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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611238086.7 (22)申请日 2016.12.28 (71)申请人 怀化学院 地址 418000 湖南省怀化市鹤城区怀东路 180号 (72)发明人 李洪波夏玉先蒋鹰 (51)Int.Cl. C12N 15/12(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C07K 14/435(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (54)发明名称 一种蜘蛛神经毒素TX4。
2、(6-1)重组蛋白的制 备方法 (57)摘要 本发明公开了一种蜘蛛神经毒素TX4(6-1) 重组蛋白的制备方法， 主要包括以下步骤：（1） 根 据TX4(6-1)成熟毒素的氨基酸序列和毕赤酵母 表达系统的特点优化并合成C-端带有6His标 签的TX4(6-1)的基因并构建毕赤酵母分泌表达 载体；（2） 转化重组载体到毕赤酵母宿主中， 通过 筛选， 得到了高水平分泌表达的酵母转化子；（3） 酵母宿主中表达重组蜘蛛昆虫神毒素TX4(6-1) 蛋白， 经镍亲合层析法， 快速得到了纯度达95%以 上的重组蜘蛛昆虫神毒素TX4(6-1)蛋白， 该蛋白 对家蚕具有显著毒性。 本发明能快速获得大量稳 定的重。
3、组蜘蛛昆虫神毒素TX4(6-1)蛋白， 对于抗 虫领域， 特别是培育抗虫植物品种有重要的价 值， 对提高农作物的产量具有重要的意义。 权利要求书2页 说明书8页 序列表2页 附图3页 CN 106754943 A 2017.05.31 CN 106754943 A 1.一种经过优化和筛选的蜘蛛TX4(6-1)基因， 是由序列表中序列1所示编码具有毒杀 昆虫活性的DNA分子。 2.根据权利要求1所述的DNA分子编码得到的一种由序列表中序列2所示蛋白质分子。 3.含有权利要求1所述基因的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌； 所述重组载体具体为将权利要求1所述的基因插入表达载体中， 得到表达。
4、权利要求 2 所述蛋白的重组载体， 所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZ A的Xho 和Xba 酶切位点间， 得到表达上述蛋白的重组载体。 4.一种利用权利要求1所述的基因制备蛋白的方法， 包括以下步骤： S1： 将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZ 分别用Xho 和Xba 双酶切并纯化回收， 然后利用连接酶在16 C连接， 得重组载体pPICZ A-TX4(6-1)； S2： 将所述重组载体pPICZ A-TX4(6-1)用BamH 和Bgl将酵母完整表达框切下， 切下 的表达框连接到经Bgl酶切的pPICZ A-TX4(6-1)载体， 得到含两个TX4(6-1)表达。
5、框的pPICZ A载体， 用BamH 和Bgl将含两个TX4(6-1)表达框的片段切下， 再连接到含两个TX4(6-1) 表达框的pPICZ A载体中， 得含4个TX4(6-1)表达框的pPICZ A载体， 电击转化法转化到毕赤 酵母宿主菌中， 再经过400 g/mL Zeocin的YPD平板筛选得到阳性克隆； S3： 将所述阳性克隆转接至含有1500 g/mL Zeocin的YPD平板， 筛选得到高Zeocin抗 性的转化子， 将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD600为1015， 离心收集细胞沉淀， 用BMMY培养基重悬细胞， 加入甲醇并使其质量分数为1%2%， 诱导48小时， 得。
6、发酵的上清液； 以6His兔单抗为一抗， 以HRP标记的山亲抗兔IgG为二抗， 间接ELISA法检测目标蛋白表达 水平， 筛选出高水平表达的酵母转化子； 高水平分泌表达的酵母转化子用BMGY培养基培养 至OD600为1015， 离心收集细胞沉淀， 用BMMY培养基重悬细胞， 加入甲醇并使其质量分数为1 2%， 诱导48小时， 收集发酵的上清液。 5.根据权利要求4所述的制备蛋白的方法， 其特征在于： 在步骤S3的诱导后且收集发酵 的上清液之前， 为提高目标蛋白的表达水平， 甲醇的添加还包括如下步骤： S4： 经扩大培养， 在28 C继续诱导培养48小时， 每24小时补加甲醇使其质量分数保持在 。
