技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种牛肉生物型嫩化剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着人们肉食结构的改变和生活水平的不断提高，牛肉越来越受到消费者的青睐，而牛肉的嫩度是影响消费者评定牛肉质量最重要的一个因素，所以肉类嫩化的相关研究逐渐成为人们关注的热点之一。国内外对宰后嫩化的研究比较多，尤其是酶法嫩化，目前运用最多并且取得成果的主要是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶，可降解肌原纤维，从而提高肉的嫩度，但是这类蛋白酶由于受到原料的限制，实际应用因成本问题有一定的困难。所以研制开发具有自主知识产权的微生物种质资源和技术体系显得尤为重要。我们将生物工程技术与我国传统的腌制方法结合起来，研制开发新型食品嫩化剂，为肉类制品的嫩化提供新的方法和途径。必定有良好的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种牛肉生物型嫩化剂及其制备方法和应用，该牛肉生物型嫩化剂用于肉类制品的嫩化效果明显、安全、可控。
为解决上述技术问题，提供了一种牛肉生物型嫩化剂，由解淀粉芽孢杆菌菌株经活化、发酵培养制备得到；所述解淀粉芽孢杆菌菌株为解淀粉芽孢杆菌D7(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为：2016年11月10日，保藏编号为CGMCC No.13250。
做为一个总的技术构思，本发明还提供了上述牛肉生物型嫩化剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将解淀粉芽孢杆菌菌株接种到肉汤培养基中活化得到活化液；
S2、将所述活化液接种到发酵培养基中进行发酵培养得到牛肉生物型嫩化剂。
上述的制备方法，优选的，所述制备方法还包括：将所述牛肉生物型嫩化剂进行低温冷冻干燥，制成活菌粉。
上述的制备方法，优选的，所述低温冷冻干燥的温度是﹣40℃，时间为8h～10h。
上述的制备方法，优选的，所述S1步骤中，所述活化具体为：在37℃下，以220r/min摇床培养12h～14h。
上述的制备方法，优选的，所述发酵培养基的成分包括：10～20g/L的葡萄糖、10～20g/L的酵母浸出汁、1～3g/L的NaCl、2g/L的CaCl、5g/L的磷酸氢二钾、1.25g/L的磷酸二氢钾、0.01g/L的硫酸镁、0.001g/L的硫酸铁；所述发酵培养基的pH为7.0～7.66。
上述的制备方法，优选的，所述S2步骤中，所述活化液的接种量为3％。
上述的制备方法，优选的，所述S2步骤中，所述发酵培养的具体过程为：在30℃～37℃下以220r/min转速摇床培养47h～49.2h。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了上述牛肉生物型嫩化剂或上述制备方法制备得到牛肉生物型嫩化剂在嫩化牛肉中的应用。
上述的应用，优选的，所述应用方法为：在牛肉生物型嫩化剂中加入氯化钠得到混合液，将牛肉浸渍在所述混合液中，30min～110min后取出，浸渍温度为25℃～37℃，所述混合液中氯化钠的浓度为0.01g/mL～0.05g/mL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种牛肉生物型嫩化剂，通过解淀粉芽孢杆菌D7发酵培养得到，该菌株分离自贵州传统豆豉和甜酒曲中，可产生透明圈，这就说明说明此菌株具有产蛋白酶的能力，对牛肉嫩化效果明显，具有较高的食用安全性，有较大的潜力开发成商业化的食品嫩化剂。
(2)本发明提供了牛肉生物型嫩化剂的制备方法，将解淀粉芽孢杆菌D7接种到发酵培养基中进行摇床培养，所采用的发酵培养基可显著提高解淀粉芽孢杆菌D7的活性，进而提高牛肉生物型嫩化剂的嫩化效果。
(3)本发明提供了一种牛肉生物型嫩化剂在牛肉嫩化中的应用，对浸泡牛肉的温度、时间、氯化钠添加量进行考察，以蒸馏水浸泡的牛肉为对比例组，显示在合适的温度、浸泡时间和绿化钠添加量的条件下，对解淀粉芽孢杆菌D7的活性有显著提高，进而提高牛肉生物型嫩化剂的嫩化效果。
