一种长链脂肪酸酯的制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210559238.9 (22)申请日 2012.12.20 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103882069 A (43)申请公布日 2014.06.25 (73)专利权人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路457号 (72)发明人 赵宗保靳国杰 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 马驰 (51)Int.Cl. C12P 7/64(2006.01) 审查员 吴永庆 (54)发明名称 。

2、一种长链脂肪酸酯的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种长链脂肪酸酯的制备方 法， 属于生物工程下游技术领域。 在有水存在的 环境下， 以产油微生物的菌体和短链醇为原料， 经过菌体自催化转化， 生成长链脂肪酸酯。 本发 明可直接以产油微生物发酵醪液和含有短链醇 的发酵醪液为原料， 转化过程对水分耐受能力 强， 不需要添加额外的催化剂， 操作条件温和， 不 需要对菌株进行复杂的基因工程改造， 过程简 单， 易放大， 对设备要求低， 能耗低， 成本低， 不污 染环境。 本发明为长链脂肪酸酯规模化生产提供 经济可行的新技术。 权利要求书1页 说明书7页 CN 103882069 B 2017.06。

3、.16 CN 103882069 B 1.一种长链脂肪酸酯的制备方法， 其特征在于： 在水溶液中、 产油微生物菌体将短链醇 转化反应得到长链脂肪酸酯； 所述短链醇为甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇、 戊醇中的一种或两种以上的必要组合； 所述产油微生物菌体为油脂含量超过其干重20的真核微生物菌体， 所述产油微生物 为红冬孢酵母Rhodosporidium sp.、 红酵母Rhodotorula sp.、 油脂酵母Lipomyces sp.或 小球藻Chlorella protothecoides中的一种或两种以上； 所述产油微生物菌体的状态为干菌体、 湿菌体、 发酵醪液中的一种或两种以上的必要 组合。

4、； 所述水溶液体系的pH值为210； 所述水溶液体系中短链醇的体积百分浓度为140。 2.按照权利要求1所述的制备方法， 其特征还在于： 所述水溶液体系中水的质量百分浓 度为5899。 3.按照权利要求1所述的制备方法， 其特征还在于： 反应温度为2060， 反应时间 为5分钟168小时。 4.按照权利要求1所述的制备方法， 其特征还在于： 所得到的长链脂肪酸酯用极性较低 的液态有机物进行提取纯化。 5.按照权利要求4所述的制备方法， 其特征还在于： 所述极性较低的液态有机物选自石 油醚、 正己烷、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 氯仿、 六号抽提溶剂油、 四号溶剂、 工业己烷中的一种或 者它们的必要。

5、组合。 6.按照权利要求1所述的制备方法， 其特征还在于： 所述得到的长链脂肪酸酯可用于制 备长链脂肪醇、 航空燃料和其他化学品。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103882069 B 2 一种长链脂肪酸酯的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种长链脂肪酸酯的制备方法， 具体的讲， 是在有水存在的环境下， 以 产油微生物的菌体和短链醇为原料， 经过菌体自催化转化， 生成长链脂肪酸酯， 属于生物工 程下游技术领域。 背景技术 0002 由动、 植物油脂或长链脂肪酸和短链醇 （如甲醇和乙醇） 反应， 得到长链脂肪酸酯， 当前常被称之为生物柴油。 生物柴油能量密度高、 润滑性能好、 储运安。

6、全、 抗爆性好、 燃烧充 分、 可再生、 环境友好， 可直接应用于柴油发动机系统， 是理想的生物燃料品种之一。 植物油 脂资源非常有限， 并且其生产易受场地、 季节和气候变化的影响， 而扩大油料作物种植可能 存在与人争粮、 与粮争地等问题。 因此， 原料短缺成为制约生物柴油产业规模的瓶颈之一。 部分微生物可在胞内积累油脂， 并可达到其细胞干重的20%以上， 这类微生物被称为产油微 生物 （Ratledge C ,Wynn JP .The biochemistry and molecular biology of lipidaccumulation in oleaginous microorga。