7、12%。 6.根据权利要求4或5所述的制备蛋白的方法， 其特征在于： 在步骤S4之后， 还包括如下 步骤： S5： 将所述上清液利用Tris碱调节pH至7.58.0， 以大于或等于15000 g的转速离心10 20分钟， 将获得的上清液加入到经pH 8 Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中， 用10倍 层析柱体积的pH 8 的含10 mM Tris-HCl和3050 mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析 柱； S6： 用含10 mM Tris-HCl和100400 mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱， 将得到 的洗脱液利用分子量为3 kDa的透析袋于10 mM Tris-Cl缓冲液中透。
8、析， 然后超滤浓缩。 7.根据权利要求6所述的制备蛋白的方法， 其特征在于： 在步骤S6之后， 还包括如下步 骤： S7： 将所述超滤浓缩得到的产品在-80 C下速冻， 然后冷冻干燥。 8.根据权利要求4-7任一项所述的制备蛋白的方法制备得到的蛋白。 9.权利要求2、 3或8所述蛋白、 权利要求1所述基因或权利要求4所述重组载体或重组菌 权利要求书 1/2 页 2 CN 106754943 A 2 在抗虫领域中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 106754943 A 3 一种蜘蛛神经毒素TX4(6-1)重组蛋白的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体涉及一种蜘蛛。
9、昆虫神经毒素TX4(6-1)重组基因及 其蛋白的制备方法与应用。 背景技术 0002 昆虫神经毒素是一类只作用于昆虫神经系统， 有毒杀作用的多肽类神经毒素， 主 要来自蜘蛛子、 蜘蛛、 螨虫、 胡蜂、 蚂蚁等动物毒腺分泌的毒液。 到目前为止， 已分离纯化和 命名的昆虫神经毒素有近百种， 主要来自于蜘蛛子， 其次来自蜘蛛。 蜘蛛神经毒素基因TX4 (6-1)是一种源自巴西流浪蜘蛛” (Phoneutria nigriventer)的昆虫专一性神经毒素， 对农 业害虫具有很可的毒杀活性。 昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值， 但天然昆 虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难的， 并且往往只能。
10、得到非常少量的纯品， 这就给 我们进一步研究这些毒素的特性带来了很大的困难。 因此， 通过分离少量昆虫毒素， 测定其 氨基酸组成， 再得到其成熟基因全长， 通过体外大量表达， 成为研究这些毒素的一条重要途 径。 目前， 人们已经开发了很多表达系统如： 杆状病毒表达系统、 原核表达系统、 酵母表达系 统、 丝状真菌表达系统、 昆虫细胞表达系统、 植物表达系统、 哺乳动物表达系统等， 为大量制 备该类神经毒素提供了有效手段。 大肠杆菌的遗传背景清楚， 又由于其具有周期短、 高效率、 易操作、 使用安全等特点， 成 为外源基因的首选表达系统。 不少研究者将昆虫神经毒素构建大肠杆菌表达载体， 经转化 。
11、E. coli在BL21(DE3)进行表达， 但得到的都是无活性的包涵体， 通过体外合适的条件下溶 解、 变性、 复性、 纯化， 从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。 在 大肠杆菌中表达， 可能因为LPS的存在而产生毒性， 因此往往需要对表达纯化产物的毒性进 行分析测定。 最后， 要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理， 纯化的步骤越 多， 蛋白质的得率就会越低， 且更可能导致目标产物的失活。 甲醇酵母表达系统是应用最广 泛的酵母表达系统， 以Pichia pastoris（毕赤巴斯德酵母） 为宿主的外源基因表达系统近 年来发展最为迅速， 应用也最为广泛。 毕赤酵。
