一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710102894.9 (22)申请日 2017.02.24 (71)申请人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号 (72)发明人 邵世鹏常蕾孙雨傲孙育杰 (74)专利代理机构 北京万象新悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11360 代理人 张肖琪 (51)Int.Cl. C12N 15/66(2006.01) C12N 15/65(2006.01) C12N 15/85(2006.01) (54)发明名称 一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表 达。

2、的克隆方法及应用 (57)摘要 CRISPR/Cas9系统具有强大的并行能力， 针 对在某些情况下需要同时表达多个sgRNA的需 求， 本发明提供了一种并行表达多个sgRNA的快 速组装方法。 本发明利用分级GoldenGate反应， 开发了不依赖载体的基于聚合酶链式反应的多 轮扩增方法， 可以在一周内实现多达20个sgRNA 的快速连接组装。 本发明新开发的多重sgRNA串 联组装的方法具有省时省力， 灵活， 高效， 多功能 等优点， 可以将2-20个数量不等的sgRNA迅速组 装到一个载体上。 利用并行表达的多个sgRNA靶 向某一段DNA， 可以实现活细胞内非重复序列染 色质位点的标记和。

3、追踪， 单个基因协同激活或抑 制， 多个基因的同时编辑， 多个基因的同时上调 和下调等功能， 可以在基因编辑以及理解染色质 的组织结构和动态变化中有广泛的应用。 权利要求书3页 说明书13页 附图5页 CN 106868031 A 2017.06.20 CN 106868031 A 1.一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法， 其特征在于， 利用 GoldenGate克隆反应， 将多达几十个不同的sgRNA同时串联到同一个表达载体上， 从而实现 并行表达。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 可以使用不依赖载体的基于聚合酶链式反 应(PCR)的多轮扩增。 3.根据权利。

4、要求1和2所述的方法， 一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的不 依赖于载体的克隆方法， 其特征在于， 由以下步骤制备： 先通过PCR扩增出表达小RNA的启动子和sgRNA基础骨架， 将合成的靶向配对引物两条 链退火， 通过第一步Golden Gate反应将启动子， 靶向序列， sgRNA骨架连接起来。 再通过对 反应混合液的直接PCR扩增， 使用接头互补的， 带有Type IIs限制性酶切位点的引物， 获得 大量的带有接头的连接产物。 然后将上步所得产物分组混合， 继续进行第二步GoldenGate 反应进行连接， 对反应混合液再次使用接头互补的， 带有Type IIs限制性酶切位点。

5、的引物 扩增， 最后将扩增好的多个片段混合， 通过第三步Golden Gate反应连入最终的目的载体。 目的载体带有红色荧光蛋白的表达框， 用于指示多sgRNA并行表达载体的转染情况。 不依赖 于载体的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法中多个步骤所使用的Type IIs限制性内切酶 可以是同一种酶， 也可以是不同种酶。 4.根据权利要求1-3所述的方法， 其特征在于， 每一个sgRNA都有自己的表达框， 含有独 立的启动子和终止子， 互相之间无相互干扰。 5.根据权利要求1-3所述的方法， 其特征在于， 所述sgRNA串联数量可根据需要调整。 6.根据权利要求1-3所述的方法， 其特征在于，。

6、 所述sgRNA的分级扩增可以为一轮， 两 轮， 或者多轮， 可根据所要串联的sgRNA需要进行调整。 7.根据权利要求1-3所述的方法， 其特征在于， 利用Type IIs的限制内切酶和连接酶将 多个sgRNA连接进同一个载体。 8.根据前面任一项权利要求所述的方法， 其特征在于， 所述的多级sgRNA串联表达方法 可以针对不同来源的CRISPR系统， 包括但不局限于SP、 NM、 ST1、 SA、 CPF1、 C2C2等。 9.根据前面任一项权利要求所述的方法， 其特征在于， 所述的多级sgRNA串联表达方法 可以针对最原始的sgRNA， 也可以针对插入功能拓展域的修饰的sgRNA， 所插。

7、入的RNA适配子 是MS2或者PP7或者Spinach或者COM或者 N等。 10.根据前面任一项权利要求所述的方法， 其特征在于， 所述的多级sgRNA串联表达方 法可以利用不同的启动子， 包括但不局限于U6、 H1、 7SK等驱动小RNA表达的启动子。 11.权利要求1所述的方法在基因组靶向编辑中的应用。 12.权利要求1所述的方法在基因定点表达调控中的应用。 13.权利要求1所述的方法在染色质位点标记中的应用。 14.如权利要求11所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 可以靶向不同的染色质区域， 利用Cas9造成DNA双链断裂， 利用细胞自身的非同源末端连接。

