技术领域
本发明属于叶绿体转化同质化程度检测技术领域，尤其涉及一种准确检测叶绿体转化同质化程度的方法。
背景技术
近二三十年来，叶绿体转基因技术发展迅猛，因叶绿体转基因技术相对核转基因技术具有表达量高、定点转化、无基因沉默现象、生物安全性高等优点，在国内外研究应用广泛。但一直以来，叶绿体转基因技术还未超越核转基因技术成为应用最广泛的转基因技术，其限制因素主要有以下几点：一是大多数的植物的叶绿体基因组还未破译；二是转化效率不高且不够稳定；三是同质化难度高。在目前的文献和专利中，还未发现有定量检测叶绿体转化同质化程度的方法。
申请号为201210515873.7的中国专利申请公开了一种生产口服型新型猪圆环病毒疫苗的方法，该专利申请中介绍了PCR检测外源基因在衣藻叶绿体中的同质化程度，引物设计在同源重组后会被替代掉的基因ch1L上，野生型DNA应该P出1.0kb条带，重组成功的DNA应该P出3.7kb的目的条带，经过两轮筛选后，PCR扩增产物中1.0kb的条带较弱，3.7kb的条带非常清晰，以此来说明阳性拷贝占大多数，衣藻叶绿体转化子同质化程度高。该专利中根据条带强弱来判断同质化程度具有一定的局限性，只能定性分析，无法完成定量检测，不能准确得到同质化程度。
1993年，日本Higuchi等人首次采用动态PCR方法和封闭式检测方法对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR技术的概念，当时因耗资巨大及检测不准确，该技术未成为当时的主流实验技术。
1995年美国PE公司成功研制了TaqMan技术，1996年又退出了首台荧光定量PCR检测系统，使用Ct值进行分析准确性高，使得荧光定量PCR广为应用。近年来，荧光定量PCR技术不断完善，因其操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好和污染率低等优点，已经广泛应用于基础科学研究、药物研发、临床诊断、基因检测等各个领域研究当中，但尚未发现荧光定量PCR方法应用到叶绿体转化的同质化程度检测当中。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种准确检测叶绿体转化同质化程度的方法。所述方法能够对目前叶绿体基因组序列已知的所有物种进行叶绿体转化同质化程度的准确检测。
本发明的技术方案如下：一种准确检测叶绿体转化同质化程度的方法，所述方法将导入有外源基因-质体载体的叶片经过培养基培养后得到阳性愈伤组织，选取质粒载体上的基因作为目的基因，选取叶绿体基因组上的基因作为内参基因，设计多对目的基因的引物和多对内参基因引物，进行预实验筛选出适宜的目的基因和内参基因引物，然后提取阳性愈伤组织的全基因组DNA作为模板DNA，再进行荧光定量PCR实验，采用溶解曲线确定有效数据，验证扩增效率，计算得出叶绿体转化同质化百分比计算得出叶绿体转化同质化百分比，从而得到叶绿体转化后的同质化程度。
所述目的基因为质体载体上aadA基因的部分片段，所述叶绿体基因组上的内参基选自烟草叶绿体基因组上的ycf2基因的部分片段。
筛选出的目的基因aadA的引物为目的基因引物1或目的基因引物2，所述目的基因引物1对应目的条带序列1，目的基因引物2对应目的条带序列2；
所述目的基因引物1如下：
前引物RT-aadA-F1：CCTTTTGGAAACTTCGGCTT；
后引物RT-aadA-R1：AAGATAGCCAGATCAATGTCG；
所述目的条带序列1(位于aadA基因上)如下：CCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTT；
所述目的基因引物2如下：
前引物RT-aadA-F2：CCTTTTGGAAACTTCGGCTT；
后引物RT-aadA-R2：AAGATACCTGCAAGAATGTCA；
所述目的条带序列2(位于aadA基因上)如下：CCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTT。