12、母系统的广泛应用， 原因在于该系统除了具有 一般酵母所具有的特点外， 还具其它显著优点。 目前， 还没有一种利用真核表达系统可以高 效表达Tx4(6-1)重组蛋白的方法， 极大影响了Tx4(6-1)活性测定、 杀虫谱分析及其在抗农 业害虫中的应用， 因此开发出一种利用毕赤酵母高水平分泌表达大量Tx4(6-1)蛋白并快 速、 低成本的制备具有生物活性的昆虫神毒素Tx4(6-1)蛋白是十分必要的。 发明内容 0003 针对现有技术中的缺陷， 本发明目的在于提供一种蜘蛛神经毒素TX4(6-1)重组基 因及其蛋白制备的方法。 0004 本发明提供基因， 为编码蜘蛛神经毒素TX4(6-1)类蛋白的基因，。
13、 为序列表中序列1 所示的DNA分子。 其中， 序列表中的序列1由165个脱氧核苷酸组成， 该序列为包含6个组氨酸 标签(18个脱氧核苷酸)的TX4(6-1)基因读码框(144个脱氧核苷酸)和终止密码子(3个脱氧 说明书 1/8 页 4 CN 106754943 A 4 核苷酸)， 编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的重组蛋白由TX4(6-1) 的48个氨酸酸残 基和6个组氨酸标签组成。 0005 由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。 含有上述基因 的重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。 所述重组载体具体 为将上述基因插入表达载体中， 得到表。
14、达上述蛋白的重组载体。 所述重组载体具体优选为 将上述基因插入表达载体pPICZ A的Xho 和Xba 酶切位点间， 得到表达上述蛋白的重组载 体。 0006 扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。 上述引物对 中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3， 所述引物对中的另一条引物的核苷酸序 列为序列表中的序列4， 利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶 切和连接操作。 0007 本发明的第二个目的是提供一种制备蛋白的方法， 包括以下步骤： S1： 将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZ 分别用Xho 和Xba 双酶切并纯化回收， 然后利用连接酶在。
15、16 C连接， 得重组载体pPICZ A/TX4(6-1)； S2： 将所述重组载体pPICZ A-TX4(6-1)用BamH 和Bgl将酵母完整表达框切下， 切下 的表达框连接到经Bgl酶切的pPICZ A-TX4(6-1)载体， 得到含两个TX4(6-1)表达框的 pPICZ A载体， 用BamH 和Bgl将含两个TX4(6-1)表达框的片段切下， 再连接到含两个TX4 (6-1)表达框的pPICZ A载体中， 得含4个TX4(6-1)表达框的pPICZ A载体， 电击转化法转化 到毕赤酵母宿主菌中， 再经过Zeocin筛选得到阳性克隆； S3： 将所述阳性克隆转接至含有1500 g/mL。
16、 Zeocin的YPD平板， 筛选得到高Zeocin抗 性的转化子， 将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD600为1015， 离心收集细胞沉淀， 用BMMY培养基重悬细胞， 加入甲醇并使其质量分数为12%， 诱导48小时， 得发酵的上清液。 以6His兔单抗为一抗， 以HRP标记的山亲抗兔IgG为二抗， 间接ELISA法检测目标蛋白表达 水平， 筛选出高水平表达的酵母转化子。 高水平分泌表达的酵母转化子用BMGY培养基扩大 培养， 离心收集细胞沉淀， 用BMMY培养基重悬细胞， 加入甲醇并使其质量分数为12%， 诱导 48小时， 收集发酵的上清液； 优选地， 在步骤S3的扩大培养时， 。