解淀粉芽孢杆菌D7(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13250，保藏日期：2016年11月10日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。其中解淀粉芽孢杆菌D7(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13250，保藏日期：2016年11月10日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例1
一种牛肉生物型嫩化剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)从贵州传统豆豉和甜酒曲中分离解淀粉芽孢杆菌。该菌株呈白色，光滑湿润菌落，稍隆起，菌落中间有褶皱，为有芽孢革兰氏阳性杆菌，且周边会产生清晰可见的透明圈。在斜面上呈薄膜状，表面白色。
(2)将菌株用分离培养基进行纯培养，37℃生化培养基箱培养24h，而后将其进行斜面保存。
分离培养基配方：蛋白胨：10g、葡萄糖：1g、NaCl：5g、CaCl：0.1g、L-酪氨酸：0.1g、琼脂：15g、干酪素：5g、蒸馏水：1000ml；pH值：7.2～7.4。
(3)挑取斜面培养基中解淀粉芽孢杆菌菌株，接种到肉汤培养基中，在37℃下，以220r/min摇床培养12h，活化得到活化液。
(4)将活化液按照接种量为3％接种到发酵培养基中，在37℃下以220r/min摇床培养48h，得到牛肉生物型嫩化剂，该牛肉生物型嫩化剂的酶活达到101.26U/g。
发酵培养基配方：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.0。
实施例2
一种牛肉生物型嫩化剂的制备方法，其中发酵培养基配方为：
葡萄糖：10g、酵母浸出汁：15g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.0。
其余步骤与实施例1相同，培养后得到的牛肉生物型嫩化剂的酶活为108.29U/g。
实施例3
一种牛肉生物型嫩化剂的制备方法，其中发酵培养基配方为：
葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.5。
其余步骤与实施例1相同，培养后得到的牛肉生物型嫩化剂的酶活为93.21U/g。
实施例4
一种牛肉生物型嫩化剂的制备方法，其中发酵培养基配方为：
葡萄糖：16.8g、酵母浸出汁：20g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.66。
其余步骤与实施例1相同，培养后得到的牛肉生物型嫩化剂的酶活为111.96U/g。
分别将牛肉浸泡在实施例1～4的牛肉生物型嫩化剂中，并以蒸馏水作为对比，测定牛肉的硬度值，测定结果参见表1。
表1：不同培养基培养得到的牛肉生物型嫩化剂对牛肉硬度值的影响
组别 蒸馏水组 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 硬度 12392.6±651.1 8712.0±143.2 8380.3±186.8 8848.2±700.7 7537.0±339.86
从表1的结果可知：实施例1至4的牛肉生物型嫩化剂可显著降低牛肉的硬度，其中实施例1中牛肉的硬度相对于蒸馏水组下降了29.7％、实施例2下降了32.4％、实施例3下降了28.6％、实施例4下降了38.8％。
实施例5
一种牛肉生物型嫩化剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)挑取实施例1斜面培养基中解淀粉芽孢杆菌菌株，接种到肉汤培养基中，在37℃下，以220r/min摇床培养12h，活化得到活化液。
(2)将活化液按照接种量为3％接种到发酵培养基中得到混合液，取50mL上述混合液于250mL的锥形瓶中(即装液量为50mL)，在31℃下以220r/min摇床培养48h得到牛肉生物型嫩化剂。该牛肉生物型嫩化剂的酶活达到100.72U/g。
发酵培养基配方：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.0。
实施例6
一种牛肉生物型嫩化剂的制备方法，其中步骤(3)的摇床培养条件是：接种量3％、转速220r/min、装液量50mL、时间48h、温度37℃，其余步骤与实施例5一致。培养后得到的牛肉生物型嫩化剂的酶活为88.34U/g。
实施例7
一种牛肉生物型嫩化剂的制备方法，其中步骤(3)的摇床培养条件是：接种量3％、转速220r/min、装液量70mL、时间48h、温度37℃，其余步骤与实施例5一致。培养后得到的牛肉生物型嫩化剂的酶活为89.7U/g。
实施例8