筛选出的内参基因ycf2的引物为内参基因引物1或内参基因引物2，所述内参基因引物1对应内参目的条带序列1，内参基因引物2对应内参目的条带序列2；筛选出的内参基因trnI的引物为内参基因引物3，所述内参引物3对应内参目的条带序列3。
所述内参基因引物1如下：
前引物NC-F1：GTCATTTGATCCAATAGCGTTC；
后引物NC-R1：CTGGTTTATCAAGAATACGCAAG；
所述内参目的1序列(位于ycf2基因上)如下：GTCATTTGATCCAATAGCGTTCCGTTAGATAGGAACAGATTTGATAAATACTGATAACTCTCGGATAGAGTATTAGAACGGAAAGATCCATTAGATAATGAACTGTTGGTTCTAAGCCATCTCTGACGATTAATCAACAATTCGAAGTGCTTTTCTTGCGTATTCTTGATAAACCAG；
所述内参基因的引物2如下：
前引物NC-F2：GTTAGCAGTTTCAGCTCCGTA；
后引物NC-R2：AGTTCCTGGATAACAAGCCTA；
所述内参目的条带序列2(位于ycf2基因上)如下：AGTTCCTGGATAACAAGCCTAAAGGTTTTCTTCTTGATGAGATCGATATTGATGATAGTGACGATATTGATGATAGTGACAATCTTGATGCTAGTGACGATATCGATCGTGACCTTGATACGGAGCTGAAACTGCTAAC；
所述内参基因的引物3如下：
前引物NC-F3：GCTCATCGGCGCCTGACCCT；
后引物NC-R3：GGATCCCACGAGTGAATCGA；
所述内参目的条带序列3(位于trnI基因上)如下：GCTCATCGGCGCCTGACCCTGAGATGTGGATCATCCAAGGCACATTAGCATGGCGTACTCCTCCTGTTCGAACCGGGGTTTGAAACCAAACTCCTCCTCAGGAGGATAGATGGGGCGATTCGGGTGAGATCCAATGTAGATCCAACTTTCGATTCACTCGTGGGATCC。
所述预实验筛选出适宜的引物过程中，使用20～25μL普通PCR反应体系，PCR反应的退火温度为54℃～60℃，PCR反应后进行凝胶电泳，使用2％～3％高浓度胶回收目的条带序列；
所述普通PCR反应体系如下：
荧光定量PCR时溶解曲线为单峰，表明检测数据可靠有效；扩增效率应在98～102％之间，如果内参基因标准曲线的斜率与目的基因的斜率差在0.001～0.02之间，证明内参基因与目的基因扩增效率相近，表明内参基因合适。
荧光定量PCR实验体系是20～25μL，加入0.2～0.5μL的Rox Reference Dye来校正孔与孔之间的误差，提取的全基因组DNA按照1：10、1：100、1：1000、1：10000连续稀释作为模板DNA，每个稀释比做3～4个重复，同时对内参基因和目的基因定量；
所述荧光定量PCR实验体系如下：
所述荧光定量PCR检测过程中PCR反应程序，退火阶段：56～58℃，20～30s；延伸阶段70～72℃，15～30s，循环40次；获得标准曲线下的Ct值数据及溶解曲线后，溶解曲线为单峰表明数据可靠性强，利用△ct法，△ct法公式如下:表达水平＝2-△ct，计算出成功转入目的基因的叶绿体基因拷贝占所有叶绿体基因组拷贝的百分比。
所述阳性愈伤组织提取全基因组DNA过程如下：(1)在超净工作台将愈伤组织切割成小块放入灭菌的1.5ml离心管，然后使用研磨棒在离心管里将样品磨碎；获得的全基因组DNA需要包含尽可能多的叶绿体基因组DNA，来保证检测的叶绿体转化的同质化程度与实际同质化程度误差较小，在实际操作过程中，因样品量较少，不能在研钵中碾磨(损失极大)，又因愈伤组织水份含量较高，样品进行液氮冷却后，在打样机上无法打碎；
(2)磨碎后的样品按照高效植物基因组DNA提取试剂盒(DP350，天根，TIANGEN)的方法提取全基因组DNA，最大限度的保护DNA的完整性，提取的全基因组DNA片段大，纯度高；