17、在诱之后且收集上清液之前， 还包括进一步诱导表达 的如下步骤： S4： 在28 C继续诱导培养48小时， 每24小时补加甲醇使其质量分数保持在12%； 优选地， 在步骤S3之后， 还包括纯化蛋白的如下步骤： S5： 将所述上清液利用Tris碱调节pH至7.58.0， 以大于或等于15000 g的转速离心10 20分钟， 将获得的上清液加入到经pH 8 Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中， 用10倍 层析柱体积的pH 8 的含10 mM Tris-HCl和3050 mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析 柱； S6： 用含10 mM Tris-HCl和100400 mM咪唑的缓冲液洗脱所述。
18、镍亲合层析柱， 将得到 的洗脱液利用分子量为3 kDa的透析袋于10 mM Tris-HCl缓冲液中透析， 然后超滤浓缩； 优选地， 在步骤S5之后， 还包括保存蛋白的如下步骤： S7： 将所述超滤浓缩得到的产品在-80 C下速冻， 然后冷冻干燥。 0008 根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。 通过 说明书 2/8 页 5 CN 106754943 A 5 步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达蜘蛛昆虫神经毒素TX4(6-1)的酵母转化子也 属于本发明保护的范围。 上述蛋白、 上述基因或上述重组载体、 表达盒、 转基因细胞系或重 组菌在抗虫领域中的应用也是本发。
19、明保护的范围。 0009 本发明提供的技术方案具有以下优点： 一是根据本技术方案所述的表达方法分泌 表达和纯化得到的具有生物活性的重组蜘蛛昆虫神经毒素TX4(6-1)能够有效防止宿主菌 对表达产物的降解， 减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用； 二是利用酵 母载体pPICZ A-TX4(6-1)上的分泌信号 -因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达， 目的 蛋白会大量分泌到培养液中， 且能形成准确的空间结构， 从而保持蜘蛛昆虫神经毒素TX4 (6-1)的天然活性； 三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得蜘蛛昆虫神经毒素TX4 (6-1)的酵母转化子； 四是摸索出用真核宿主毕赤酵母。
20、来表达昆虫神毒素TX4(6-1)的方法 和快速高效纯化蜘蛛昆虫神经毒素TX4(6-1)的方法， 可以降低成本且实现大量生产； 五是 纯化的带组氨酸标签的重组蛋白对家蚕5龄幼虫具有很强的毒杀活性。 0010 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出， 部分将从下面的描述中变 得明显， 或通过本发明的实践了解到。 附图说明 0011 图1为本发明实施例中的真核表达载体pPICZ A- TX4(6-1)构建示意图； 图2 为本发明实施例中对酵母转化子的PCR验证结果图； 图3为本发明实施例中的高水平分泌表达酵母转化子在甲醇诱导下不同时间点目标蛋 白表达情况的SDS-PAGE检测结果图； 图4为。
21、本发明实施例中不同浓度的咪唑洗脱纯化得到的TX4(6-1) 蛋白的SDS-PAGE检 测结果图； 图5为本发明实施例中纯化得到的TX4(6-1) 蛋白浓缩前后的SDS-PAGE检测结果图； 图6为本发明实施例中的重组TX4(6-1)蛋白生物学活性结果示意图。 具体实施方式 0012 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于 本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例， 都属于本发明保护的范围。 实施例中所使用的实验方法如无特殊。
22、说明， 均为常规方 法。 实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 实施例中的%， 如无 特殊说明， 均为质量百分含量。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 数据为三 次重复实验的平均值或平均值标准差。 0013 本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pPICZ A均购自美国Invritrogen公 司。 本发明中的引物具体序列如序列表中的序列3和序列4所示。 0014 所用培养基配方如下： 1） 酵母生长培养基 （BMGY） 完全溶解10 g 酵母提取物， 20 g 蛋白胨， 定容到800 mL。 121 蒸气高压灭菌15-20 min， 冷却到室温，。
