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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611081224.5 (22)申请日 2016.11.30 (71)申请人 湖南大学 地址 410082 湖南省长沙市岳麓区麓山南 路湖南大学环境馆 (72)发明人 代丽花李欣张长曾光明 刘云国吴幼娥田亚灵 (51)Int.Cl. C12N 11/14(2006.01) C12N 11/10(2006.01) C12N 11/08(2006.01) C12N 11/04(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C02F 101/20(2006.01) C0。
2、2F 101/22(2006.01) (54)发明名称 一种营养源固定硫酸盐还原菌小球及其制 备方法与用途 (57)摘要 本发明涉及一种固定化硫酸盐还原菌小球 的制备方法与用途， 该固定化小球以聚乙烯醇和 海藻酸钠为载体， 饱和硼酸氯化钙溶液为交联 剂， 乳酸钠为营养源。 制备的具体步骤为： 先将聚 乙烯醇和海藻酸钠恒温水浴溶解， 然后加入活性 炭、 碳酸钙、 二氧化硅和游离菌液， 用注射器吸取 混合液并逐滴加入到饱和硼酸氯化钙溶液中交 联24h形成小球， 用无菌生理盐水洗净后置于乳 酸钠溶液中24h， 洗净后冷冻干燥得到营养源固 定化硫酸盐还原菌小球。 本发明制备的营养源固 定化硫酸盐还原菌。
3、小球的用途中， 能对湘江沉积 物中Cu、 Zn、 Pb、 Cd四种重金属有良好的去除效 果， 且处理稳定， 浸出率低。 材料便于分离， 可重 复利用， 无二次污染， 具有良好的经济效益和广 泛的应用前景。 权利要求书1页 说明书3页 附图3页 CN 106636057 A 2017.05.10 CN 106636057 A 1.一种固定化硫酸盐还原菌小球的制备方法与用途， 其特征在于， 所述固定化小球形 成多孔性结构， 菌胶团负载在孔壁上。 2.一种如权利要求1所述的营养源固定硫酸盐还原菌小球的制备方法， 包括以下步骤： (1)将聚乙烯醇和海藻酸钠加入到100mL的去离子水中搅拌， 然后恒温水。
4、浴加热至90度 并保持30min， 不断搅拌至完全溶解。 (2)将活性炭， 二氧化硅,碳酸钙缓慢的加入上述溶液中并不断搅拌至均匀混合， 待混 合液冷却到室温后置于紫外台灭菌一段时间， 随后将细菌悬浮液加入混合液中并不断搅 拌。 (3)将含有细菌悬浮液的混合液用注射器逐滴地滴入2的饱和硼酸氯化钙溶液中， 于 室温搅拌条件下交联24h。 然后将其浸泡在乳酸钠溶液中， 保持24h。 (4)随后将小球用饱和氯化钠溶液清洗干净至中性， 冷冻干燥得到营养源固定化硫酸 盐还原菌小球。 小球保存在4环境中。 3.根据权利要求2所述的营养源固定化硫酸盐还原菌小球的制备方法， 其特征在于， 所 述固定化小球的制备。
5、中， 用聚乙烯醇和海藻酸钠作为载体， 饱和硼酸氯化钙溶液作为交联 剂， 乳酸钠为内聚营养源， 使得硫酸盐还原菌成功地包埋于小球内部， 有利于营养源的充分 利用， 防止二次污染。 4.一种如权利要求2所述的营养源固定硫酸盐还原菌小球的制备方法， 其特征在于， 所 述固定化小球的制备中， 聚乙烯醇、 海藻酸钠、 饱和硼酸氯化钙以及游离菌液的质量分数分 别为9、 3、 2和20mL。 5.一种如权利要求2所述的营养源固定硫酸盐还原菌小球的制备方法， 其特征在于， 所 述固定化小球的制备中， 加入了活性炭， 比表面积大， 增加了吸附面积， 进而有利于营养源 的吸附。 6.一种如权利要求2所述的营养源固。
6、定硫酸盐还原菌小球的制备方法， 其特征在于， 所 述营养源固定化小球的制备中， 可将小球置于恒温培养箱中， 保持硫酸盐还原菌的活性。 7.一种如权利要求2所述的营养源固定硫酸盐还原菌小球的用途， 其特征在于， 用所述 固定化小球来稳定化处理沉积物中的Cu、 Zn、 Pb、 Cd四种重金属。 8.一种如权利要求2所述的营养源固定硫酸盐还原菌小球的用途， 其特征在于， 用所述 固定化小球能使Cu、 Zn、 Pb、 Cd四种金属形成稳定的硫化物， 且浸出率低。 9.根据权利要求7和8所述的用途， 其特征在于， 所述固定化小球与沉积物用量之比1: 5。 权利要求书 1/1 页 2 CN 1066360。
