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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510077497.1 (22)申请日 2015.02.13 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104673912 A (43)申请公布日 2015.06.03 (73)专利权人 河南农业大学 地址 450002 河南省郑州市文化路95号 (72)发明人 刘小军王丹丹徐春林李转见 王台安蒋瑞瑞闫峰宾康相涛 (74)专利代理机构 郑州天阳专利事务所(普通 合伙) 41113 代理人 聂孟民 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 。
2、15/11(2006.01) 审查员 武雪梅 (54)发明名称 一种用于检测LEPR基因245bp deletion可 变剪接体的引物、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明涉及检测LEPR基因245bpdeletion 可变剪接体的引物以及包含该引物的试剂盒及 检测方法， 解决程序繁琐、 耗时长、 准确率低的问 题， 以待测cDNA为模板， 引物对ACTB为引物， 实时 荧光定量PCR扩增ACTB内参基因， 以引物对P为引 物， 实时荧光定量PCR扩增， 荧光定量PCR扩增的 反应体系由2SYBRPremixExTaqTM、 去RNA 酶的超纯水、 引物P-F或ACTB-F、 引物P-R或。
3、ACTB- R、 cDNA模板构成， 反应方法是预变性、 变性、 退 火、 延伸； 对qPCR实时监测结果进行分析， 用2-CT 相对定量的方法计算， 用SPSSversion20.0进 行差异显著性检验， 本发明准确、 快速、 方便， 适 用性强。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 104673912 B 2017.03.29 CN 104673912 B 1.一种检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： （1） 以待测cDNA为模板， 以引物对ACTB为引物， 实时荧光定量PCR扩增ACTB内参基因， 以 引物对。
4、P为引物， 实时荧光定量PCR扩增鹌鹑的LEPR基因245bp deletion可变剪接体， 所述 的荧光定量PCR扩增的反应体系包括有2SYBRPremix Ex TaqTM 911 L， 去RNA酶的超 纯水78 L， 引物P-F或ACTB-F0.51 L， 引物P-R或ACTB-R0.51 L， cDNA模板0.51.5 L， 其 反应方法是9296预变性46min， 9296变性812s， 5565退火2535 s， 7074延伸 2535s， 3545个循环； 检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物， 是针对鹌鹑LEPR基因mRNA水平 245bp缺失后的部分第。
5、9外显子和第11外显子连接处的序列-TGTGAACGATCGCGAGCAA-设计识 别该可变剪接体的特异性引物P-R； 在第9外显子上设计该可变剪接体的上游引物P-F， 引物 对P只能扩增有245bp缺失的剪接体， 从而避开其他已知或未知LEPR基因可变剪接体的干 扰； 所述的引物对P为： 上游引物， P-F： 5 - TCCCTACCAAGATGCTGAC -3 ； 下游引物， P-R： 5 - TTGCTCGCGATCGTTCACA -3 ； 所述的引物对ACTB为： 上游引物， ACTB-F： 5 - GAGAGAAGATGACACAGAC -3 ； 下游引物， ACTB-R： 5 - 。
6、GTCCATCACAATACCAGTGG -3 ； （2） 对步骤 （1） 的荧光定量PCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析， 采用 2-CT 相对定量的方法计算， 用SPSS version 20.0进行差异显著性检验。 2.根据权利要求1所述的检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的方法， 其特征在 于， 所述的反应体系包括有2SYBRPremix Ex TaqTM 10.0 L， 去RNA酶的超纯水7.4 L， 引物P-F或ACTB-F0.8 L， 引物P-R或ACTB-R0.8 L， cDNA模板1.0 L， 其反应方法是94预变 性5min， 94变性10 s，。