23、 加入100 mL 1 M磷酸钾溶液， 100 mI YNB， 2 mL 500生物素， 20 mL 50% 说明书 3/8 页 6 CN 106754943 A 6 灭菌甘油； 2） 酵母诱导培养基 （BMMY） 完全溶解10 g 酵母提取物， 20 g蛋白胨， 定容到800 mL。 121 蒸气高压灭菌15-20 min， 冷却到室温， 加入100 mL 1 M磷酸钾溶液， 100 mL YNB， 2 mL500生物素， 10 mL甲醇； 3） YPD培养基 完全溶解10 g 酵母提取物， 20 g蛋白胨， 定容到900 mL， 121 蒸气高压灭菌15-20 min， 冷却至70左右再加。
24、入100 mL20%灭菌葡萄糖溶液。 在其中加入1.5-1.8%的琼脂可制 得YPD固体培养基。 0015 实施例一 本实施例提供了一种优化的人工合成的C-端带有6His标签的TX4(6-1)基因， 具体序 列如序列表中的序列1所示， 该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的序列2所示。 本实施 例的优化前的序列是根据NCBI数据库提供的DNA序列， 是合成TX4(6-1)神经毒素的天然 DNA， 然后根据毒素基因和毕赤酵母密码子表达特点， 优化并合成优化后的DNA。 NCBI数据库 仅能找到Tx4(6-1)的天然蛋白序列(GenBank登录号2108421A)而没有其对应的核酸序列， 因此优化合。
25、成的Tx4(6-1)基因没有同源DNA序列。 0016 将人工合成的C-端带有6His标签的DNA分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体 pPICZ A上， 得到重组载体。 将所得重组载体pPICZ A-TX4(6-1)用BamH 和Bgl将酵母完 整表达框切下， 切下的表达框连接到经Bgl 酶切的pPICZ A-TX4(6-1)载体， 得到含两个TX4 (6-1)表达框的pPICZ A载体， 用BamH 和Bgl将含两个TX4(6-1)表达框的片段切下， 再连 接到含两个TX4(6-1)表达框的pPICZ A载体中， 得含4个TX4(6-1)表达框的pPICZ A载体， 电 击转化法转化到毕赤酵母。
26、宿主菌中。 转化后分别用含有400 g/mL Zeocin抗生素的YPD平 板进行筛选， 利用PCR对转化子进行验证， 将PCR验证后的毕赤酵母转化子划线接种至含有 1500 g/mL Zeocin抗生素的YPD平板， 筛选得到优化后人工合成的C-端带有6His标签 DNA的高抗性毕赤酵母转化子。 0017 实施例二 本实施例提供一种制备蛋白的方法， 具体包括如下步骤： S1： 构建表达载体及转化： 将实施例一的优化后的人工合成的C-端带有6His标签的 DNA连接至毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ A， 得到重组载体pPICZ A-TX4(6-1)， 载体构建 如图1所示， 图1为本发明实施。
27、例中的真核表达载体pPICZ A- TX4(6-1)构建示意图。 主要的 载体构建步骤优选如下： （1） 用Xho 和Xba 双酶切含合成的TX4(6-1)基因的质粒， 获得目的片断， 反应体系如下 （所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司） ： 含合成的TX4(6-1)基因的质粒 15 L 10M 缓冲液 5 L Xho 5 U Xba 5 U 无菌水 至50 L （2） 用Xho和Xba双酶切pPICZ A， 获得载体片断， 反应体系如下 （所用内切酶及缓冲液 均购自大连TAKARA公司） ： 说明书 4/8 页 7 CN 106754943 A 7 质粒pPICZ A 15 L 1。
