培养基中， 恒温振荡培养后得 到种子液； 0012 (3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养， 获得浓度为107- 1010cfu/mL的发酵液； 然后将发酵液直接分装成液体剂型。 0013 进一步的， 步骤(1)中在恒温培养箱中培养48-72h， 培养温度为3。

10、5-40。 0014 进一步的， 步骤(1)中LB培养基配方为： 酵母粉5g/L， 蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L， 余 量为水。 说明书 1/6 页 3 CN 106676036 A 3 0015 进一步的， 步骤(2)中在恒温摇床振荡培养， 转速200rpm， 温度为35-40， 振荡培 养24-36h。 0016 进一步的， 步骤(3)中将种子液以接种量1-2接种到发酵培养基中， 发酵温度为 35-40。 0017 进一步的， 步骤(2)中的种子培养基与步骤(3)中的发酵培养基均为LB培养基。 0018 本发明的有益效果为： 本发明中的干酪乳杆菌分离自土壤， 对于根结线虫具有良。

11、 好的防效， 易于在土壤中定植， 且利于早期防控根结线虫危害， 该菌株对于解决根结线虫的 防治具有巨大的应用潜力， 有助于实现蔬菜的高产、 安全、 无公害生产； 干酪乳杆菌Lac-1菌 株的发酵液对根结线虫的致死率达到100， 在温室中的防治效果达到88.7， 防治效果高 且稳定， 适于农业生产需求。 附图说明 0019 图1为本发明干酪乳杆菌菌株Lac-1的菌落形态图。 具体实施方式 0020 下面结合实施例和附图对本发明进行详细地解释说明。 0021 实施例1 0022 干酪乳杆菌的分离、 纯化及鉴定： 0023 从顺义番茄种植田块中均匀取土壤样品， 10g土壤分别与100mL灭菌水进行混。

12、合制 成悬浮液， 然后依次进行梯度稀释， 取稀释10000倍的土壤混液100 L涂布于LB培养基平板 上， LB培养基温度37， LB培养基的配方为： 酵母粉5g/L， 蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L， 琼脂粉 1.3-1.5g/100mL， 定容至1L。 将培养基置于25培养， 待组织块长出菌落后， 进行单孢分离， 挑取单菌落在LB培养基上纯化， 用于分类鉴定。 根据 伯杰氏细菌鉴定手册 对菌株进行形 态学测定。 0024 挑取菌落， 放入盛有300 L细菌裂解液SDS的EP管中， 65裂解2小时， 然后用细菌 基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)提取细菌DNA， 以DN。

13、A为模板， 用引物27F和 1492R分别进行16s rRNA序列扩增。 PCR扩增反应体系为50L， 含有5L 10Ex Taq Buffer， 1 L Ex Taq酶， 5 L dNTP(2.5mM each)， 1 L正向引物， 1 L反向引物， 3 L DNA模板， 无菌水34 L。 扩增条件： 94预变性5min； 94变性30s， 55退火30s， 72延伸2.5min， 30 个循环； 72延伸10min。 扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳分离鉴定， PCR产物直接进行双向 测序。 0025 结果： 0026 参见附图1， 获得Lac-1菌株在LB培养基平板上， 37， 培养3天后， 。

14、菌落大小为1.0- 3.0mm， 正面为圆形， 边缘整齐， 侧面低凸， 表面湿润光滑， 乳白色， 不透明， 稍有酸味， 经革兰 氏染色在光学显微镜下观察发现菌株的形态呈短杆整齐长链状排列。 将其与 伯杰氏细菌 鉴定手册 以及其他著作中乳杆菌属内专性同型发酵的鉴别特征表相对比， 并结合中的上 述细胞形态， 确定该菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。 0027 用引物27F和1492R分别进行16s rRNA序列扩增， PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳。 经测序分析菌株扩增的序列长为1400bp。 将菌株的16s rRNA 序列进行BLAST分析后， 结果 说明书 2/6 页 。

15、4 CN 106676036 A 4 显示， Lac-1菌株与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)相似度达到了100， 鉴定菌株为干 酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。 0028 实施例2 0029 1、 Lac-1菌株发酵液的制备方法， 包括以下步骤： 0030 (1)将干酪乳杆菌菌株Lac-1划线接种在LB培养基上， 在恒温培养箱中平板培养 60h， 培养温度设定为37， 得到单株菌落。 0031 (2)将干酪乳杆菌菌株Lac-1的单株菌落接种在种子培养基(LB培养基)中， 在恒温 摇床振荡培养， 转速200rpm， 温度为37， 振荡培养30h； 液体种。

16、子培养基配方为LB培养基， 即酵母粉5g/L， 蛋白胨10g/L， NaCl10g/L， 定容至1L。 0032 (3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养， 接种量为1， 温度设 定为37， 获得浓度为107cfu/mL的发酵液(原液)； 液体发酵培养基配方为LB培养基， 即酵 母粉5g/L， 蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L， 定容至1L。 0033 将发酵液及其10倍、 100倍稀释液分别处理根结线虫(Meloidogyne spp.)， 测定干 酪乳杆菌发酵产物对根结线虫的杀死效果。 0034 2、 制备试验用线虫 0035 采自中国农业科学院蔬菜花卉研究所温室。 将。

17、培养根结线虫的辣椒根系取出， 用 水轻轻冲洗， 小心取下卵块， 放在1的次氯酸钠中消毒3min， 再用无菌水冲洗3次， 放在含 有少量无菌水的培养皿中， 在25恒温箱中培养， 每隔24h收集一次孵化的根结线虫二龄幼 虫。 0036 3、 试验方法 0037 在无菌的细胞培养板上， 分别向孔内加入不同浓度的发酵液各1mL， 并以无菌水作 为对照， 然后分别向处理和对照中加入100 L线虫悬浮液(100条线虫)， 放在室温下24h， 观 察根结线虫的死亡情况， 计算校正死亡率， 即为杀线虫效果， 每个处理24个孔(样本)， 每个 试验重复3次。 0038 校正死亡率()(处理线虫死亡率对照线虫死亡。