(3)提取的全基因组DNA在0.8％～1.2％的凝胶电泳上获得的条带需为单一条带，且片段大小在10k以上，则获得的全基因组DNA作为模板DNA，并测DNA浓度；若获得的条带有拖带现象，则不建议作为模板DNA。
本发明的特点之一：叶绿体转化同质化程度不好检测的第一个原因在于获得样品叶绿体基因组DNA难度高，要想获得纯度极高含杂质少的叶绿体基因组DNA操作繁琐难度极大，且目前没有可靠性强的方法，依靠现有的办法不仅片段杂质多影响实验效果，且失败率高；本发明比对了烟草叶绿体基因组DNA和核基因组DNA，叶绿体基因组DNA特异性较强，在常规PCR反应过程中基本不受影响，即可以无需提取纯叶绿体基因组DNA，只需要提取全基因组DNA，提取的全基因组DNA在0.8％～1.2％的凝胶电泳上获得的条带需为单一条带，且片段大小在10k以上(包含叶绿体组DNA)，则获得的全基因组DNA作为模板DNA，提取的全基因组DNA条带也要避免拖带严重的现象。
本发明的特点之二：本发明的目的基因引物设计在筛选基因aadA上，目前绝大多数的叶绿体转化载体的筛选基因都为aadA基因，故本发明的目的基因引物适用绝大多数的同质化检测，另外叶绿体基因组保守性较强，在大多数物种中都存在相同的基因，内参引物在烟草叶绿体基因组的ycf2基因上，适用含有该基因的物种的同质化检测；另一对内参引物在烟草叶绿体基因组的trnI基因上，这个基因在水稻、衣藻等物种中存在，也适用这些物种的叶绿体转化的同质化检测。
本发明的特点之三：考虑到荧光定量PCR实验还未使用到叶绿体转化同质化程度的检测当中，PCR反应程序不能照搬常规的荧光定量PCR反应程序，导致扩增曲线不够标准，在上机操作过程中，将常规荧光定量PCR两步法优化为三步法，获得可靠性强的数据，通常实验策略为两步法：即退火和延伸均使用58～62℃，时间为30～60s；改进为三步法反应程序：退火56～58℃，20～30s；延伸70～72℃，15～30s，共40个循环，利用△ct法计算出成功转入目的基因的叶绿体基因拷贝占所有叶绿体基因组拷贝的百分比。
所述数据分析计算如下：1)标准曲线验证扩增效率。由收集到的数据，做出回归曲线，如果内参和目的基因的斜率相同，说明扩增效率相同；2)溶解曲线分析。在melting curve一栏观察样品的溶解曲线，只有溶解曲线为单一峰时为有效数据点；(3)目的基因定量分析，△ct法:表达水平＝2-△ct。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明优化了荧光定量的PCR反应程序，设计并检测了特异的目的基因和内参基因及引物，使之能成功运用于叶绿体转化同质化的检测当中，获得准确数据，计算出准确的同质化百分比，拓展了荧光定量PCR技术的使用范围。
本发明提供的检测方法对目前叶绿体基因组序列已知的物种都适用，设计并验证引物方便快捷，实验操作简洁不繁琐，计算方法简单准确，正常情况下3天内即可获得同质化程度数据，是目前叶绿体转化同质化程度检测的最优方法，推广应用潜力巨大。
目前计算方法很多，本发明提供的方法实验稳定性强，保证了扩增曲线稳定，溶解曲线为单峰，计算方法为△ct法，此计算方法计算简单，便于理解，得到的结果准确。
附图说明
图1为LY基因的质体载体p-DK2图谱；
图2为样品全基因组DNA提取跑胶结果；
图3为目的基因引物1退火条件探索，58℃最好，大小符合且无二聚体；
图4为目的基因引物2退火条件探索，58℃最好，大小符合且无二聚体；
图5为内参引物NC-F1/R1退火条件探索，58℃最好，大小符合且无二聚体；
图6为目的基因引物1的扩增曲线；
图7为内参基因引物1扩增曲线；
图8为内参基因trnI引物3扩增曲线；
图9为内参引物NC-F1/R1的标准曲线；
图10为内参引物NC-F3/R3的标准曲线；
图11为目的引物RT-aadA-F1/R1的标准曲线；
图12为目的基因荧光定量的溶解曲线；
图13为内参基因1荧光定量的溶解曲线；
图14为内参基因3荧光定量的溶解曲线；
图15为样品的溶解曲线，有内参基因和目的基因，故有两个单峰，表明数据准确；