28、0M 缓冲液 5 L Xho 5 U Xba 5 U 无菌水 至50 L （3） 将步骤 （1） 和 （2） 得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收， 该试剂盒 购自大连TAKARA公司， 具体操作按试剂盒说明书进行； （4） 将步骤 （3） 回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶 （购自大连TAKARA公司） 进行 连接反应， 目的基因准确插入到含有分泌信号 -因子的分泌型载体读码框内， 反应体系如 下： 载体pPICZ A片段 1 L 目的片段落 3 L 10缓冲液 1 L T4连接酶 0.5 L 无菌水 至10 L 将上述所得重组载体pPICZ A-TX4(6-1)用Ba。
29、mH 和Bgl将酵母完整表达框切下， 切 下的表达框连接到经Bgl酶切的pPICZ A-TX4(6-1)载体， 得到含两个TX4(6-1)表达框的 pPICZ A载体， 用BamH 和Bgl将含两个TX4(6-1)表达框的片段切下， 再连接到含两个TX4 (6-1)表达框的pPICZ A载体中， 得含4个TX4(6-1)表达框的pPICZ A载体； S2： 重组质粒的转化： 将含4个TX4(6-1)表达框的pPICZ A载体按照Invitrogen公司操 作手册提供的电转化法， 将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中， 本实施例选用的是X-33。 转 化后用含有400 g/mL Zeocin抗生素的。
30、YPD平板进行筛选， 利用PCR对转化子进行验证， 部 分转化子PCR筛选结果如图2所示； S3： 高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达： 将PCR验证后的毕赤酵母转化子 划线接种至含有不同浓度的 Zeocin抗生素的YPD平板， 筛选得到高Zeocin抗性的转化子， 将高抗性的转化子用BMMY小量诱导表达， 在28， 300 rpm培养条件下培养至菌体OD600= 6.0， 取上述菌液， 接种至含500mL BMGY培养基的2000 mL摇瓶中， 每甁接种5 mL， 于28， 250 rpm培养至OD600=12； 室温下2500g离心5 min， 收集菌体， 用1/7原培养体积的BM。
31、MY重悬 菌体， 向培养基中添加100%甲醇至终浓度 （质量分数） 为12%， 诱导24小时， 在28 C继续诱导 培养48小时， 每24小时补加甲醇使其质量分数保持在12%， 收集发酵的上清液。 0018 需要说明的是， 将高Zeocin抗性的转化子用BMMY小量诱导表达， 其分泌表达的上 清液以6His兔单抗为一抗， 以HRP标记的山亲抗兔IgG为二抗， 间接ELISA法检测目标蛋白 表达水平。 从十株高抗性(抗性水平大于或等于1500 g/mL Zeocin)转化子中筛选得到一 株稳定且高水平分泌表达昆虫神毒素TX4(6-1)的酵母转化子， 而从50株抗性水平低于1500 g/mL Ze。
32、ocin YPD平板的转化子没有筛选到高水平分泌表达目标蛋白的转化子， 部分转化 子筛选的ELISA结果如表1所示。 表1为本发明实施例中不同Zeocin抗性的昆虫神经毒素TX4 (6-1)的酵母转化子的ELISA检测结果， 从结果可看出， 高抗生转化子普遍具有更高的目标 蛋白分泌能力， 但仅有一株转化子具有显著更高水平的分泌表达TX4(6-1)， 其在表1中的编 号为A7。 说明书 5/8 页 8 CN 106754943 A 8 0019 表1， 各转化子分泌表达Tx4(6-1)的数值(n=3)。 0020 选取高水平分泌表达的酵母转化子A7单菌落， 接种至装有50 mL YPD液体培养基。
33、 的250 mL三角瓶中， 在28， 300 rpm培养条件下培养至菌体OD600=6.0， 取上述菌液， 接种 至含500mL BMGY培养基的2000 mL摇瓶中， 每甁接种5 mL， 于28， 250 rpm培养至OD600=12； 室温下2500g离心5 min， 收集菌体， 用1/7原培养体积的BMMY重悬菌体， 向培养基中添加 100%甲醇至终浓度 （质量分数） 为12%， 诱导24小时， 在28 C继续诱导培养96小时， 每24小时 补加甲醇使其质量分数保持在12%， 收集发酵的上清液。 用SDS-PAGE检测甲醇诱导下不同 时间目标蛋白表达情况分析， 电泳结果如图3所示， 图3。