7、57 A 2 一种营养源固定硫酸盐还原菌小球及其制备方法与用途 技术领域 0001 本发明属于重金属污染处理技术领域， 具体涉及一种利用固定化硫酸盐还原菌内 聚营养源制成的小球稳定化处理铜锌铅铬四种重金属污染的沉积物， 以及小球的可重复利 用性。 背景技术 0002 沉积物中重金属污染对环境环境生态系统和人们的生活有着巨大的危害。 随着密 集的工业化和城市化进程， 这些重金属经食物链进入水生环境后不能被生物降解， 在生物 体内积累， 破坏其代谢活动， 危害人体健康和生态系统平衡。 而且沉积物中的微小颗粒影响 重金属的迁移形成稳定的化合物， 使得金属长期存留， 毒性大污染越来越严重。 因此探寻一。
8、 种彻底而有效处理沉积物重金属污染的技术至关重要。 目前传统的处理重金属污染的方法 有离子交换、 化学沉淀、 电化学法、 吸附和生物处理法等。 但是这些方法处理成本高， 会产生 二次污染， 给后续处理增加了难度。 而微生物处理法， 成本低， 处理高效且无二次污染， 是种 环境友好型的处理方法。 0003 硫酸盐还原菌， 一种厌氧微生物， 能够将SO42-还原为S2-， 进一步与金属离子反应生 成稳定沉淀物。 但是高浓度的金属浓度会抑制硫酸盐还原菌活性尤其是细菌处于游离状态 下使此生物沉淀过程受到限制。 因此固定化技术可有效的解决此问题。 聚乙烯醇和海藻酸 钠是常用的载体， PVA-sodium。
9、 boric法制成的小球已经广泛的应用于金属污染的处理。 利 用固定化微生物技术将微生物固定化后， 对有毒重金属的承受能力及降解能力均有所提 高。 碳源的选择对于硫酸盐还原菌生长具有重要作用， 乳酸钠作为内聚营养源， 能在小球内 被硫酸盐还原菌充分利用可避免有机污染。 通过营养源固定细菌， 不仅提高处理效率， 还可 避免二次污染， 同时还有助于固定化小球颗粒的分离与重复利用。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术存在的成本高、 处理效率低的问题， 开发一种高效、 可重复利用的用于处理沉积物中重金属污染的固定化小球颗粒。 0005 本发明提出的一种营养源固定硫酸盐还原菌小球。
10、的制备方法， 是将硫酸盐还原菌 包埋在聚乙烯醇、 海藻酸钠和氯化钙交联形成的小球内， 并将其浸泡在营养源内， 这样制备 的固定化小球可充分利用营养源， 避免产生有机污染， 具体步骤如下： 0006 (1)将购买的硫酸盐还原菌种进行富集培养， 液体培养基的成分为： 0.5g/L无水硫 酸钠、 1.0g/L氯化铵、 0.1g/L氯化钙、 2g/L硫酸镁、 0.5g/L磷酸氢二钾、 3.5g/L乳酸钠、 1.0g/ L酵母浸膏、 0.5g/L硫酸亚铁铵、 抗坏血酸0.5g/L， 厌氧37条件下密封培养7天， 照此步骤 进行连续扩大培养； 0007 (2)将9g聚乙烯醇和3g海藻酸钠混合加入到100m。
11、L的去离子水中， 置于恒温磁力搅 拌器上搅拌并水浴加热至90直到完全溶解得到混合液A。 0008 (3)当搅拌至A混合液冷却到室温时缓慢加入3g活性炭、 3g二氧化硅、 0.5g碳酸钙， 说明书 1/3 页 3 CN 106636057 A 3 并不断搅拌使之混合均匀得到混合液B； 将混合液B、 玻璃棒、 注射器、 饱和硼酸氯化钙溶液 置于紫外灭菌台上灭菌一段时间。 0009 (4)关掉紫外灯， 将富集培养的硫酸盐还原菌取20mL加入到灭过菌的溶液B中搅拌 均匀得到混合液C， 然后用注射器吸取混合液C逐滴加到2饱和硼酸氯化钙溶液中， 在室温 下搅拌凝固24h； 0010 (5)将凝固好的小球用。
12、无菌生理盐水清洗几次去除硼酸后置于无菌的6g乳酸钠溶 液中放在恒温培养箱中24h， 然后再用无菌生理盐水清洗干净后保存在4冰箱中； 将制好 的小球冷冻干燥脱水后保存。 0011 上述制备方法中， 一切操作均在无菌条件下进行。 0012 利用本发明方法制备得到的营养源固定化硫酸盐还原菌小球可处理沉积物中的 Cu、 Zn、 Pb、 Cd四种金属。 0013 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 0014 1.使用的化学药品聚乙烯醇和海藻酸钠， 是常见的固定化载体， 活性炭比表面积 大， 生产小球的材料价格低廉， 成本低。 0015 2.制作的固定化小球制备工艺及操作简单， 制备快速， 可重复利用，。