7、nisms .Advances in Applied Microbiology,2002,51,1） 。 真菌、 细菌以及微藻中的一些种属具有过量积累油脂的能力， 符合产油微生物的特征。 产油微生物合成的油脂， 称为微生物油脂， 通常具有和动、 植物油 脂相近的脂肪酸组成。 与动、 植物油脂技术相比， 微生物油脂技术具有生产周期短、 可连续 生产、 生产潜力大等优势。 由于产油微生物可将来源于生物质资源的碳水化合物等有机物 转化为油脂， 所以微生物油脂原料资源丰富而廉价。 因此， 微生物油脂是解决生物柴油产业 原料问题最有效、 可持续的途径之一 （赵宗保.中国生物工程杂志,2005,25,8）。

8、 。 0003 基于微生物油脂技术生产长链脂肪酸酯， 可分为两个基本过程， 即微生物油脂的 生产和长链脂肪酸酯的生产。 前一个过程通常包括产油微生物培养和微生物油脂提取分 离， 后一个过程是通过催化剂催化或者在超 （亚） 临界流体中完成。 催化油脂转化制备长链 脂肪酸酯的催化剂有酸、 碱、 脂肪酶和离子液体等。 酸催化剂包括游离酸、 固体酸等， 碱催化 剂包括无机碱、 固体碱等， 脂肪酶催化剂包括游离酶、 固定化酶和固定化细胞， 离子液体催 化剂包括游离离子液体和固定化离子液体。 上述催化转酯化或酯化反应若要获得60%以上 的高效率， 需要在水分含量低于30% （w/w） 的条件下进行 （At。

9、adashiIM,Aroua MK,AzizARA, Sulaiman NMN.Renewable and Sustainable Energy Reviews,2012,16,3456） 。 制备长链 脂肪酸酯除了使用催化剂催化外， 还可以在超 （亚） 临界甲醇、 水等流体中进行。 此过程不需 要添加催化剂， 对水分的耐受性较高。 例如， 在350 C， 43MPa下， 超临界甲醇-水体系的水含 量超过30% （w/w） 时， 脂肪酸甲酯的得率仍可达90%以上 （Kusdiana D,Saka S.Bioresource Technology,2004,91,289） 。 产油微生物培养得到。

10、的发酵醪液， 水分含量通常在80%以上， 所 以催化反应前要进行脱水处理。 研究表明， 水分脱除所消耗的能量占长链脂肪酸酯生产总 能耗的80%以上 （Teixeira RE.Green Chemistry,2012,14,419） 。 在超 （亚） 临界流体中生产 长链脂肪酸酯， 虽然允许较高的水分含量， 但需要在高温高压下进行， 对设备要求高， 能耗 大， 成本高， 并且发酵醪液及菌体中的其他成份也可能发生其他副反应。 因此， 需要建立与 说明书 1/7 页 3 CN 103882069 B 3 微生物油脂技术匹配的制备长链脂肪酸酯的新方法， 直接在温和条件下转化利用高水分含 量的原料， 以。

11、显著改善过程的技术经济性。 0004 近几年研究人员开始尝试在常温常压条件下， 利用微生物在高水分环境中直接合 成长链脂肪酸酯， 此种方法通常需要对微生物进行基因工程改造。 例如， 在酿酒酵母中异源 表达蜡酯合成酶/脂酰CoA:甘油二酯酰基转移酶基因 （atfA） 并在发酵过程中补加脂肪酸， 可以得到长链脂肪酸乙酯 （Kalscheuer R,LuftmannH,Steinbuchel A.Applied and Environmental Microbiology,2004,70,7119） 。 在大肠杆菌中表达atfA基因及编码丙酮酸 脱羧酶和乙醇脱氢酶的基因， 通过补加脂肪酸， 大肠杆菌。