34、为本发明实施例中在甲醇诱导下不 同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图， 目标蛋白如箭头所示。 经诱导14天， 在10 kDa左右均有明显目的蛋白表达， 且通过继续补加甲醇， 在一定时间内， 诱导得到的目 的蛋白含量更高， 具体目的蛋白占上清总蛋白的含量结果如下表2所示。 0021 表2 不同诱导时间得到的目的蛋白占蛋白诱导液上清总蛋白的百分比含量结果。 诱导时间1天2天3天4天 百分比含量 （%）13343025 0022 SDS-PAGE和目标蛋白含量检测结果表明， 经48小时的诱导， 目标蛋白即达到最高 水平的分泌表达， 延长诱导时间会导致目标蛋白的降解。 高水平分泌表达的。
35、转化子， 以100 倍的比例扩大培养。 高水平分泌表达的酵母转化子用BMGY培养基培养至OD600为1015， 离心 收集细胞沉淀， 用BMMY培养基重悬细胞， 加入甲醇并使其质量分数为12%， 诱导48小时， 收 集发酵的上清液。 0023 S4： 为实现目标蛋白的最大分泌表达水平， 目标蛋白的大量表达是在BMMY继续诱 导培养48小时后， 其间每24小时补加甲醇使其质量分数保持在12%； S5： 将所述上清液利用Tris碱调节pH至7.58.0， 以大于或等于15000 g的转速离心10 20分钟， 将获得的上清液加入到经pH 8 Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中， 用10倍 。
36、层析柱体积的pH 8 的含10 mM Tris-HCl和3050 mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析 柱； S6： 用含10 mM Tris-HCl和100400 mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱， 将得到 的洗脱液利用分子量为3 kDa的透析袋于10 mM Tris-HCl缓冲液中透析， 然后超滤浓缩； S7： 将所述超滤浓缩得到的产品在-80 C下速冻， 然后冷冻干燥。 0024 需要说明的是， 将步骤S5洗脱下来的纯化蛋白进行SDS-PAGE分析， 结果如图4所示 (目标蛋白如箭头所示)， 图4为本发明实施例中不同浓度的咪唑洗脱纯化得到的TX4(6-1) 蛋白的SDS-PAGE检测结。
37、果图。 从结果可以看出， 先利用40 mM咪唑的漂洗液可以将大量杂蛋 白去除， 再利用100、 200和 400 mM咪唑的缓冲液洗脱层析柱时均能洗脱得到高纯度的目标 说明书 6/8 页 9 CN 106754943 A 9 蛋白。 0025 本实施例提供的技术方案目的蛋白TX4(6-1)的表达量在酵母分泌表达蜘蛛神经 毒素的报道中达到了很高的水平， 从S3收集发酵的上清液， 经过步骤S5纯化， 从1 L的培养 液中可以纯度在95%以上的TX4(6-1)蛋白45 mg。 0026 将实施例二经过步骤S7得到纯化后的TX4(6-1)蛋白进行生物学活性分析， 具体分 析方法和结果如下： 实验方法1。
38、： 在10 cm 培养皿中将昆虫细胞SF9于昆虫细胞培养基中培养至90%生长密 度， 胰酶消化并将细胞浓度调整至5105 cell/mL， 向 96孔细胞培养板中每孔加入100 l 的昆虫SF9细胞悬液， 培养过夜后， 向各培养孔分别加入不同终浓度TX4(6-1)蛋白(0、 1、 5、 10、 20 ng/ml ) ， 每个浓度3个平行孔， 将上述细胞于标准条件下培养48小时， 显微镜下测 定细胞的生长成况， 。 0027 同样将HEK293细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基中培养至90%生长密度， 胰酶消 化并将细胞浓度调整至5105 cell/mL， 向 96孔细胞培养板中每孔加入10。
39、0 l的HEK293细 胞悬液， 培养过夜后， 各培养孔分别加入不同终浓度TX4(6-1)蛋白(0、 1、 5、 10、 20 ng/ml ) ， 每个浓度3个平行孔， 将上述细胞于标准条件下培养48小时， 显微镜下测定细胞的生长成 况， 同时设加入PBS的对照实验组。 0028 实验结果1： 本发明实施例中的重组TX4(6-1)蛋白的生物学活性结果示如下表3所 示。 细胞增殖活性测定结果表明， 本发明所采用的方法制备的TX4(6-1) 重组蛋白具有很高 的生物学活性， 并且保持毒害昆虫的专一性， 对人的HEK293细胞在测试浓度内没有毒性。 0029 表3重组TX4(6-1)蛋白生物学活性分。