图16为内参基因和目的基因的扩增曲线；
图17为含SLG基因的质体载体p-DK4图谱；
图18为SLG阳性愈伤组织提取全基因组DNA跑胶结果；
图19为NC-F4/R4 PCR预实验结果；
图20为引物RT-F5/R5的溶解曲线；
图21为箭头所指样品的扩增曲线；
图22为箭头所指样品的溶解曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
实施例1 将黄色荧光蛋白(LanYFP-mod,以下简称LY)基因转入烟草叶绿体基因组上，使用该方法检测烟草叶绿体黄色荧光蛋白基因同质化程度
步骤(1)获得实验室成功导入黄色荧光蛋白基因到烟草叶绿体基因组中的阳性愈伤组织，目的基因的骨架载体为p-DK2,骨架载体图谱如图1所示，提取阳性愈伤组织全基因组DNA：获得的全基因组DNA需要包含尽可能多的叶绿体基因组DNA，来保证检测的叶绿体转化的同质化程度与实际同质化程度误差较小，在实际操作过程中，因样品量较少，不能在研钵中碾磨(损失极大)，又因愈伤组织水份含量较高，样品进行液氮冷却后，在打样机上无法打碎，故在超净工作台进可能的将愈伤组织切割成小块放入灭菌的1.5ml离心管，然后使用研磨棒在离心管里将样品磨碎，磨碎后的样品按照高效植物基因组DNA提取试剂盒(DP350，天根，TIANGEN)的方法提取全基因组，最大限度的保护DNA的完整性，提取的基因组DNA片段大，纯度高，提取的全基因组在0.8％～1.2％的凝胶电泳上获得的条带需为单一条带，拖带较少，且大小在10k以上，则获得的全基因组DNA可作为模板DNA，并测DNA浓度；若获得的条带有拖带现象，则不建议作为模板DNA。图2中M为1kb maker，样品1,2,3,8,9,16,17,21主条带清晰且拖带较少，适合作为模板DNA；样品4,7,10,11,18,20,22,23虽主带清晰但拖带较多，不建议作为模板DNA；样品5,6,12,13,14,15,19,24主带不清晰且拖带较多，不适合作为模板DNA。
步骤(2)选取目的基因位于骨架载体筛选基因aadA基因上；选取内参基因在烟草叶绿体基因组上，不在同源序列ORF131基因和16SrRNA基因上。采用oligo 7软件设计目的基因和内参基因的引物各4对，送测序公司合成，进行预实验来验证引物的特异性；
PCR预实验验证：目的条带和内参条带近进行扩增时，PCR反应体系(25μL)如表1所示。
表1
PCR反应条件如表2所示。
表2
PCR反应结束后进行凝胶电泳，使用2.5％高浓度胶回收得到目的片段，需保证条带大小正确，无二聚体，则可送测序进一步验证，发现两对引物的特异性较好。
目的基因引物1
RT-aadA-F1：CCTTTTGGAAACTTCGGCTT；
RT-aadA-R1：AAGATAGCCAGATCAATGTCG；
对应目的基因1的目的条带序列1：
CCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTTCGAGCCAGCCACGATCGACATTGATCTGGCTATCTT；
目的基因引物2：
RT-aadA-F2：CCTTTTGGAAACTTCGGCTT；
RT-aadA-R2：AAGATACCTGCAAGAATGTCA；
目的基因引物2对应的目的条带序列2：
CCTTTTGGAAACTTCGGCTTCCCCTGGAGAGAGCGAGATTCTCCGCGCTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGCACGACGACATCATTCCGTGGCGTTATCCAGCTAAGCGCGAACTGCAATTTGGAGAATGGCAGCGCAATGACATTCTTGCAGGTATCTT；
内参基因引物1
NC-F1：GTCATTTGATCCAATAGCGTTC；
NC-R1：CTGGTTTATCAAGAATACGCAAG；
内参基因引物1对应的目的条带序列1：