12、中长链脂肪酸乙酯含量达到细胞 干重的25 .4% （Elbahloul Y .Steinbuechel A .Applied and Environmental Microbiology,2010,76,4560） 。 在大肠杆菌中表达atfA基因和乙醇合成酶基因的基础上， 通过改造脂肪酸代谢通路， 可以实现由单糖到长链脂肪酸乙酯的生产 （Steen EJ,Kang,YS, Keasling JD,et al.Nature,2010,463,559） ， 此后通过引入动态传感器调控系统， 长链脂 肪酸乙酯产量达到1 .5g/L （Zhang FZ ,Carothers JM ,Keasling。

13、 JD .Nature Biotechnology,2012,30,354） 。 利用微生物直接合成长链脂肪酸乙酯， 可在常温常压下进 行， 但菌株需要基因工程改造， 过程调控复杂。 对于其他短链醇 （如甲醇、 丙醇等） 的长链脂 肪酸酯， 由于受到微生物代谢途径的限制， 目前尚未构建得到有效的基因工程菌株。 发明内容 0005 本发明提供了一种在有水存在的环境下， 以产油微生物的菌体和短链醇为原料， 经过菌体自催化转化， 生成长链脂肪酸酯的方法。 本发明可直接以产油微生物发酵醪液和 含有短链醇的发酵醪液为原料， 转化过程对水分耐受能力强， 不需要添加额外的催化剂， 操 作条件温和， 不需要对。

14、菌株进行复杂的基因工程改造， 过程简单， 易放大， 对设备要求低， 能 耗低， 成本低， 不污染环境。 0006 本发明通过下述技术方案予以实现： 0007 1)按下述方法的一种或它们的必要组合， 制备反应体系： 0008 A） 向含有产油微生物菌体的发酵醪液中添加短链醇， 至短链醇的体积百分浓度达 到0.1%90%； 或 0009 B） 将水、 产油微生物的菌体和短链醇混合， 至短链醇的体积百分浓度达到0.1% 90%， 水的质量百分浓度为10%99%； 或 0010 C） 将含有产油微生物菌体的发酵醪液和含有短链醇的发酵液按一定比例混合， 至 短链醇的体积百分浓度达到0.1%15%； 或 。

15、0011 D） 将水、 产油微生物的菌体和含有短链醇的发酵液按一定比例混合， 至短链醇的 体积百分浓度达到0.1%15%。 0012 2)将步骤1） 制备的反应体系的酸碱度调整至pH210， 在温度20 C60 C下， 处理 5分钟168小时； 0013 3)向步骤2） 所得的体系中加入有机溶剂进行萃取， 除去有机溶剂得到长链脂肪酸 酯。 0014 本发明所述的含有产油微生物菌体的发酵醪液， 为产油微生物液体悬浮培养后得 到的含有菌体的悬浊液； 产油微生物的菌体， 为从产油微生物培养体系中分离出来的湿菌 说明书 2/7 页 4 CN 103882069 B 4 体或经脱水干燥处理的干菌体。 0。

16、015 本发明所述的短链醇为甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇、 戊醇中的一种或两种以上的必要 组合。 0016 本发明所述调整反应体系酸碱度的试剂为常规的酸如盐酸、 硫酸、 磷酸、 醋酸等， 或常规的碱如氢氧化钠、 氢氧化钾、 氢氧化钙、 碳酸钠、 碳酸钾、 氨水等。 0017 本发明所述的有机溶剂为极性较低的液态有机物， 如石油醚、 正己烷、 乙酸乙酯、 二氯甲烷、 氯仿、 六号抽提溶剂油、 四号溶剂、 工业己烷等或者它们的必要组合。 0018 本发明从有机溶剂相中除去有机溶剂得到长链脂肪酸酯的方法为常压蒸馏或真 空蒸发等。 0019 为了提高本发明步骤3） 的技术效果， 在实施溶剂提取前或提取。