8、 的修复机制进行易错修复， 以达到对多个靶基因或其他非基因的功能性片段同时敲除的目 的。 15.如权利要求11所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 可以靶向染色质同一区域， 利用Cas9在同一个基因位点造成多处DNA双链断裂， 防止细胞自 权利要求书 1/3 页 2 CN 106868031 A 2 身的非同源末端连接的修复机制造成断点原样再连接， 以达到对同一个基因的高效率敲除 的目的。 16.如权利要求11所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 可以靶向不同的染色质区域， 利用Cas9造成DNA双链断裂， 在共转染同源修复模板的协助。

9、 下， 利用细胞自身的同源重组的修复机制进行精准修复， 以达到对多个靶基因或其他非基 因的功能性片段同时任意修改的目的。 17.如权利要求12所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 可以靶向不同的染色质区域， 利用dCas9融合转录激活蛋白， 以达到对多个靶基因同时转录 上调的目的。 可用于同时上调多个不相关的基因， 也可用于同时上调同一代谢通路中的多 个基因。 18.如权利要求12所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 可以靶向不同的染色质区域， 利用dCas9融合转录抑制蛋白， 以达到对多个靶基因同时转录 下调的目的。 可用于同时下调。

10、多个不相关的基因， 也可用于同时下调同一代谢通路中的多 个基因。 19.如权利要求12所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 可以靶向不同的染色质区域， 利用dCas9融合具有表观遗传学修饰作用的蛋白， 以达到对多 个靶基因同时表观遗传学修饰的目的。 可用于同时修饰多个不相关的基因， 也可用于同时 修饰同一代谢通路中的多个基因。 20.如权利要求12所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 可以靶向相同的染色质区域， 利用dCas9融合转录激活蛋白， 定点招募多个激活蛋白到同一 基因位点， 以达到对一个靶基因高效率转录上调的目的。 21.如。

11、权利要求12所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 可以靶向相同的染色质区域， 利用dCas9融合转录抑制蛋白， 定点招募多个抑制蛋白到同一 基因位点， 以达到对一个靶基因高效率转录下调的目的。 22.如权利要求12所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 可以靶向相同的染色质区域， 利用dCas9融合具有表观遗传学修饰作用的蛋白， 定点招募多 个酶分子到同一基因位点， 以达到对一个靶基因高效率修饰的目的。 23.如权利要求12所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条带不同 适配子修饰的sgRNA,可以靶向不同的染色质区域， 。

12、利用不同适配子结合蛋白融合转录激活 蛋白或转录抑制蛋白， 以达到同时到对一部分靶基因转录上调和对另一部分靶基因转录下 调的目的。 24.如权利要求13所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 全部靶向某一小段的染色质区域的非重复序列， 每条之间间隔大于20碱基， 利用dCas9上连 接荧光蛋白， 实现在一段DNA序列上富集荧光以标记该段DNA的目的。 可以用于观测这段DNA 的在细胞核中的位置以及细胞分裂过程中的动态变化。 25.如权利要求12和24所述的应用， 其特征在于所标记的序列可以为基因的编码区， 也 可为非编码区， 包括启动子、 增强子等调控原件， 长非编码。

13、RNA， 小RNA， 以及尚未注释功能的 DNA区域。 26.如权利要求13所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条sgRNA, 权利要求书 2/3 页 3 CN 106868031 A 3 每一条可以靶向一段重复次数较多的串联重复的染色质区域， 这些区域可以分布在不同的 染色体， 也可以分布在同一条染色体上， 亦可集中分布于某条染色质的小区段， 利用dCas9 上连接荧光蛋白， 实现在每一条sgRNA单独标记一个位点的目的。 可以用于观测所标记的染 色体的在细胞核中的位置以及细胞分裂过程中的动态变化。 27.如权利要求13所述的应用， 其特征在于利用同一个质粒上同时表达的多条s。