一种牛肉生物型嫩化剂的制备方法，其中步骤(3)的摇床培养条件是：接种量3％、转速220r/min、装液量71.3mL、时间49.2h、温度30.8℃，其余步骤与实施例5一致。培养后得到的牛肉生物型嫩化剂的酶活为125.55U/g。
分别牛肉浸泡在实施例5～8的牛肉生物型嫩化剂中，并以蒸馏水作为对比，测定牛肉的硬度值，测定结果参见表2。
表2：不同培养条件得到的牛肉生物型嫩化剂对牛肉硬度值的影响
组别 蒸馏水组 实施例5 实施例6 实施例7 实施例8 硬度 13209.7±142.9 9058.7±121.6 9501.6±736.4 9091.4±199.5 7299.83±522.1
从表2的结果可知：实施例5至8的牛肉生物型嫩化剂可显著降低牛肉的硬度，其中实施例5中牛肉的硬度相对于蒸馏水组下降了31.4％、实施例6下降了28.1％、实施例7下降了31.2％、实施例8下降了45.9％。
实施例9
一种牛肉生物型嫩化剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)挑取实施例1斜面培养基中解淀粉芽孢杆菌D7菌株，接种到肉汤培养基中，在37℃下，以220r/min摇床培养12h，活化得到活化液。
(2)将活化液按照接种量为3％接种到发酵培养基中得到混合液，在30.8℃下以220r/min摇床培养49h得到牛肉生物型嫩化剂。该牛肉生物型嫩化剂的酶活达到125.55U/g。
发酵培养基配方：葡萄糖：20g、酵母浸出汁：10g、NaCl：2g、CaCl：2g、磷酸氢二钾：5g、磷酸二氢钾：1.25g、硫酸镁：0.01g、硫酸铁：0.001g、蒸馏水：1000mL、pH值：7.0。
考察浸渍时间对牛肉嫩化效果的影响：
将实施例9的牛肉生物型嫩化剂应用于牛肉嫩化，具体步骤为：将牛肉浸渍于牛肉生物型嫩化剂中30min、50min、70min、90min、110min(浸泡过程中温度为27℃)；并以蒸馏水作为空白对照。考察牛肉的硬度。考察结果参见表3。
表3：不同浸泡时间对牛肉硬度的影响
组别 蒸馏水组 30min 50min 硬度 15159.24±476.92a 13212.39±619.1b 9920.63±453.48d 组别 70min 90min 110min 硬度 10872.49±197.98cd 12745.5±622.5bc 13445.28±264.99b
表3中a、b、c、d表示差异显著(p<0.05)。
从表3的结果可知：将牛肉浸泡在牛肉生物型嫩化剂中，当浸泡时间在50min以后，其牛肉的嫩化效果明显，相比于浸泡在蒸馏水中的牛肉，其硬度降低了34.6％。
考察浸渍温度对牛肉嫩化效果的影响：
将实施例9的牛肉生物型嫩化剂应用于牛肉嫩化，具体步骤为：将牛肉分为6份，取5份牛肉分别浸渍于温度为25℃、28℃、31℃、34℃、37℃的牛肉生物型嫩化剂中，并以蒸馏水作为空白对照。于50min后取出，考察牛肉的硬度，考察结果参见表4。
表4：不同浸泡温度对牛肉硬度的影响
组别 蒸馏水组 25℃ 28℃ 硬度 15159.24±476.92a 11382.24±300.32bc 10738.5±915.5c 组别 31℃ 34℃ 37℃ 硬度 11885.3±959.1bc 11579.02±340.6bc 12561.5±270.23b
表4中a、b、c表示同一数列上差异显著(p<0.05)。
从表4的结果可知，将牛肉浸泡在牛肉生物型嫩化剂中，当浸泡温度在28℃时，其牛肉的嫩化效果明显，相比于蒸馏水组的牛肉，其硬度降低了29.2％。
考察氯化钠添加量对牛肉硬度的影响：
将实施例9的牛肉生物型嫩化剂应用于牛肉嫩化，具体步骤为：将牛肉平均分为5份，分别加入1％(W/V)、2％(W/V)、3％(W/V)、4％(W/V)、5％(W/V)的氯化钠，分别将牛肉浸泡于其中，浸泡温度为27℃，浸泡时间为50min，并以蒸馏水作为空白对照。考察牛肉的硬度，考察结果参见表5。
表5：不同氯化钠添加量对牛肉硬度的影响
组别 蒸馏水组 1％ 2％ 硬度 15159.24±476.92a 14503.26±430.42b 12481.89±413.99c 组别 3％ 4％ 5％ 硬度 10179.18±706.0d 12408.56±350.72c 14671.12±125.81b
表5中a、b、c、d表示同一数列上差异显著(p<0.05)。
从表5的结果可知，将牛肉浸泡在牛肉生物型嫩化剂中，当氯化钠的添加量为3％时，其牛肉的嫩度效果明显，相比于蒸馏水组的牛肉，其硬度了32.9％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。