17、过程中， 还可辅以 加热、 微波辐射、 超声处理、 酶处理、 酸处理、 高压均质处理、 球磨处理、 玻璃珠破碎、 反复冻 融等理化处理， 以破坏产油微生物细胞， 提高长链脂肪酸酯回收率。 0020 本发明所述的产油微生物菌体为油脂含量超过其干重20%的真核微生物菌体或原 核微生物菌体。 用于制备产油微生物菌体的产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量超过 细胞干重20% （w/w） 的真核微生物和原核微生物中的一种或两种以上的必要组合， 它们包括 但不限于， 产油真菌， 如红冬孢酵母 （Rhodosporidium sp. ） 、 隐球酵母 （Cryptococcus sp. ） 、 红酵母 （R。

18、hodotorula sp. ） 、 油脂酵母 （Lipomyces sp. ） 、 丝孢酵母 （Trichosporon sp. ） 、 亚罗解脂酵母 （Yarrowialipolytica） 、 健强地霉 （Geotrichum robustum） 、 深黄被孢 霉 （Mortierella isabellina） 、 卷枝毛霉 （Mucor circinelloides） 、 小克银汉霉 （Cunninghamella） 和伯顿拟内孢霉 （Endomycopsis burtonii） ； 产油微藻， 如布朗葡萄藻 （Botryococcus braunii）、 隐甲藻（Cryptheco。

19、dinium cohnii）、 小球藻 （Chlorellaprotothecoides） 、 微绿球藻 （Nannochloropsis sp .） 和裂殖壶菌 （Schizochytrium limacinum） ； 产油细菌， 如棒状杆菌 （Corynebacterium） 、 诺卡氏菌 （Nocarda） 、 分枝杆菌 （Mycobacterium） 等。 0021 本发明使用菌体材料的实际 油脂含量测定参照文献 （Li YH ,Zhao ZB , BaiFW.Enzyme Microbial Technology,2007,41,312） 的方法。 长链脂肪酸酯的鉴定和含量 检测参照。

20、文献 （Gu HQ,Jiang YJ,Zhou LY,Gao J.Energy&EnvironmentalScience,2011,4, 1337） 的方法进行。 具体实施方式 0022 以下实施例选取了利用一些典型产油微生物菌体和短链醇为原料转化制备长链 脂肪酸酯的过程， 有助于了解本专利， 但不以任何形式限制本发明的应用。 0023 实施例1 0024 按照文献 （李永红,刘波,赵宗保,白凤武.生物工程学报,2006,22,650） 所述的方 法， 批式发酵培养产油酵母R.toruloids AS2.1389 （菌株来源于中国普通微生物菌种保藏 管理中心） ， 得到发酵密度为18.3g干菌。

21、体 （CDW） /L的发酵醪液， 油脂量为13.9g/L， 菌体油脂 含量75.9%。 取上述发酵醪液6mL， 加入乙醇， 使乙醇的终体积百分浓度为10%， 混匀， 用5M氢 氧化钠溶液调pH至4， 体系中水的质量百分浓度为88%， 反应液在30 C下搅拌48h， 然后加入 等体积的玻璃珠， 剧烈震荡30分钟， 加入10mL氯仿在25 C下充分混合， 浸提1h， 离心分离取 说明书 3/7 页 5 CN 103882069 B 5 出有机相， 蒸发溶剂得长链脂肪酸乙酯， 得率为90%。 产物中95%以上是碳链长度为18和20的 长链脂肪酸乙酯， 可用作生物柴油。 0025 实施例2 0026 。

22、其他操作条件同实施例1， 但反应前需要将发酵醪液离心得到湿菌体。 在湿菌体中 加入乙醇和水， 使乙醇的终体积百分浓度为10%， 水的质量百分浓度为88%， 长链脂肪酸乙酯 的得率为91%。 0027 实施例3 0028 其他操作条件同实施例1， 但反应前需要将发酵醪液离心并将菌体冻干。 在干菌体 中加入乙醇和水， 使乙醇的终体积百分浓度为10%， 水的质量百分浓度为88%， 长链脂肪酸乙 酯的得率为85%。 0029 实施例4 0030 其他操作条件同实施例1， 但乙醇的终体积百分浓度为1%， 体系中水的质量百分浓 度为97%， 长链脂肪酸乙酯的得率为76%。 0031 实施例5 0032 其。