14、gRNA, 每条靶向一段短的串联重复序列， 这些串联重复的在基因组上距离相隔较近， 利用dCas9上 连接荧光蛋白， 实现在一段DNA序列上富集荧光以标记该段DNA的目的。 可以用于观测这段 DNA的在细胞核中的位置以及细胞分裂过程中的动态变化。 28.如权利要求13和24-27所述的应用， 可直接在dCas9上连接荧光蛋白， 也可以通过信 号放大装置在dCas9上先做信号富集。 29.如权利要求14和24-28所述的应用， 可使用原始的sgRNA,也可使用进过RNA适配子 插入的改造sgRNA。 30.如权利要求14和24-29所述的应用， 其特征在于， 可以靶向哺乳动物细胞基因组的 DNA。

15、， 也可以是线粒体DNA， 或者外援入侵的病毒基因组和质粒等。 权利要求书 3/3 页 4 CN 106868031 A 4 一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及 应用 0001 The Hierarchical Assembly Method of Multiplexed sgRNA Expression and Its Applications 技术领域 0002 本发明涉及一种分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及其在基因组编 辑， 基因表达调控和染色体标记方面的应用。 属于基因工程领域。 背景技术 0003 哺乳细胞的细胞核是一个高度复杂的自组装结构， 染。

16、色质是其主要成分。 染色质 由DNA、 RNA以及与其作用的蛋白组成， 共同调控转录， DNA复制、 修复和RNA剪接等细胞基础 生命活动。 研究细胞中某些特定的过程由哪些基因控制， 即表型与基因型之间的关系， 需要 能够特异性的干扰某些基因的表达。 这包括基因的永久性失活， 基因表达的瞬时上调或者 下调。 同时很多研究表明染色体及基因的位置信息对基因表达调控有着重要意义， 要研究 清楚基因在细胞核内的空间位置与其功能的关系， 需对细胞内特异的基因位点进行标记以 获得空间信息。 同时还要获得基因表达过程中的基因位置的动态信息， 所以发展活细胞染 色质DNA的荧光标记技术和方法对解决染色体结构和。

17、功能的关系非常重要。 0004 近几年发展的基于可编程的人工核酸酶可以满足上述三种功能的需要。 主要包 括， ZFN(zinc finger nuclease， 锌指核酸酶)， TALE(transcriptional activator like effector， 转录因子样效应物)， CRISPR(cluster regularly interspace short palindromic repeat， 成簇规则间隔的短回文重复)。 ZFN和TALE依靠蛋白功能域实现特异 性靶向， 每个ZFN的功能域对应三个连续的核苷酸， 而每个TALE的功能域对应一个核苷酸。 要实现在哺乳动物细胞基。

18、因组的精确靶向， 需要20个连续的核苷酸， 因此需要将数十个蛋 白功能域组合到一起。 串联重复序列的组装是一个比较复杂繁琐的过程。 每当改变一个靶 向序列需要重新设计一个新的蛋白， 因此， ZFN和TALE通量低， 无法实现大规模并行操作。 而 CRISPR系统的靶向特异性是由RNA的序列决定， 依靠sgRNA(single guide RNA)和DNA的碱 基互补配对实现正确靶向。 每当转换一个靶向位点， 只需要设计一条新的sgRNA即可。 因此 CRISPR系统的通量可以非常高， 甚至可以达到覆盖整个基因组的水平。 0005 使用CRISPR做基因敲除非常快捷有效， 天然的Cas9蛋白具有。

19、RuvC和HNH两个内切 酶功能域， 当提供正确的sgRNA靶向时， 可以造成目标序列的双链DNA断裂， 依赖于细胞的同 源重组和非同源末端连接的修复机制， 切断的DNA可以进行再连接。 依靠非同源末端连接修 复途径容易造成数个碱基的插入和缺失， 因此可以造成编码基因的读码框发生改变。 当提 供两条sgRNA时， 可以实现将这两个sgRNA靶向位点之间的序列删除， 可以用于敲除非编码 序列。 当给细胞提供与断点两端同源的模板时， 依靠细胞同源重组的修复途径， 可以使目标 序列发生替换， 实现一段DNA序列的靶向插入。 0006 利用CRISPR可以实现在不改变细胞的基因组的条件下干扰细胞内基因。

20、的表达。 常 说明书 1/13 页 5 CN 106868031 A 5 见的上调基因表达的CRISPR激活系统(CRISPRa)和下调基因表达的CRISPR抑制系统 (CRISPRi)。 对野生型的Cas9做点突变， 将之改造成只能结合DNA而不切割靶向序列的DNA结 合蛋白dCas9。 在dCas9上融合不同的蛋白， 就可以实现不同的功能。 如连接转录激活蛋白 VP16， VP64， HSF1等就可实现对靶基因的定向激活。 当连接转录抑制蛋白KRAB等就能实现对 把序列的定向抑制。 当连接组蛋白或者DNA修饰蛋白时， 就可以定点改变基因组的表观遗传 学状态。 0007 利用CRISPR也可。