7、 60退火 30 s， 72延伸30s， 40个循环。 3.根据权利要求1所述的检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的方法， 其特征在 于， 所述步骤 （1） 中引物对ACTB的扩增产物长度为116bp， 引物对P的扩增产物长度为161bp。 4.根据权利要求1所述的检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的方法， 其特征在 于， 述步骤 （2） 中采用相对定量方法计算该剪接体的相对表达量=2-CT =2-(CTLEPR-CTACTB)， 为方 便比较结果均乘以1000； 所述的SPSS version 20.0软件差异显著性检验， 采用单因素方差 分析， P0。
8、.01表示差异极显著， 所有结果均以平均值和标准差来表示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104673912 B 2 一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物、 试剂盒及检测方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 特别是一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪 接体的引物， 以及包含该引物的试剂盒及检测方法。 背景技术 0002 瘦素(Leptin)主要是由非鸟类脊椎动物白色脂肪组织分泌的小肽类激素， 与瘦素 受体 （LEPR） 结合发挥其生物学功能。 然而， LEPR的功能研究由于禽内源性Leptin的缺乏而 受到限制。 最近， 。
9、鸟类Leptin基因的成功克隆将鸟类Leptin及LEPR的研究又推向了新的高 潮。 鸟类LEPR基因组织广泛性表达特征已得到证明， 但其多种可变剪接体的鉴别和分离进 展相对缓慢， 这将在一定程度上阻碍了LEPR基因生理功能的研究。 因此利用分子生物手段 鉴别某一剪接体组织表达模式， 进而对其生物学功能的阐明具有推动作用， 意义重大。 0003 可变剪接体是影响蛋白质发挥功能的重要原因之一。 LEPR是一种跨膜受体， 属于I 类细胞因子受体家族， 由胞外区、 跨膜区及胞内区3部分组成。 目前的研究将LEPR的可变剪 接体分为3类， 即： 长型、 短型和可溶型。 在小鼠中已经发现6种LEPR剪接。
10、异构体 （LEPR-a, b, c, d, e, f） ， 其中包括长型 （LEPR-b） 、 短型 （LEPR-a,c,d,f） 和可溶型 （LEPR-e） ， 其功能研 究近年来也取得了一定的进展。 然而， 在鸟类尤其是禽类中仅发现两种LEPR剪接异构体 （长 型和短型） ， 而且检测繁琐、 耗时长、 准确率低， 因此深入探究剪接体的生物功能是亟需解决 的技术问题。 发明内容 0004 针对上述情况， 为客服现有技术之缺陷， 本发明的目的就是提供一种检测LEPR基 因245bp deletion可变剪接体的引物以及包含该引物的试剂盒及检测方法， 可有效解决现 有的检测方法程序繁琐、 耗时长。
11、、 准确率低的问题。 0005 本发明解决的技术方案： 在对鸟类 （如鹌鹑） 的LEPR基因克隆和功能研究的过程中 发现第9外显子和第11外显子之间有一245bp的缺失片段， 这种缺失符合GT-AG剪接模式， 预 测蛋白序列属于可溶型受体， 据此本发明解决的技术方案是 0006 一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物， 包括引物对P和引物 对ACTB， 0007 所述的引物对P为： 0008 上游引物， P-F： 5 - TCCCTACCAAGATGCTGAC -3 ； 0009 下游引物， P-R： 5 - TTGCTCGCGATCGTTCACA -3 ； 00。
12、10 所述的引物对ACTB为： 0011 上游引物， ACTB-F： 5 - GAGAGAAGATGACACAGAC -3 ； 0012 下游引物， ACTB-R： 5 - GTCCATCACAATACCAGTGG -3 。 0013 一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的试剂盒， 所述试剂盒包括引 说明书 1/6 页 3 CN 104673912 B 3 物对P、 引物对ACTB、 2SYBRPremix Ex TaqTM和去RNA酶的超纯水。 0014 一种检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的的方法， 包括以下步骤： 0015 （1） 以待测c。