40、析结果。 0030 实验方法2： 利用PBS将纯化后的TX4(6-1) 蛋白稀释至2 mg/ml， 按1 g/g体重注 说明书 7/8 页 10 CN 106754943 A 10 射5龄东亚飞蝗30只， 同时以注射相同体积PBS的5龄东亚飞蝗作为对照， 观察5龄东亚飞蝗 的中毒死亡症状。 0031 实验结果2： 结果发现， 注射纯化后的TX4(6-1) 蛋白的东亚飞蝗表现出了神经系 统中毒症状， 并在12小时内死亡率达到60%， 注射纯化的TX4(6-1)蛋白的东亚飞蝗立即表现 出强烈的神经毒素中毒症状， 并在24小时内所有蝗虫全部死亡， 而注射相同体积PBS的对照 组蝗虫无一出现中毒症状。。
41、 其中注射纯化的TX4(6-1)蛋白的东亚飞蝗12小时观察到的部分 死亡蝗虫结果如图6所示。 生物学活性检测结果表明， 本发明技术方案制备的重组TX4(6-1) 蛋白具有很强的生物活性。 具体结果如下表3所示： 表4 生物学活性分析结果 （n=3） 。 0032 在本说明书的描述中， 参考术语 “一个实施例” 、“一些实施例” 、“示例” 、“具体示 例” 、 或 “一些示例” 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结构、 材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、。
42、 材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 此外， 在不相互矛盾的情况下， 本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。 0033 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例， 可以理解的是， 上述实施例是示例 性的， 不能理解为对本发明的限制， 本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、 修改、 替换和变型， 而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技 术方案的范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。 说明书 8/8 页 11 CN 106754943 A 11 SEQUEN。
43、CE LISTING 怀化学院 一种蜘蛛神经毒素TX4(6-1)重组蛋白的制备方法 3 4 PatentIn version 3.3 1 165 DNA 人工序列 1 tgtggtgaca tcaacgctgc ttgtaaagaa gactgtgact gttgtggtta cactacagct 60 tgtgactgtt actggtctaa atcttgtaag tgtagagaag ctgctatcgt tatctacact 120 gctcctaaaa agaaattgac atgtcatcac catcaccatc actaa 165 2 54 PRT 人工序列 2 Cys Gly。
44、 Asp Ile Asn Ala Ala Cys Lys Glu Asp Cys Asp Cys Cys Gly 1 5 10 15 Tyr Thr Thr Ala Cys Asp Cys Tyr Trp Ser Lys Ser Cys Lys Cys Arg 20 25 30 Glu Ala Ala Ile Val Ile Tyr Thr Ala Pro Lys Lys Lys Leu Thr Cys 35 40 45 His His His His His His 50 3 27 DNA 人工序列 3 gcggatcctg tggtgacatc aacgctg 27 4 31 DNA 人工序列 4 序列表 1/2 页 12 CN 106754943 A 12 gcaagctttt aacatgtcaa tttcttttta g 31 序列表 2/2 页 13 CN 106754943 A 13 图1 说明书附图 1/3 页 14 CN 106754943 A 14 图2 图3 图4 图5 说明书附图 2/3 页 15 CN 106754943 A 15 图6 说明书附图 3/3 页 16 CN 106754943 A 16 。