21、以实现在不改变细胞的基因组的条件下对活细胞的染色质位点 进行标记和追踪。 将dCas9融合荧光蛋白， 利用sgRNA的靶向性， 就可以实现在特定染色体位 点富集荧光蛋白实现标记功能。 利用一条靶向重复序列的sgRNA可以实现重复序列的标记， 利用多条靶向不同非重复序列的sgRNA可以实现非重复序列的标记。 0008 虽然CRISPR系统的扩展性好， 可以针对不同的序列设计不同的sgRNA实现基因组 编辑， 基因表达调控， 染色质标记功能， 但是在同一个细胞中并行完成多个序列的同时靶向 功能仍然具有挑战性。 例如， 为了大量获得某种代谢产物， 需要将某个代谢通路中分支途径 的多个酶在同一个细胞中。

22、基因同时敲除， 利用常规的基因敲除办法很难一次完成， 而顺序 敲除费时费力。 现存的CRISPR系统难以并行的主要原因是多条sgRNA导入同一细胞难以实 现。 通过质粒的瞬时转染办法， 很难将多个质粒均匀导入细胞。 传统方法同时导入多个DNA 片段进入细胞有显微注射和病毒感染。 显微注射需要特殊的仪器， 且操作通量低， 对于需要 大量细胞的实验无法使用。 通过病毒感染对操作者的技术要求较高， 同时具有一定的危险 性， 且病毒感染也具有一定程度的随机性和异质性， 无法完全保证所有的DNA会进入同一个 细胞。 0009 有鉴于此， 目前需要开发新的可以实现并行基因组编辑、 基因表达调控和活细胞 兼。

23、容基因位点标记方法。 本发明克服了显微注射通量低和病毒感染难操作等缺点， 发展多 个串联sgRNA并行表达的快速克隆技术。 利用多轮Golden Gate反应， 以实现多个sgRNA的串 联表达。 利用新开发的多级组装办法， 可以将几个至几十个sgRNA迅速串联， sgRNA的数量可 以视需要而定。 而且新的方法操作更加省时省力， 只要一周以内的时间即可完成组装。 综上 所述， 本发明所提供的多个sgRNA串联表达的方法可以用于多基因的同时敲除敲入， 基因表 达并行调控， 包括上调， 下调， 同时上调和下调， 以及重复位点和非重复位点的活细胞基因 标记与追踪。 具有非常广阔的应用前景(图1)。。

24、 发明内容 0010 本发明的技术目的是发展将多个sgRNA串联进同一个质粒的快速克隆方法， 可以 实现将多个sgRNA的表达框同时转染入细胞的目的， 用以解决多个sgRNA表达质粒共同转染 时存在的难以将所有的质粒转入同一细胞的问题。 在具体实施过程中， 可以根据需要灵活 调整所需的sgRNA的数量。 同时在这个多sgRNA串联表达的载体上表达一个荧光蛋白， 就可 以将转染成功的细胞与未转染成功的细胞分开， 经过流式筛选， 最终可以得到完全转入所 有sgRNA的细胞， 可以用于下游的基因编辑， 基因表达调控和基因标记等实验。 0011 本发明公开一种多sgRNA并行表达的快速克隆方法， 其特。

25、征在于， 利用Golden Gate克隆反应， 将多达几十个不同的sgRNA同时串联到同一个表达载体上， 从而实现并行表 达。 说明书 2/13 页 6 CN 106868031 A 6 0012 根据优选的技术方案， 所述sgRNA串联表达克隆方法可以使用不依赖载体的基于 聚合酶链式反应的多轮扩增， 或依赖于载体的多步克隆连接。 不依赖载体的基于聚合酶链 式反应的多轮扩增方法操作简单， 节约时间。 依赖于载体的多步克隆连接方法可以得到不 同程度的中间产物质粒， 有利于效果对比。 0013 本发明公开一种多sgRNA并行表达的方法在基因编辑领域的应用。 利用Cas9和多 个sgRNA在多个靶位。