23、他操作条件同实施例1， 但乙醇的终体积百分浓度为40%， 体系中水的质量百分 浓度为58%， 长链脂肪酸乙酯的得率为98%。 0033 实施例6 0034 其他操作条件同实施例1， 但用5M氢氧化钠将反应体系调为pH10， 长链脂肪酸乙酯 的得率为35%。 0035 实施例7 0036 其他操作条件同实施例1， 但用1M盐酸将反应体系调反应体系pH2， 长链脂肪酸乙 酯的得率为55%。 0037 实施例8 0038 其他操作条件同实施例1， 但反应温度为60 C， 长链脂肪酸乙酯的得率为83%。 0039 实施例9 0040 其他操作条件同实施例1， 但反应温度为25 C， 长链脂肪酸乙酯的得。

24、率为80%。 0041 实施例10 0042 其他操作条件同实施例1， 但反应时间为6h， 长链脂肪酸乙酯的得率为60%。 0043 实施例11 0044 其他操作条件同实施例1， 但反应时间为168h， 长链脂肪酸乙酯的得率为96%。 0045 实施例12 0046 其他操作条件同实施例1， 但所用短链醇为甲醇， 长链脂肪酸甲酯的得率为94%。 0047 实施例13 0048 其他操作条件同实施例1， 但所用短链醇为异丙醇， 长链脂肪酸异丙酯的得率为 88%。 0049 实施例14 0050 其他操作条件同实施例1， 但所用短链醇为正丁醇， 长链脂肪酸正丁酯的得率为 80%。 0051 实施。

25、例15 说明书 4/7 页 6 CN 103882069 B 6 0052 其他操作条件同实施例1， 但所用短链醇为甲醇和乙醇的混合物， 甲醇和乙醇的终 体积百分浓度为5%和5%， 体系中水的质量百分浓度为89%， 长链脂肪酸甲酯和长链脂肪酸乙 酯的总得率为86%。 0053 实施例16 0054 其他操作条件同实施例1， 但所用短链醇为含有乙醇的发酵醪液， 其制备方法参考 文献（Yuan WJ ,Chang BL ,Ren JG ， Liu JP ， Bai FW ， Li YY .Journal of AppliedMicrobiology,2012,112,38） ， 乙醇的终体积百分浓。

26、度为9%， 体系中水的质量百分 浓度为89%， 长链脂肪酸乙酯的得率为85%。 0055 实施例17 0056 其他操作条件同实施例1， 但所用短链醇为含有正丁醇的发酵醪液， 其制备方法参 考文献 （Shen CR ,Lan EI ,DekishimaY， Baez A ,Cho KM ,Liao JC .Applied andEnvironmental Microbiology,2011,77,2905） ， 正丁醇的终体积百分浓度为2.5%， 体系 中水的质量百分浓度为96%， 长链脂肪酸正丁酯的得率为67%。 0057 实施例18 0058 其他操作条件同实施例1， 但所用短链醇为同时含。

27、有正丁醇和乙醇的发酵醪液， 其 制备方法参考文献 （Xue C,Zhao JB,Lu CC,Yang ST,Bai FW,Tang IC.Biotechnology and Bioengineering,2012,109,2746） ， 正丁醇和乙醇的终体积百分浓度分别为8%和0.7%， 体系 中水的质量百分浓度为89%， 长链脂肪酸正丁酯和长链脂肪酸乙酯的总得率为83%。 0059 实施例19 0060 其他操作条件同实施例1， 但反应液在30 C下搅拌48h后， 不进行细胞破碎， 直接加 入20mL氯仿在25 C下充分混合， 浸提1h， 离心分离取出有机相， 蒸发溶剂得长链脂肪酸乙 酯， 。