13、 且便于回收， 易于 0016 实现工业化生产。 0017 3.乳酸钠的加入使其能被硫酸盐还原菌充分利用， 避免了有机污染。 0018 4.产品无毒， 对环境友好。 0019 5.本发明的固定化小球对重金属的去除率高， 浸出毒性低， 稳定性高。 附图说明 0020 图1是本发明实施例1中制得的营养源固定化硫酸盐还原菌小球的扫描电镜示意 图。 0021 图2是本发明实施例1后营养源固定硫酸盐还原菌小球的能谱分析图。 0022 图3是本发明实施例1中四种重金属的形态分布图。 0023 图4是本发明实施例1中四种金属的浸出毒性效果图。 具体实施方式 0024 以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明。
14、做进一步详细说明。 0025 实施例1： 0026 一种本发明所述的本发明实施例1的营养源固定硫酸盐还原菌小球处理湘江沉积 物中的Cu、 Zn、 Pb、 Cd四种金属， 包括以下步骤： 0027 a、 将采集的经100目筛子过滤后的湘江沉积物样品与固定化小球以5:1的比例加 入到150mL含有细菌培养基的血清瓶中于恒温培养箱中在37环境条件下以150rpm振荡5 天后， 经过滤收集小球， 悬浮液以3000rpm离心20min， 收集沉积物样品并冷冻干燥用于BCR 连续提取； 0028 b、 取上述离心分离后冷冻干燥的样品0.2g置于50mL的聚四氟乙烯离心管中， 加入 20mL0.11mol/。
15、L醋酸恒温振荡16h， 再加入10mL去离子水于3000r/min离心20min， 分离上清 说明书 2/3 页 4 CN 106636057 A 4 液于50mL的容量瓶中稀释至刻度摇匀， 用火焰原子吸收分光光度计检测浓度； 0029 c、 将20mL0.1mol/L的盐酸羟胺加入b中残渣中， 恒温振荡16h， 再加入10mL去离子 水于3000r/min离心20min， 分离上清液于50mL的容量瓶中稀释至刻度摇匀， 用火焰原子吸 收分光光度计检测浓度； 0030 d、 向c中加入10mL8.8mol/L过氧化氢， 室温下静置1h， 水浴加热至85消化1h， 待 蒸至近干再加入6mL8.8。
16、mol/L过氧化氢,重复上述操作冷却至室温后再加入20mL1mol/L醋 酸铵恒温振荡16h， 再加入10mL去离子水于3000r/min离心20min， 分离上清液于50mL的容量 瓶中稀释至刻度摇匀， 用火焰原子吸收分光光度计检测浓度； 0031 e、 往d中残渣加入10mLHCl， 100下加热至样品剩余少量后取下冷却， 加入 5mLHNO3， 5mLHF， 3mLHClO4于180升温1h后冷却， 继续加热至200， 待白烟冒至少量后取下 冷却， 液体呈透明， 倒出至50mL的容量瓶中稀释至刻度摇匀， 用火焰原子吸收分光光度计检 测浓度。 0032 上述制得的营养源固定硫酸盐还原菌小球。
17、外观呈黑色， 将其置于扫描电镜下观 察， 其表面结构如图1所示， 可以看出小球外部密实(a)， 可抵抗重金属毒性侵害， 内部形成 网状结构(b)， 提供便利的物质运输通道， 菌胶团附着在上面， 有大量的杆状菌(c)。 对小球 做能谱分析， 如图2所示， 可以看到用小球处理样品后外表面含有Cu、 Zn、 Pb、 Cd、 S， 可推测反 应后生成了稳定的硫化物。 0033 图3为本实施例中固定化小球处理沉积物样品后Cu、 Zn、 Pb、 Cd的各种形态分布情 况。 由图可知， 与样品本底值相比， 固定化小球处理后四种金属以酸溶态形式存在的含量大 大减少， 可氧化态含量显著提高， 结果表明固定化小球的使用使得沉积物中四种重金属以 更加稳定化的形态存在， 对环境危害减小。 0034 图4为本实施例中固定化小球处理沉积物样品后效果的稳定性情况。 经计算， Cu、 Zn、 Pb、 Cd四种金属的去除率分别为76.3,95.6,100和91.2。 处理效果稳定， 浸出浓 度较低。 说明书 3/3 页 5 CN 106636057 A 5 图1 说明书附图 1/3 页 6 CN 106636057 A 6 图2 图3 说明书附图 2/3 页 7 CN 106636057 A 7 图4 说明书附图 3/3 页 8 CN 106636057 A 8 。