26、置造成双链断裂， 从而实现同时在同一细胞中对多个位点进行基因编 辑， 可做基因敲除和敲入。 0014 本发明公开一种多sgRNA并行表达的方法在基因表达调控领域的应用。 利用多个 sgRNA将连接蛋白功能域的dCas9导向多个靶位置， 从而实现同时在同一细胞中对多个基因 进行表达上调和下调。 0015 本发明公开一种多sgRNA并行表达的方法在活细胞染色质标记领域的应用。 利用 多个sgRNA将连接荧光蛋白的dCas9导向同一个靶位置， 可以对非重复的染色质序列进行标 记。 当使用每一个sgRNA靶向不同的重复序列的染色质位置， 可以同时对多个染色质位点进 行标记。 对重复和非重复序列的标记可。

27、以用来观察基因位点在细胞核内的位置， 长时间动 态追踪基因位点的运动过程， 在观测基因表达调控， 转录， DNA修复， X染色体失活等重要的 细胞生物学过程中有重要的应用。 0016 本发明所公开的一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的不依赖于载体的 克隆方法， 包括以下步骤： 0017 (1)先通过PCR从表达单个sgRNA的载体(基础sgRNA载体psgRNA2.0或者改造 sgRNA)扩增出表达小RNA的启动子(mU6， hU6， H1， 7SK等)和sgRNA基础骨架或改造骨架。 扩增 启动子的引物的3 端和扩增sgRNA的引物的5 端各带Type IIs限制性酶切位点(Bsm。

28、BI)。 通 过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。 0018 (2)将合成的靶向配对引物两条链退火。 正链5 端所带有的4碱基突出与启动子酶 切后的粘性末端互补， 负链5 端所带有的4碱基突出与sgRNA骨架片段酶切后的粘性末端互 补。 正负链各100 M在10 l反应体系中按照如下步骤进行反应： 952min， 降温速率-5/ min至162min。 0019 (3)通过第一步Golden Gate反应将启动子， 靶向序列， sgRNA骨架连接起来。 0020 (4)通过对上步所得反应混合液的直接进行PCR扩增， 使用接头互补的， 带有Type IIs限制性酶切位点。

29、(BsaI)的引物， 获得大量的带有接头的连接产物。 通过DNA琼脂糖凝胶 电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。 0021 (5)然后将上步所得产物等摩尔量分组混合， 继续进行第二步Golden Gate反应进 行连接。 0022 (6)对反应混合液再次使用接头互补的， 带有Type IIs限制性酶切位点(BpiI)的 引物扩增。 通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段。 0023 (7)最后将扩增好的多个片段混合， 通过第三步Golden Gate反应连入最终的目的 载体。 目的载体带有红色荧光蛋白的表达框， 用于指示多sgRNA并行表达载体的转染情况。 00。

30、24 注： 不依赖于载体的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法中多个步骤所使用的 Type IIs限制性内切酶可以是同一种酶， 也可以是不同种酶。 0025 (8)将上步反应液转化大肠杆菌感受态细胞Stb3。 挑取克隆在30下过夜培养。 提 说明书 3/13 页 7 CN 106868031 A 7 取质粒琼脂糖凝胶电泳， 用原始的质粒作对比， 选择正确插入的质粒。 0026 注： 此步骤必须使用重组酶缺失的Stb3感受态细胞， 并在低温下培养， 防止串联重 复序列sgRNA的丢失。 附图说明 0027 图1分级组装的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法及应用示意图。 0028 图2分级组装的。

31、多个sgRNA串联并行表达的克隆方法。 (A)克隆过程示意图。 第一步 先将合成的靶向引物退火， 与经过PCR扩增的U6启动子和sgRNA骨架经过第一轮的 GoldenGate反应连接起来。 第二步将上述反应的混合液使用U6上游引物和sgRNA的下游引 物扩增， 得到的纯化产物分组混合， 进行第二轮Golden Gate反应。 第三步对上一步的反应 液进行PCR扩增， 得到多个sgRNA串联的中间产物片段。 第四步将上步所得的多个中间产物 与接收载体混合， 进行第三轮Golden Gate反应连接起来， 转化， 挑克隆验证。 (B)第一轮的 GoldenGate反应产物的琼脂糖凝胶电泳图。 (。