GTCATTTGATCCAATAGCGTTCCGTTAGATAGGAACAGATTTGATAAATACTGATAACTCTCGGATAGAGTATTAGAACGGAAAGATCCATTAGATAATGAACTGTTGGTTCTAAGCCATCTCTGACGATTAATCAACAATTCGAAGTGCTTTTCTTGCGTATTCTTGATAAACCAG；
内参基因引物2
NC-F2：GTTAGCAGTTTCAGCTCCGTA；
NC-R2：AGTTCCTGGATAACAAGCCTA；
内参基因引物2对应的目的条带序列2：
AGTTCCTGGATAACAAGCCTAAAGGTTTTCTTCTTGATGAGATCGATATTGATGATAGTGACGATATTGATGATAGTGACAATCTTGATGCTAGTGACGATATCGATCGTGACCTTGATACGGAGCTGAAACTGCTAAC；
图3为目的基因引物1退火条件探索，58℃最好，大小符合且无二聚体；图4为目的基因引物2退火条件探索，58℃最好，大小符合且无二聚体；图5为内参基因引物NC-F1/R1和NC-F3/R3退火条件探索，NC-F1/R1在退火温度为58℃最好，大小符合且无二聚体，NC-F3/R3在60℃最好，大小符合且无二聚体。图3和图4中M是DL2000maker,1-6条带对应的退火温度为58℃，7-12条带对应的退火温度为56℃，13-18条带对应的退火温度为54℃，19-24条带对应的退火温度为52℃；图5中，M为DL2000maker，1-12条带是NC-F1/R1，13-24为NC-F3/R3，其中1、2、13、14为54℃；3、4、15和16为56℃；5、6、17和18为58℃；7、8、19和20为60℃；9、10、21、22为62℃；11、12、23、24为64℃。
步骤(3)验证单对引物扩增效率和溶解曲线，保证内参与目的基因扩增效率相同：步骤(1)获得的全基因组DNA按照1：10、1：100、1：1000、1：10000连续稀释作为模板DNA，每个稀释比做4个重复，同时做定量PCR对内参和目的基因定量，定量PCR体系(20μL)如表3所示：
表3
20μL体系加载完毕，离心冰浴，使用一套移液枪，每加一个样换枪头，将样品加载到96孔板，使用Quantstudio 12k Flex荧光定量pcr仪(ABI，美国应用生物系统公司)获得扩增曲线和溶解曲线数据，如图6、图7和图8所示，图6为目的基因引物1的扩增曲线；图7为内参基因引物1的扩增曲线，图8为内参基因trnI引物3的扩增曲线。
扩增效率与标准曲线的斜率有关，图9为内参基因引物1NC-F1/R1的标准曲线，图10为内参引物NC-F3/R3的标准曲线，图11为目的基因引物1RT-aadA-F1/R1的标准曲线。实际过程中扩增效率应在98％-102％之间，斜率应在-0.3至-0.33之间，如果内参基因的斜率与目的基因的斜率接近，证明内参基因与目的基因扩增效率相近，内参合适。
图9和图11以及图10和图11两条标准曲线的斜率相近，证明内参基因ycf2和内参基因trnI的扩增效率的目的基因aadA相近，证明内参基因ycf2和内参基因trnI选取合适。
再看溶解曲线是否为单峰，来判断数据的准确性，目的基因1和内参基因1以及内参基因3的溶解曲线分别如图12、图13和图14所示。
由图12、图13和图14可知，目的基因和内参基因荧光定量的溶解曲线为单峰，表明数据可靠性强，证明内参基因ycf2和内参基因trnI选取合适。
步骤(4)荧光定量PCR实验：将步骤(1)提取好的全基因组DNA按照1:10、1:100、1:1000、1:10000连续稀释作为模板DNA，每个稀释比做4个重复，PCR体系如表3所示，反应条件在上机操作中设置，使用仪器为Quantstudio 12k Flex荧光定量pcr仪(ABI，美国应用生物系统公司)，上机操作步骤如下：(1)向96孔板加样，使用一套移液枪，每加一个样换枪头，保证加样的准确性；(2)每个样品重复4次，记录好每个孔对应的样品；(3)使用封口膜封口，尽量不要触碰96孔板中间的位置；(4)程序设置，“plate setup”主要用于设定板上需要荧光检测的样品位置，“edit”进入设定界面，点选对应有样品的孔，在“protocol setup”中设置PCR反应程序，设置如下：