28、得率为71%。 0061 实施例20 0062 其他操作条件同实施例1， 但反应液在30 C下搅拌48h后， 加入浓盐酸至盐酸终浓 度为4M， 80 C水浴1h， 冷却至25 C， 加入10mL二氯甲烷在25 C下充分混合， 浸提1h， 离心分离 取出有机相， 蒸发溶剂得长链脂肪酸乙酯， 得率为89%。 0063 实施例21 0064 其他操作条件同实施例1， 但反应液在30 C下搅拌48h后， 在大气压下微波 （800W） 处理1分钟， 冷却至25 C， 加入 -1,3-甘露聚糖酶至终浓度为0.4g/L， 在pH4.5、 25 C下处理 1h， 加入20mL乙酸乙酯， 在25 C下充分混合，。

29、 浸提1h， 离心分离取出有机相， 蒸发溶剂得长链 脂肪酸乙酯， 得率为84%。 0065 实施例22 0066 其他操作条件同实施例1， 但反应液在30 C下搅拌48h后， 在121 C下处理1h， 冷却 至25 C， 加入20mL石油醚在25 C下充分混合， 浸提1h， 离心分离取出有机相， 蒸发溶剂得长 链脂肪酸乙酯， 得率为81%。 0067 实施例23 0068 按照文献 （沈宏伟,靳国杰,胡翠敏,龚志伟,白凤武,赵宗保.生物工程学报,2012, 28,56） 所述的方法， 连续发酵培养产油酵母R.toruloides AS2.1389 （菌株来源于中国普通 微生物菌种保藏管理中心）。

30、 ， 得到发酵密度为1.8g干菌体 （CDW） /L的发酵醪液， 油脂量为 说明书 5/7 页 7 CN 103882069 B 7 0.6g/L。 取上述发酵醪液6mL， 加入乙醇， 使乙醇的终体积百分浓度为10%， 混匀， 用5M氢氧化 钠溶液调pH至4， 体系中水的质量百分浓度为90%， 反应液在20 C下搅拌168h， 然后加入等体 积的玻璃珠， 剧烈震荡30分钟， 加入10mL氯仿在25 C下充分混合， 浸提1h， 离心分离取出有 机相， 蒸发溶剂得长链脂肪酸乙酯， 得率为95%。 0069 实施例24 0070 按照文献 （Lin JT,Shen HW， Tan HD,Zhao X。

31、,Wu SG， Hu CM,Zhao ZB.Journal ofBiotechnology,2011,152,184） 所述的方法， 两阶段发酵培养产油酵母L.stakeyiAS 2.1560 （菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心） ， 得到发酵密度为104.6g干菌体 （CDW） /L的发酵醪液， 油脂量为67.9g/L。 取上述发酵醪液100mL， 加入乙醇， 使乙醇的终体积 百分浓度为10%， 混匀， 用5M氢氧化钠溶液调pH至4， 体系中水的质量百分浓度为80%， 反应液 在35 C下搅拌96h； 加入100mL氯仿， 用5M盐酸调pH至2.5， 在55 C下浸提1h， 离心分离。

32、取出有 机相， 蒸发溶剂得长链脂肪酸乙酯， 得率为90%。 0071 实施例25 0072 按照文献 （Xiong W， Gao CF,Yan D,Wu C,Wu Q Y.Bioresource Technology, 2010,101,2287） 所述的方法， 光自养培养产油微藻C.protothecoides CS-41 （菌株来源于 澳大利亚CSIRO微藻研究中心） ， 得到发酵密度为0.6g干菌体 （CDW） /L的发酵醪液， 油脂量为 0.2g/L。 取上述发酵醪液6mL， 加入乙醇， 使乙醇的终体积百分浓度为10%， 混匀， 用5M氢氧化 钠溶液调pH至4， 体系中水的质量百分浓度。

33、为90%， 反应液在30 C下搅拌96h， 然后加入等体 积的玻璃珠， 剧烈震荡30分钟， 加入10mL氯仿在25 C下充分混合， 浸提1h， 离心分离取出有 机相， 蒸发溶剂得长链脂肪酸乙酯， 得率为94%。 0073 实施例26 0074 按照文献 （Xiong W， Gao CF,Yan D,Wu C,Wu Q Y.Bioresource Technology, 2010 ,101 ,2287）所述的方法 ， 先光自养后异养的混合营养方式培养产油微藻 C.protothecoides CS-41 （菌株来源于澳大利亚CSIRO微藻研究中心） ， 得到发酵密度为32g 干菌体 （CDW） 。