32、C)第二轮的Golden Gate反应产物的琼脂糖凝 胶电泳图。 (D)第三轮的Golden Gate反应产物转化大肠杆菌抽取质粒后的琼脂糖凝胶电泳 图。 0029 图3多个sgRNA串联并行表达在基因编辑中的应用。 (A)整合到哺乳动物细胞基因 组中得绿色荧光蛋白sfGFP的切割示意图。 剪刀代表sgRNA的切割位点。 (B)不同的转染条件 下绿色荧光蛋白被切割的细胞的比例。 #1-9的图例见C。 (C)不同的转染条件下绿色荧光蛋 白的强度分布图。 曲线上的编号代表不同的转染条件。 0030 图4多个sgRNA串联并行表达在单个基因协同调控中的应用。 在人细胞内源基因 SOX2的启动子区域设。

33、计20个sgRNA， 使用dCas9-KRAB抑制SOX2的表达。 阴性对照组不做任何 转染。 阳性对照组只转染dCas9-KRAB。 使用内源基因GAPDH做内参量化。 0031 图5多个sgRNA串联并行表达在多个基因同时表达调控中的应用。 从人的基因组中 随机挑取20个基因， 每个基因设计一条sgRNA。 所有的基因的表达量都用内源基因GAPDH做 内参量化。 0032 图6多个sgRNA串联并行表达在多个基因同时激活和抑制中的应用。 (A)10个基因 激活， 10个基因抑制示意图。 利用基于改造的sgRNA可以在同一个细胞中实现对一部分基因 的激活同时实现对另一部分的基因的抑制。 (B。

34、)20个基因的信使RNA表达量。 所有的基因的 表达量都用内源基因GAPDH做内参量化。 0033 图7基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在单个非重复染色质位点(MUC4基 因)标记中的应用。 (A)非重复染色质位点标记示意图。 同一个位点使用20个sgRNA招募20个 dCas9蛋白， 每一个dCas9蛋白上连接多个荧光蛋白进行信号放大。 (B)人类基因组MUC4位点 结构示意图。 针对第一个内含子的非重复区域设计20个sgRNA进行CRISPR标记， 针对第三个 外显子的重复区域设计一条荧光原位杂交的探针， 利用双通道的荧光信号共定位情况判断 标记效果。 (C)CRISPR标记的信号。

35、和荧光原位杂交信号共定位情况。 具体实施方式 0034 本发明公开一种多sgRNA并行表达的快速克隆方法， 其特征在于， 利用Golden Gate克隆反应， 将多达几十个不同的sgRNA同时串联到同一个表达载体上， 从而实现并行表 说明书 4/13 页 8 CN 106868031 A 8 达。 所得的多sgRNA串联表达载体可用于基因组编辑， 基因表达调控， 活细胞染色质标记等 实验。 下面结合具体实施例进行说明。 为了更清楚的阐述本发明的方法内容， 现将本发明所 涉及的产品和方法更进一步的总结如下， 所涉及的实验数据、 步骤或者合成方法等， 属于本 领域的常规技术， 其并不对本专利的保护。

36、范围造成限制。 这些具体的实施例只用于说明本 发明， 并不用于限制本发明的范围。 0035 实施例一： 一种基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达的不依赖于载体的克隆 方法， 以连接20个sgRNA为例， 由以下步骤制备(图2)： 0036 (1)先通过PCR从表达单个sgRNA的载体(基础sgRNA载体psgRNA2.0或者改造 sgRNA)扩增出表达小RNA的启动子(mU6， hU6， H1， 7SK等)和sgRNA基础骨架。 扩增启动子的引 物的3 端和扩增sgRNA的引物的5 端各带Type IIs限制性酶切位点(BsmBI)。 通过DNA琼脂 糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的。

37、DNA片段。 0037 (2)将合成的靶向配对引物两条链退火。 正链5 端所带有的4碱基突出与启动子酶 切后的粘性末端互补， 负链5 端所带有的4碱基突出与sgRNA骨架片段酶切后的粘性末端互 补。 正负链各100 M在10 l反应体系中按照如下步骤进行反应： 952min， 降温速率-5/ min至162min。 0038 (3)通过第一步Golden Gate反应将启动子， 靶向序列， sgRNA骨架(修饰或未修饰) 连接起来。 0039 反应体系如下： 0040 0041 反应条件如下： 说明书 5/13 页 9 CN 106868031 A 9 0042 0043 (4)通过对上步所得。

38、反应混合液的直接进行PCR扩增， 使用接头互补的， 带有Type IIs限制性酶切位点(BsaI)的引物(引物序列见附表1)， 获得大量的带有接头的连接产物。 通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化试剂盒回收得到纯净的DNA片段(图2B)。 0044 (5)然后将上步所得产物分组混合， 继续进行第二步Golden Gate反应进行连接， 步骤类似第三步。 反应体系如下： 0045 0046 (6)对反应混合液再次使用接头互补的， 带有Type IIs限制性酶切位点(BpiI)的 引物扩增(引物序列见附表1)。 引物的使用情况见附表2。 通过DNA琼脂糖凝胶电泳和胶纯化 试剂盒回收得到纯净的DNA片段。