Step 1:95℃ 30s 1cycle
Step 2:95℃ 15s
58℃ 30s
72℃ 30s
40cycles
Step 3:融解曲线设置使用默认设置即可
熔点曲线的反应程序设置参考：(一般只有一个步骤，随着循环的进行，其退火温度在不断的升高和降低)
(1)在要设置为熔点曲线的地方插入一个循环。
(2)在反应程序文件列表中收集熔点曲线数据步骤输入起始温度(退火温度58℃)。
(3)输入该步骤的保持时间，输入时，如要输入10秒，可以输入“0:10”或“0.10”。
实验结束后，使用格式化的U盘拷取数据，进行分析。
先查看溶解曲线，如图15所示，确认样品数据的准确性，图15为样品的溶解曲线，有内参基因和目的基因，故有两个单峰，表明数据准确。
再看扩增曲线，内参基因和目的基因的扩增曲线如图16所示。
步骤(5)计算：根据数据来计算出样品的同质化百分比，计算方法为△ct法:表达水平＝2-△ct。如表4所示，表4中样品7、8和9为野生型对照，样品2-样品6为黄色荧光基因转化组：
表4
表4中样品2和5为同一样品，样品3和6为同一样品，同质化程度接近，表明结果可靠性强。
实施例2 将绿色荧光素酶(SLG)基因转入烟草叶绿体基因组上，使用该方法检测烟草叶绿体绿色荧光素酶基因在同质化程度
步骤(1)将包含绿色荧光素酶基因SLG的质体载体p-DK4导入到烟草叶绿体基因组中，成功获得阳性愈伤组织，质体载体p-DK4图谱如图17所示，提取阳性愈伤组织的全基因组DNA方法同实施例1，图18为提取的样品全基因组DNA跑胶结果，图18中M为1kb mak er，样品4,6,8,9,10主带较清晰且拖带少，适合作为模板DNA；样品1,2,3,5,7,11主条带不够清晰且拖带较多，不建议作为模板DNA。
步骤(2)选取目的基因位于骨架载体筛选基因aadA基因上；选取内参基因在烟草叶绿体基因组上，不在同源序列ORF131基因和16SrRNA基因上。采用oligo 7软件设计目的基因和内参基因的引物各4对，送测序公司合成，进行预实验来验证引物的特异性，同实施例1同样的两对引物效果最佳，下面列举实验效果一般的引物，内参引物如下：
NC-F4：GGGATATTTCCGAAACTCACAC；
NC-R4：GATTTGTCTAAGCCACTTCGT；
PCR预实验验证引物特异性弱，不适合作为内参引物，图19为引物NC-F4/R4 PCR结果，图19中M为1kb maker，M1为DL2000maker，1～6为1号模板DNA在50～60℃退火条件下结果，7为空白对照，8～13为2号模板DNA在50～60℃退火条件下结果，都是杂带。
列举一对目的引物RT-F5/R5，引物序列如下所示，虽PCR预实验较好，但在荧光定量预实验时，其溶解曲线却不理想，图20为引物RT-F5/R5的溶解曲线，图20中，后一个溶解曲线部分线未形成单峰，数据可靠性不强。
RT-F5：GCCCGTCATACTTGAAGCTA；
RT-R5：TCTCGCCTTTCACGTAGTGGA；
PCR预实验体系同实施例1，结果也较好，同实施例1，最佳退火温度也为58℃。
步骤(3)验证单对引物扩增效率和溶解曲线，同实施例1反应体系及模板DNA稀释比例，内参和目的基因的标准曲线的斜率差也在0.001～0.02之间，在向96孔板加样过程中，一定要严谨，保证每个样品的添加量一致，图21为箭头所指样品的加样偏差较大，导致扩增曲线误差较大，图22为箭头为此样品的溶解曲线误差较大，不能作为数据计算。
步骤(5)计算，同实施例1，计算方法为△ct法:表达水平＝2-△ct。如表5所示为绿色荧光素酶基因在烟草叶绿体基因组中的同质化百分比。
表5
表5中样品2和3表示同一样品，同质化程度接近，结果准确，样品1表示继续筛选一轮后的结果，提高了30％，与预计结果相符，样品11，12为野生型对照。