18、率)/(1对照线虫死亡率) 100 0039 4、 试验结果： 0040 通过上述试验， 测定不同倍数发酵液处理24h对根结线虫的毒力效果， 结果表明不 同发酵液倍数对线虫的作用效果不同， 发酵液原液的作用根结线虫的校正死亡率为100， 发酵液稀释后防治效果明显降低在10倍稀释液中杀线虫过只有77.8， 而在100倍稀释液 中线虫死亡率很低(10)， 与对照的差异很小。 试验说明发酵液在高浓度下具有良好的防 治根结线虫效果。 0041 表1不同浓度的Lac-1菌株发酵液杀线虫效果 说明书 3/6 页 5 CN 106676036 A 5 0042 0043 实施例3 0044 1、 Lac-1。

19、菌株发酵液的制备方法， 包括以下步骤： 0045 (1)将干酪乳杆菌菌株Lac-1划线接种在LB培养基上， 在恒温培养箱中平板培养 60h， 培养温度为37， 得到单株菌落。 0046 (2)将干酪乳杆菌菌株Lac-1的单株菌落接种在种子培养基中， 在恒温摇床振荡培 养， 转速200rpm， 温度为37， 振荡培养30h； 液体种子培养基配方为LB培养基， 即酵母粉5g/ L， 蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L， 定容至1L。 0047 (3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养， 接种量为1， 温度设 定为37， 获得浓度为107cfu/mL的发酵液； 液体发酵培养基配方为。

20、LB培养基， 即酵母粉5g/ L， 蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L， 定容至1L。 0048 在番茄幼苗上接种Lac-1菌株的发酵液1mL， 2天后， 接种南方根结线虫二龄幼虫， 每株接种1000条， 并在5周后检测根结数量， 计算防治效果。 每个处理30株番茄苗， 每个处理 重复3次。 并以清水处理作为对照。 0049 根结线虫病情分级标准为： 0050 表2番茄根结线虫病病情级别划分 0051 0052 根结指数计算： 0053 调查每份鉴定材料根部发病情况， 根据病害症状描述， 逐份材料进行调查， 记载病 情级别， 计算出根结指数(RKI)。 说明书 4/6 页 6 CN 10。

21、6676036 A 6 0054 根结指数按下列公式计算： 0055 根结指数()(sn)/NM100 0056 式中： 0057 -各病情级别代表数值与其相对应病情级别病株数乘积的总和； 0058 S-各病情级别代表数值； 0059 n-各病情级别病株数； 0060 N-调查总株数； 0061 M-最高病情指数。 0062 防治效果计算公式： 0063 防治效果()(1处理根结数/对照根结数)100 0064 2、 试验结果 0065 处理结果见表2， 通过试验可以看出在发酵液处理后番茄植株上的根结数量显著 降低， 在对照处理中根结数量平均为113.4个/株， 而在菌株Lac-1处理的番茄中。

22、的根结数量 平均为12.7个/株， Lac-1菌株对根结线虫的防治效果达到了88.7， 说明生防菌剂可以有 效的防治番茄根结线虫。 在农业生产， 特别是设施番茄栽培中防治根结线虫病具有重要价 值。 0066 表2不同处理根结数量及防治效果 0067 0068 实施例4 0069 一种Lac-1菌株生防菌剂的制备方法， 包括以下步骤： 0070 (1)将干酪乳杆菌菌株Lac-1划线接种在LB培养基上， 在恒温培养箱中平板培养 48h， 培养温度设定为35， 得到单株菌落。 0071 (2)将干酪乳杆菌菌株Lac-1的单株菌落接种在种子培养基(LB培养基)中， 在恒温 摇床振荡培养， 转速200r。

23、pm， 温度为35， 振荡培养24h； 液体种子培养基配方为LB培养基， 即酵母粉5g/L， 蛋白胨10g/L， NaCl10g/L， 定容至1L。 0072 (3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养， 接种量为1， 温度设 定为35， 获得浓度为107cfu/mL的发酵液(原液)， 液体发酵培养基配方为LB培养基， 即酵 母粉5g/L， 蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L， 定容至1L； 然后将得到的发酵液直接分装成液体剂 型。 0073 实施例5 0074 一种Lac-1菌株生防菌剂的制备方法， 包括以下步骤： 0075 (1)将干酪乳杆菌菌株Lac-1划线接种在LB培养。

24、基上， 在恒温培养箱中平板培养 72h， 培养温度为40， 得到单株菌落。 0076 (2)将干酪乳杆菌菌株Lac-1的单株菌落接种在种子培养基中， 在恒温摇床振荡培 养， 转速200rpm， 温度为40， 振荡培养36h； 液体种子培养基配方为LB培养基， 即酵母粉5g/ 说明书 5/6 页 7 CN 106676036 A 7 L， 蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L， 定容至1L。 0077 (3)将种子液接种到已灭菌的发酵培养基中进行发酵培养， 接种量为2， 温度设 定为40， 获得浓度为1010cfu/mL的发酵液； 液体发酵培养基配方为LB培养基， 即酵母粉5g/ L， 蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L， 定容至1L； 然后将得到的发酵液直接分装成液体剂型。 0078 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限制本发明， 凡在本发明实质 内容上所作的任何修改、 等同替换和简单改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 8 CN 106676036 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 106676036 A 9 。