39、(图2C)。 0047 (7)最后将扩增好的多个片段混合， 通过第三步Golden Gate反应连入最终的目的 载体。 步骤类似第5步， 不同之处在于使用BpiI限制酶。 目的载体带有红色荧光蛋白的表达 框， 用于指示多sgRNA并行表达载体的转染情况。 0048 注： 不依赖于载体的多个sgRNA串联并行表达的克隆方法中多个步骤所使用的 Type IIs限制性内切酶可以是同一种酶， 也可以是不同种酶。 0049 (8)将上步反应液转化大肠杆菌感受态细胞Stb3。 挑取克隆在30下过夜培养。 提 取质粒琼脂糖凝胶电泳， 用原始的质粒作对比， 选择正确插入的质粒(图2D)。 0050 注： 此步。

40、骤必须使用重组酶缺失的Stb3感受态细胞， 并在低温下培养， 防止串联重 复序列sgRNA的丢失。 0051 实施例二： 基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在基因编辑中的应用， 以切割 说明书 6/13 页 10 CN 106868031 A 10 整合到哺乳动物细胞基因组中得绿色荧光蛋白sfGFP为例进行说明(图3)： 0052 (1)利用sgRNA在线设计工具在sfGFP的基因编码框中寻找可靶向的sgRNA序列， 挑 选打分最高的5个sgRNA(序列见下文附表3)。 0053 (2)按照常规sgRNA克隆方法获得单独的5个sgRNA. 0054 (3)按照上述实施例二中所述方法将5个。

41、sgRNA克隆到同一个载体上。 0055 (4)在稳定表达sfGFP的细胞的六孔板中使用转染试剂chemifect共转染1 g表达 Cas9的质粒px330和1 g单独表达的sgRNA载体或1 g串联表达5个sgRNA的载体。 作为对照， 共转染1 g的px330和1 g的五个单独表达的sgRNA载体的混合物。 0056 (5)转染48小时后， 利用流式细胞仪分析细胞的绿色荧光。 0057 (6)结果表明， 使用5个sgRNA串联表达的实验组GFP阴性的细胞比例要低于5个 sgRNA单独表达的实验组。 同时5个sgRNA串联表达的实验组GFP阴性的细胞比例要低于五个 单独表达的sgRNA载体的。

42、混合物的对照组。 这表明切割一个基因， 多条sgRNA同时工作效果 要好于单条sgRNA。 因为设计的原因， 每一条sgRNA的效率是不同的， 多条sgRNA协同作用能 保证高效率的sgRNA出现的概率增大。 同时单独一条sgRNA在靶位点的切割容易被细胞修复 成为未切割的状态或者发生不移码的突变， 导致敲除的失败。 而多条sgRNA协同作用能大幅 度降低细胞回复突变， 造成靶基因的彻底切割。 共转染多条sgRNA的细胞中GFP阴性的比例 高于5个sgRNA串联表达组， 低于5个sgRNA单独表达组。 这是由于存在转染效率问题， 有一部 分细胞中进入多条sgRNA， 但是并非所有细胞中都进入所。

43、转染的五条sgRNA。 0058 (7)多个sgRNA串联并行表达系统除了可以切割外源的基因， 同理亦可以用于内源 基因的高效编辑， 包括基因敲除与敲进。 0059 (8)本例所用的5个sgRNA串联， 在实际应用中可根据效果使用数量不等的sgRNA。 0060 实施例三： 基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在单个基因协同调控中的应 用， 以使用20个sgRNA下调哺乳动物细胞内源基因SOX2为例进行说明(图4)： 0061 (1)利用sgRNA在线设计工具在SOX2的启动子区域中寻找可靶向的sgRNA序列， 挑 选打分最高的20个sgRNA(序列见下文附表4)。 0062 (2)按照常。