13、DNA为模板， 以引物对ACTB为引物， 实时荧光定量PCR （简称qPCR， 下同） 扩增ACTB内参基因， 以引物对P为引物实时荧光定量PCR扩增LEPR基因245bp deletion可变 剪接体， 所述的荧光定量PCR扩增的反应体系包括有2SYBRPremix Ex TaqTM 911 L， 去RNA酶的超纯水78 L， 引物P-F或ACTB-F0.51 L， 引物P-R或ACTB-R0.51 L， cDNA模板 0.51.5 L构成， 其反应方法是9296预变性46min， 9296变性812s， 5565退火25 35 s， 7074延伸2535s， 3545个循环； 0016 （。
14、2） 对步骤 （1） 的qPCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析， 采用 2-CT相 对定量的方法计算， 用SPSS version 20.0进行差异显著性检验。 0017 本发明还提供了所述的引物对P和引物对ACTB在检测LEPR基因245bp deletion可 变剪接体中的应用。 0018 本发明还提供了所述的试剂盒在检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体中的 应用。 0019 本发明利用特异性引物将LEPR基因的245bp deletion可变剪接体从该基因的多 种剪接形式中分离出来， 对LEPR基因245bp deletion可变剪接体的表达水平进行定量分 析，。
15、 准确、 快速、 方便， 具有很强的适用性。 附图说明 0020 图1为本发明方法流程示意图； 0021 图2为本发明中组织样的熔解曲线； 0022 图3为本发明中LEPR基因245bp deletion剪接体的相对定量结果图。 具体实施方式 0023 以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。 0024 由图1所示， 本发明在具体实施中是由以下技术方案实现。 0025 一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物， 包括引物对P和引物 对ACTB， 0026 所述的引物对P为： 0027 上游引物， P-F： 5 - TCCCTACCAAGATGCTGAC。
16、 -3 ； 0028 下游引物， P-R： 5 - TTGCTCGCGATCGTTCACA -3 ； 0029 所述的引物对ACTB为： 0030 上游引物， ACTB-F： 5 - GAGAGAAGATGACACAGAC -3 ； 0031 下游引物， ACTB-R： 5 - GTCCATCACAATACCAGTGG -3 。 0032 该引物有效用于制备检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的试剂盒。 0033 一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的试剂盒， 所述试剂盒包括引 物对P、 引物对ACTB、 2SYBRPremix Ex TaqTM和去。
17、RNA酶的超纯水， 该试剂盒有效用于检 测LEPR基因127bp deletion可变剪接体。 0034 一种检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的的方法， 包括以下步骤： 说明书 2/6 页 4 CN 104673912 B 4 0035 （1） 以待测cDNA为模板， 以引物对ACTB为引物， 实时荧光定量PCR （简称qPCR， 下同） 扩增ACTB内参基因， 以引物对P为引物实时荧光定量PCR扩增LEPR基因245bp deletion可变 剪接体， 所述的荧光定量PCR扩增的反应体系包括有2SYBRPremix Ex TaqTM 911 L， 去RNA酶的超纯水78。
18、 L， 引物P-F或ACTB-F0.51 L， 引物P-R或ACTB-R0.51 L， cDNA模板 0.51.5 L构成， 其反应方法是9296预变性46min， 9296变性812s， 5565退火25 35 s， 7074延伸2535s， 3545个循环； 0036 （2） 对步骤 （1） 的qPCR实时监测结果进行扩增曲线和熔解曲线分析， 采用 2-CT相 对定量的方法计算， 用SPSS version 20.0进行差异显著性检验。 0037所述的反应体系包括有2SYBRPremix Ex TaqTM 10.0 L， 去RNA酶的超纯水 7.4 L， 引物P-F或ACTB-F0.8 L。