34、/L的发酵醪液， 油脂量为14g/L。 取上述发酵醪液6mL， 加入乙醇， 使乙醇的终体 积百分浓度为10%， 混匀， 用5M氢氧化钠溶液调pH至6， 体系中水的质量百分浓度为87%， 反应 液在45 C下搅拌48h， 然后加入等体积的玻璃珠， 剧烈震荡30分钟， 加入10mL氯仿在25 C下 充分混合， 浸提1h， 离心分离取出有机相， 蒸发溶剂得长链脂肪酸乙酯， 得率为92%。 0075 实施例27 0076 按照文献 （Xue FY， Miao JX ,Zhang X ,Tan TW .Applied Biochemistry andBiotechnology,2010,160,498）。

35、 所述的方法， 混合培养产油酵母R.glutinis AS2.703 （菌株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心） 和产油微藻C.protothecoides CS-41 （菌 株来源于澳大利亚CSIRO微藻研究中心） ， 得到发酵密度为3.7g干菌体 （CDW） /L的发酵醪液， 油脂量为0.5g/L。 取上述发酵醪液6mL， 加入乙醇， 使乙醇的终体积百分浓度为10%， 混匀， 用 5M氢氧化钠溶液调pH至4， 体系中水的质量百分浓度为90%， 反应液在30 C下搅拌48h， 然后 加入等体积的玻璃珠， 剧烈震荡30分钟， 加入10mL氯仿在25 C下充分混合， 浸提1h， 离心分 离取出。

36、有机相， 蒸发溶剂得长链脂肪酸乙酯， 得率为95%。 0077 实施例28 0078 取实施例24所得到的长链脂肪酸乙酯样品0.5克， 按照文献 （Peng BX,Yao Y,Zhao 说明书 6/7 页 8 CN 103882069 B 8 C,Lercher JA.Angewandte Chemie International Edition2012,51,2072） 所述的方法， 以10wt%Ni/HBeta为催化剂， 在氢气压力为40巴， 温度260 C下反应， 得到液体产品， 其中碳 原子数目14-20的烷烃占95%以上， 可用于制备柴油。 0079 对比实施例1 0080 其他操作。

37、条件同实施例1， 但反应前加入等体积的玻璃珠， 剧烈震荡30分钟， 显微 镜检测发现， R.toruloides细胞的破碎率达到95%以上， 长链脂肪酸乙酯的得率为6%。 比较 对比实施例1与实施例1的实验结果， 表明产油微生物细胞的完整性对制备长链脂肪酸酯至 关重要； 当细胞破碎后， 长链脂肪酸酯的转化率很低， 没有实际应用价值。 因此， 按本发明制 备长链脂肪酸酯时， 需要保持细胞的完整性。 对比实施例1还说明， 本发明与其他采用脂肪 酶、 固定化脂肪酶或仅表达脂肪酶的全细胞催化体系相比， 具有明显的技术优势。 0081 本发明的有益效果是： 0082 与利用催化剂催化生产长链脂肪酸酯的方。

38、法相比， 本发明可直接以产油微生物的 发酵醪液和含有短链醇的发酵醪液为原料， 转化过程对水分耐受能力强， 不需要添加额外 的催化剂， 不污染环境； 0083 与利用超 （亚） 临界流体生产长链脂肪酸酯的方法相比， 本发明操作条件温和， 对 设备要求低， 能耗低， 成本低， 过程简单， 易放大； 0084 与利用微生物直接生产长链脂肪酸酯的方法相比， 本发明不需要对菌株进行复杂 的基因工程改造， 过程调控简单， 并且产物浓度高； 0085 总之， 本发明技术简单有效， 能耗低， 设备投资少， 成本低， 提高了长链脂肪酸酯的 技术经济性， 有利于大规模工业化生产。 说明书 7/7 页 9 CN 103882069 B 9 。