44、规sgRNA克隆方法获得单独的20个sgRNA表达载体以作为对照使用。 0063 (3)按照上述实施例一中所述方法将20个sgRNA克隆到同一个载体上。 0064 (4)在MDA-MB-231细胞的六孔板中使用转染试剂chemifect共转染1 g表达dCas9- KRAB的质粒pHAGE-EF1 -dCas9-KRAB和1 g单独表达的sgRNA载体或1 g串联表达20个sgRNA 的载体。 作为对照， 共转染1 g的20个单独表达的sg RNA载体的混合物。 0065 (5)转染48小时后， 利用荧光定量PCR检测各组SOX2的表达情况。 0066 (6)结果表明， 使用20个sgRNA串。

45、联表达的实验组SOX2基因mRNA的表达量要低于20 个sgRNA单独表达的实验组。 同时20个sgRNA串联表达的实验组SOX2基因mRNA的表达量要低 于20个单独表达的sgRNA载体的混合物的对照组。 这表明下调一个基因， 多条sgRNA同时工 作效果要好于单条sgRNA。 0067 实施例四： 基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在多个基因表达调控中的应 用， 以同时上调或下调哺乳动物细胞基因组20个内源的基因为例进行说明(图5)： 0068 (1)所挑选的20个基因如下： SOX2， ASCL1， MYOD1， IL1RN， NTF3， VPS54， RAB1A， ST3GAL4。

46、， OCT4， NANOG， VEGFA， NEUROD1， TTN， HBG1， RHOXF2， LBR， SMCA4， LMNA， CBX5， RAD21。 说明书 7/13 页 11 CN 106868031 A 11 0069 (2)用sgRNA在线设计工具在每一个基因的启动子区域中寻找可靶向的sgRNA序 列， 挑选打分最高的一个sgRNA(序列见下文附表5)。 0070 (3)按照上述实施例一中所述方法将20个sgRNA克隆到同一个载体上。 0071 (4)在MDA-MB-231细胞的六孔板中使用转染试剂chemifect共转染各1 g表达 dCas9-24XGCN4和ScFV-V。

47、P64的质粒(上调)或者1 g dCas9-KRAB的质粒(下调)和1 g表达20 个串联sgRNA的载体。 0072 (5)转染48小时后， 利用荧光定量PCR检测每一个基因的表达情况。 0073 (6)结果表明， 使用20个sgRNA串联表达可以实现多个基因的同时激活或抑制。 每 一个基因的上调或下调水平不同， 主要受限于每一个sgRNA的效率不同。 0074 实施例五： 基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在多个基因表达调控中的应 用， 以同时上调哺乳动物细胞基因组10个内源的基因， 并下调10个内源的基因为例进行说 明(图6)： 0075 (1)仍然是使用实施例五中所挑选的20个基。

48、因， 分组如下(图6A)： 0076 激活组： SOX2， ASCL1， MYOD1， IL1RN， NTF3， VPS54， RAB1A， ST3GAL4， OCT4， NANOG， 0077 抑制组： VEGFA， NEUROD1， TTN， HBG1， RHOXF2， LBR， SMCA4， LMNA， CBX5， RAD21。 0078 (2)用sgRNA在线设计工具在每一个基因的启动子区域中寻找可靶向的sgRNA序 列， 挑选打分最高的一个sgRNA。 0079 (3)按照上述实施例一中所述方法将20个sgRNA克隆到同一个载体上。 与其他的实 施例不同， 此处使用有适配子插入的修饰。

49、sgRNA骨架。 激活组使用PP7插入的sgRNA骨架， 抑 制组使用MS2插入的sgRNA骨架。 0080 (4)在MDA-MB-231细胞的六孔板中使用转染试剂chemifect共转染各1 g表达 dCas9， tdPCP-VPR， tdMCP-KRAB的质粒和1 g表达20个串联sgRNA的载体。 0081 (5)转染48小时后， 利用荧光定量PCR检测每一个基因的表达情况(图6B)。 0082 (6)结果表明， 使用20个sgRNA串联表达可以实现多个基因的同时激活和抑制。 每 一个基因的上调或下调水平不同， 主要受限于每一个sgRNA的效率不同。 激活组的基因表达 水平全部上升， 抑制组的表达水平全部下降， 这表明激活和抑制之间相互独立， 没有交叉影 响。 0083 实施例六： 基于分级组装的多个sgRNA串联并行表达在单个非重复染色质位点标 记中的应用， 以人的细胞中MUC4基因的非重复部分为例进行说明(图7)： 0084 (1)利用sgRNA在线设计工具在MUC4的的第一个内含子区域中寻找可靶向的sgRNA 序列， 挑选打分最高的20个sgRNA(序列见下文附表6)。 0085 (2)按照上述实施例一中所述方法。