19、， 引物P-R或ACTB-R0.8 L， cDNA模板1.0 L构成， 其反应方法 是94预变性5min， 94变性10 s， 60退火 30 s， 72延伸30s， 40个循环。 0038 所述步骤 （1） 中引物对ACTB的扩增产物长度为116bp， 引物对P的扩增产物长度为 161bp。 0039 所述步骤 （2） 中采用相对定量方法计算该剪接体的相对表达量=2 -CT =2 -(CTLEPR-CTACTB)， 为方便比较结果均乘以1000； 所述的SPSS version 20.0软件差异显著性检 验， 采用单因素方差分析， P0.01表示差异极显著， 所有结果均以平均值和标准差来表示。
20、。 0040 本发明还提供了所述的引物对P和引物对ACTB在检测LEPR基因245bp deletion可 变剪接体中的应用。 0041 本发明还提供了所述的试剂盒在检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体中的 应用。 0042 本发明经实际实验， 取得了非常满意的技术效果。 以下以鹌鹑为例， 有关实验资料 如下： 0043 本实施例的技术流程示意图如图1所示， 主要包括以下步骤： 0044 本实施例的技术流程示意图如图1所示， 主要包括以下步骤： 0045 （1） 组织样品的采集 0046 购买河南武陟县鹌鹑养殖场4周龄朝鲜龙城黄羽鹌鹑10只， 分别采集组织样如下： 肝脏、 胰。
21、脏、 十二指肠、 骨骼肌、 腹脂、 心脏、 脾脏、 肺脏、 肾脏、 卵巢、 腺胃、 下丘脑和垂体， 液 氮冷冻后放于-80冰箱保存备用。 0047 （2） 组织RNA提取及cDNA合成 0048 组织总RNA的提取采用TaKaRa RNAiso Plus试剂盒， 提取方法参照试剂盒说明书。 总RNA的完整性通过琼脂糖凝胶电泳检测确定； 总RNA浓度通过NanoDrop2000微量紫外分光 光度计测定。 0049 采用PrimeScriptTM RT Rragent kit with gDNA Eraser (TaKaRa, Dalian, China)试剂盒将RNA反转录成cDNA。 0050。
22、 （3） 引物设计 0051 根据我们在NCBI公布的鹌鹑LEPR基因245bp deletion可变剪接体序列 （GenBank Accession No. KM066117） 设计引物对P； 根据NCBI公布的鸡、 火鸡和鸭的ACTB基因序列 （GenBank Accession No. NM_205518.1， XM_003210591.1， EF667345.1） 比对后设计引物 对ACTB。 说明书 3/6 页 5 CN 104673912 B 5 0052 引物对P为： 0053 上游引物， P-F： 5 - TCCCTACCAAGATGCTGAC -3 ； 0054 下游引物， 。
23、P-R： 5 - TTGCTCGCGATCGTTCACA -3 ； 0055 引物对ACTB为： 0056 上游引物， ACTB-F： 5 - GAGAGAAGATGACACAGAC -3 ； 0057 下游引物， ACTB-R： 5 - GTCCATCACAATACCAGTGG -3 。 0058 （4） 荧光定量PCR扩增 0059 荧光定量PCR反应体系采用混合加样法， 即根据每一个反应体系所需的各种组分 的数量和1次反应所需的PCR反应的个数， 算出各种反应组分的总量， 加入到1个去RNA酶的 1.5 mL离心管中， 充分混匀后瞬时离心， 再分装到荧光定量PCR专用的8联管中， 然后分。
24、别加 入模板cDNA， 再瞬时离心后进行荧光定量PCR扩增， 整个操作过程尽量避光； 荧光定量PCR反 应体系见表1。 反应程序为： 95预变性5min； 95变性10s， 60退火30s， 72延伸30s， 40 个循环。 0060 表1 荧光定量PCR反应体系 去RNA超纯水 （ddH2O）7.4 L 2SYBRPremix Ex TaqTM10.0 L 引物P-F/ACTB-F （10 mol/L）0. 8 L 引物P-R/ACTB-R （10 mol/L）0. 8 L 待测鹌鹑组织的cDNA （800 ng/ L）1.0 L 总体积20.0 L 0061 （5） 荧光定量PCR数据分析。
25、 0062 对荧光定量PCR结果进行LEPR基因245bp deletion可变剪接体及内参基因ACTB熔 解曲线分析， 熔解曲线见图2。 图中各基因熔解曲线峰值单一， 说明扩增产物特异、 无引物二 聚体及其他非特异性扩增， 可以进行后续结果的分析。 根据鹌鹑各组织的CT均值， 采用相对 定量方法计算该剪接体的相对表达量=2-CT =2-(CTLEPR-CTACTB)， 为方便比较结果均乘以1000。 0063 （6） 组织表达谱制图 0064 依据相对定量的计算结果， 运用SPSS version 20.0软件进行差异显著性检验， 并 制作该剪接体的组织表达图谱， 图谱如图3所示。 注： 图。
26、中个体重复数为6， qPCR加样技术重 复为3，“*” 表示差异极显著。 0065 （7） 注意事项 0066 RNA的提取可以按照以上提供的步骤操作， 也可以依据不同厂家的组织RNA提取试 剂盒的要求来提取， 但是要保证RNA的浓度和完整性， 以确保能够满足后续的试验。 0067 上述实验经反复多次， 均取得了相同或相近似的结果， 表面本发明技术方案有效 可靠， 不再一一重述。 0068 本发明中用于检测鹌鹑LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物， 是针对LEPR 基因mRNA水平245bp缺失后的部分第9外显子和第11外显子连接处的序列 0069 （-TGTGAACGAT。
27、CGCGAGCAA-） 设计识别该可变剪接体的特异性引物P-R； 在第9外显 子上设计该可变剪接体的上游引物P-F。 这样引物对P只能扩增有245bp缺失的剪接体， 从而 避开其他已知或未知LEPR基因可变剪接体的干扰。 说明书 4/6 页 6 CN 104673912 B 6 0070 序列表： 0071 PatentIn version 3.5 0072 19 0073 DNA 0074 人工序列 0075 引物P-F 0076 (1).(19) 0077 1 0078 TCCCTACCAAGATGCTGAC 19 0079 19 0080 DNA 0081 人工序列 0082 引物P-R。
28、 0083 (1).(19) 0084 2 0085 TTGCTCGCGATCGTTCACA 19 0086 19 0087 DNA 0088 人工序列 0089 引物ACTB-F 0090 (1).(19) 0091 3 0092 GAGAGAAGATGACACAGAC 19 0093 20 0094 DNA 0095 人工序列 0096 引物ACTB-R 0097 (1).(20) 0098 4 0099 GTCCATCACAATACCAGTGG 20 0100 19 0101 DNA 0102 扩增序列 0103 部分第9外显子和第11外显子连接处的序列 0104 (1).(19) 01。
29、05 5 0106 TGTGAACGATCGCGAGCAA 19。 0107 由上述可以看出， 本发明公开了一种用于检测鹌鹑LEPR基因245bp deletion可变 剪接体的引物、 试剂盒及检测方法， 属于生物技术领域。 本发明针对LEPR基因245bp缺失后 说明书 5/6 页 7 CN 104673912 B 7 的部分第9外显子和第11外显子连接处的序列设计该可变剪接体的特异性引物对P； 用特异 性引物对P和内参引物ACTB进行实时荧光定量PCR扩增； 然后对实时荧光定量PCR结果进行 相对定量分析； 最后根据相对定量结果准确、 快速地分析该缺失型剪接体在鹌鹑中的组织 表达模式。 本。
30、发明的优点在于利用特异性引物将LEPR基因的245bp deletion可变剪接体从 该基因的多种剪接亚型中分离出来单独研究， 为深入研究鹌鹑LEPR基因的功能奠定基础， 且方法简便， 易操作， 具有很强的实用价值。 说明书 6/6 页 8 CN 104673912 B 8 0001 SEQUENCE LISTING 0002 河南农业大学 0003 一种用于检测LEPR基因245bp deletion可变剪接体的引物、 试剂盒及检 测方法 0004 PatentIn version 3.5 0005 19 0006 DNA 0007 人工序列 0008 引物P-F 0009 (1).(19)。
31、 0010 1 0011 TCCCTACCAAGATGCTGAC 19 0012 19 0013 DNA 0014 人工序列 0015 引物P-R 0016 (1).(19) 0017 2 0018 TTGCTCGCGATCGTTCACA 19 0019 19 0020 DNA 0021 人工序列 0022 引物ACTB-F 0023 (1).(19) 0024 3 0025 GAGAGAAGATGACACAGAC 19 0026 20 0027 DNA 0028 人工序列 0029 引物ACTB-R 0030 (1).(20) 0031 4 0032 GTCCATCACAATACCAGTGG 20 0033 19 0034 DNA 0035 扩增序列 0036 部分第9外显子和第11外显子连接处的序列 0037 (1).(19) 序列表 1/2 页 9 CN 104673912 B 9 0038 5 0039 TGTGAACGATCGCGAGCAA 19 序列表 2/2 页 10 CN 104673912 B 10 图1 图2 说明书附图 1/2 页 11 CN 104673912 B 11 图3 说明书附图 2/2 页 12 CN 104673912 B 12 。